Hoàn thiện quy trình xét nghiệm đột biến gen JAK2 và CALR. Ứng dụng quy trình xét nghiệm gen JAK2, CALR xác định đột biến gen ở bệnh nhân tăng sinh tủy mạn tính.
Trang 1HOÀN THIỆN QUY TRÌNH XÉT NGHIỆM ĐỘT BIẾN GEN JAK2 & CALR
TRONG BỆNH TĂNG SINH TỦY MẠN TÍNH
Trần Tuấn Anh * , Trần Mai Hồng * , Nguyễn Lê Anh * , Nguyễn Thùy Trang * , Nguyễn Vũ Bảo Anh * ,
Nguyễn Hà Thanh * , Bạch Quốc Khánh * , Dương Quốc Chính *
TÓM TẮT
Mục tiêu: Hoàn thiện quy trình xét nghiệm đột biến gen JAK2 và CALR Ứng dụng quy trình xét nghiệm
gen JAK2, CALR xác định đột biến gen ở bệnh nhân tăng sinh tủy mạn tính
Đối tượng: Tổng số 51 mẫu của bệnh nhân thuộc nhóm tăng sinh tủy mạn tính, âm tính với nhiễm sắc thể
Ph 1, được chẩn đoán và theo dõi điều trị tại Viện Huyết học - Truyền máu Trung ương
Phương pháp: Nghiên cứu tiến cứu kết hợp hồi cứu, mô tả cắt ngang
Kết quả: Hoàn thiện quy trình xét nghiệm đột biến gen JAK2 và CALR gồm: giải trình tự gen JAK2, CALR
bằng phương pháp NGS; xác định đột biến JAK2V617F bằng phương pháp mồi suy biến; đơn giản hóa quy trình xét nghiệm đột biến CALR type 1 và type 2 bằng phương pháp PCR mồi đặc hiệu Ứng dụng quy trình hoàn
thiện trên 51 bệnh nhân tăng sinh tủy mạn tính với kết quả phân tích đột biến: JAK2V617F chiếm 83,3% ở bệnh
nhân đa hồng cầu nguyên phát và 66,7% ở bệnh nhân xơ tủy nguyên phát Với bệnh tăng tiểu cầu tiên phát, đột biến CALR type 1 chiếm 11,4% và CALR type 2 chiếm 5,7% và JAK2V617F chiếm 71,4%
Kết luận: Nghiên cứu đã hoàn thiện quy trình xét nghiệm đột biến gen JAK2V617F bằng phương pháp mồi
suy biến; xây dựng quy trình PCR để phát hiện đột biến CALR type 1, type 2; và quy trình NGS phát hiện đột biến ít gặp Bộ quy trình hoàn thiện đã được ứng dụng trong phân tích đột biến cho 51 bệnh nhân MPNs
Từ khóa: MPNs, CALR, JAK2
ABSTRACT
OPTIMIZATION OF DETECTION PROTOCOLS FOR JAK2 AND CALR MUTATION
IN MYELOPROLIFERATIVE NEOPLASM
Tran Tuan Anh, Tran Mai Hong, Nguyen Le Anh, Nguyen Thuy Trang, Nguyen Vu Bao Anh,
Nguyen Ha Thanh, Bach Quoc Khanh, Duong Quoc Chinh
* Ho Chi Minh City Journal of Medicine * Supplement of Vol 23 – No 6 - 2019: 409 - 415
Objectives: Optimizaion of detection protocols for JAK2 and CALR mutation Then applying these
protocols for Myeloproliferative neoplasm patients
Subjects: 51 Ph 1 negative MPNs patients have been diagnosed and treated in National Institute of
Hematology and Blood Transfusion
Methods: Prospective, retrospective, and cross-sectional study
Results: The protocols for detecting JAK2 and CALR mutation included: JAK2 and CALR gene sequencing
by NGS; detect JAK2V617F by degraded primer PCR; simplify protocol for detecting CALR type 1 and type 2 by specific primer PCR When these protocols were applied for 51 MPNs patients, the results obtained: JAK2V617F 83.3% and 66.7% in polycythaemia vera and primary myelofibrosis respectively; CALR type 1 11.4%, CALR type 2 5.7% and JAK2V617F 71.4% in essential thrombocythemia
Conclusion: The optimizesd detection protocols for JAK2 and CALR mutation are effective and easy to
*Bệnh viện Nhi Đồng 1 **Đại Học Y Dược TP Hồ Chí Minh* Viện Huyết học -Truyền máu TW
Tác giả liên lạc: TS Dương Quốc Chính ĐT: 0962168505 Email: chinh.duong@nihbt.org.vn
Trang 2apply in any molecular diagnostic laboratory and the analysis results of 51 MPNs patients confirmed the
effectiveness of the methods
Key words: MPNs, CALR, JAK2
ĐẶT VẤN ĐỀ
Tăng sinh tủy mạn tính (Myeloproliferative
neoplasm – MPNs) là nhóm bệnh lý đơn dòng
của tế bào gốc tạo máu Bệnh gây nên do sự tăng
sinh không kiểm soát của các tế bào gốc sinh
máu trong tủy xương, tiến triển mạn tính do liên
quan đến khả năng biệt hóa đến giai đoạn
trưởng thành của tế bào dẫn tới tăng sinh các tế
bào trưởng thành ở máu ngoại vi(5)
Bệnh được đặc trưng bởi sự xuất hiện của
các đột biến trên gen JAK2, CALR hoặc MPL Đột
biến trên những gen này là đặc trưng quan trọng
được sử dụng cho chẩn đoán, tiên lượng và lựa
chọn phương thức điều trị bệnh
Kể từ những công bố đầu tiên về đột biến
trên gen JAK2 (2005)(2) và đột biến gen CALR
(2013)(9), các phòng nghiên cứu và xét nghiệm
sinh học phân tử đã xây dựng nhiều phương
pháp khác nhau để phát hiện đột biến gồm: PCR
đặc hiệu alen, PCR phân tích đoạn, giải trình tự
Sanger, giải trình tự NGS (Next-Generation
Sequencing)(2,9,10,14)
Khi vận dụng những phương pháp trên
trong xét nghiệm thường quy thì ngoài tính
chính xác, độ nhạy và độ đặc hiệu; còn một yếu
tố quan trọng hơn cả là mức độ ổn định của mỗi
quy trình xét nghiệm Bên cạnh đó, cần hiểu rõ
mặt hạn chế và vận dụng điểm mạnh của mỗi
phương pháp xét nghiệm trong những trường
hợp cụ thể; đồng thời việc đơn giản hóa quy
trình kỹ thuật cũng cần được cân nhắc khi xây
dựng một quy trình xét nghiệm thường quy Do
đó, chúng tôi thực hiện đề tài “Hoàn thiện quy
trình xét nghiệm đột biến gen JAK2 và CALR
trong bệnh tăng sinh tủy mạn tính”
Mục tiêu
Hoàn thiện quy trình xét nghiệm đột biến
gen JAK2 và CALR Ứng dụng quy trình xét
nghiệm gen JAK2, CALR xác định đột biến gen ở
bệnh nhân tăng sinh tủy mạn tính
ĐỐI TƯỢNG -PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Đối tượng
Tổng số 51 mẫu của bệnh nhân thuộc nhóm tăng sinh tủy mạn tính, âm tính với nhiễm sắc thể Ph 1, được chẩn đoán và theo dõi điều trị tại Viện Huyết học - Truyền máu Trung ương
Phương pháp
Thiết kế nghiên cứu
Mô tả cắt ngang, tiến cứu kết hợp hồi cứu
Kỹ thuật PCR phát hiện đột biến JAK2V617F, CALR type 1, type 2
Kỹ thuật PCR mồi đặc hiệu sử dụng mồi bổ sung hoàn toàn với alen mang đột biến và chỉ sai khác với alen bình thường tại một vị trí đột biến Với một sai khác duy nhất mồi vẫn có thể bắt cặp vào sợi alen bình thường để tạo nên các đoạn sản phẩm không đặc hiệu
Kỹ thuật PCR mồi suy biến sử dụng mồi suy biến có sửa đổi 1 nucleotide trong phạm vi 5 nucleotide đầu 3’ của mồi Như vậy mồi suy biến sẽ khác alen bình thường tại 2 vị trí: (1) vị trí đột biến và (2) vị trí suy biến có chủ ý nằm trong phạm vi 5 nu đầu tiên đầu 3’ của mồi Thiết kế này nhằm giảm khả năng bắt cặp của mồi với alen bình thường trong khi vẫn khuếch đại thành công alen đột biến; như vậy sẽ giải quyết được tình trạng hình thành các băng sản phẩm không đặc hiệu
KẾT QUẢ
Hoàn thiện quy trình xét nghiệm đột biến gen
JAK2
Kết quả hoàn thiện quy trình xét nghiệm đột biến JAK2V617F
Kết quả điện di trong Hình 1 cho thấy hiện tượng xuất hiện băng sản phẩm không đặc hiệu
trùng với kích thước băng đột biến JAK2V617F ở
tất cả các mẫu Kết quả điện di trong Hình 2 không xuất hiện băng sản phẩm không đặc hiệu
ở tất cả các mẫu mà chỉ xuất hiện băng đột biến
Trang 3và đặc hiệu ở những mẫu dương tính với đột biến JAK2V617F (Hình 1, 2)
Hình 1 Kết quả ứng dụng quy trình phát hiện đột biến JAK2V617F theo phương pháp PCR mồi đặc hiệu
Hình 2 Kết quả hoàn thiện quy trình phát hiện đột biến JAK2V617F bằng phương pháp PCR mồi suy biến
Hoàn thiện quy trình xét nghiệm đột biến gen
CALR
Kết quả giải trình tự gen CALR bằng phương
pháp NGS
Hình 4 là kết quả phân tích dữ liệu NGS
bằng phần mềm IGV: với mẫu 30205 mang mất
đoạn chèn 5 nucleotide “TTGTC” hay CALR
type 2 (Hình 4a) và mẫu 30124 không phát hiện
được bất thường (Hình 4b)
Hình 3 Kết quả phân lập gen CALR exon 1 đến exon
9, có chiều dài ~6 kb
Hình 4 Kết quả phân tích dữ liệu NGS gen CALR bằng phần mềm IGV
Kết quả hoàn thiện quy trình xét nghiệm đột
biến CALR type 1, type 2
Kết quả xét nghiệm đột biến CALR type 1, type 2
bằng phương pháp PCR mồi đặc hiệu
Hình 5 biểu hiện kết quả xác định mất đoạn
gen CALR bằng phương pháp PCR mồi đặc
hiệu: mẫu dương tính đột biến mất đoạn 52
nucleotide hay CALR type 1 xuất hiện băng nội
kiểm 141 bp và băng đặc hiệu đột biến 89 bp
(Hình 5a); mẫu dương tính đột biến mất đoạn 31
nucleotide xuất hiện băng nội kiểm 192 bp và
băng đặc hiệu đột biến 161 bp (Hình 5b)
Hình 6 thể hiện kết quả xác định đột biến chèn 5 nucleotide “TTGTC” hay CALR type 2
bằng phương pháp PCR mồi đặc hiệu, mẫu dương tính xuất hiện băng nội kiểm 265 bp và băng đặc hiệu đột biến 156 bp
Kết quả xác định mất đoạn gen CALR bằng phương pháp giải trình tự Sanger
Kết quả xác nhận giá trị hay tính chính xác
Trang 4của quy trình xét nghiệm mất đoạn CALR type 1
được thể hiện trong Hình 7 và mất đoạn 31
nucleotide được thể hiện trong Hình 8
Kết quả ứng dụng trong phân tích đột biến gen
cho nhóm bệnh nhân tăng sinh tủy mạn tính
Bệnh nhân đa hồng cầu nguyên phát và xơ
tủy nguyên phát chỉ mang đột biến JAK2V617F
với 83,3% ở bệnh nhân đa hồng cầu nguyên phát
và 66,7% ở bệnh nhân xơ tủy nguyên phát Với
bệnh tăng tiểu cầu tiên phát, đột biến CALR type
1 chiếm 11,4% và CALR type 2 chiếm 5,7% và JAK2V617F chiếm 71,4% (Bảng 1)
Hình 5 Kết quả xác định (a) đột biến CALR type 1 và (b) mất đoạn 31 nucleotide
Hình 6 Kết quả xác định đột biến CALR type 2 chèn 5 nucleotide “TTGTC”
Hình 7 Kết quả phân tích vùng đứt gãy đột biến CALR type 1
Hình 8 Kết quả phân tích vùng đứt gãy mất đoạn 31 nucleotide gen CALR
Trang 5Bảng 1 Kết quả thống kê đột biến gen JAK2, CALR trong 51 bệnh nhân MPNs
Đột biến gen
Tổng
Âm tính JAK2 V617F CALR type 1(*) CALR type 2
(*) 5 mẫu đột biến mất đoạn gồm 4 mẫu đột biến CALR type 1 mất 52 nucleotide và một mẫu đột biến hiếm gặp mất đoạn 31
nucleotide
BÀN LUẬN
Tăng sinh tủy mạn tính là nhóm bệnh lý
được đặc trưng bởi sự xuất hiện của đột biến
trên các gen JAK2, CALR hoặc MPL Năm 2005,
bốn nhóm nghiên cứu độc lập về hội chứng tăng
sinh tủy đã lần lượt công bố đột biến trên gen
JAK2 làm biến đổi acid amin valine ở codon 617
thành phenylalanine – được ký hiệu là
JAK2V617F(2,6,11,12) Đây là đột biến điểm xuất hiện
trong hơn 95% trường hợp đa hồng cầu và trong
hơn 60% trường tăng tiểu cầu tiên phát hoặc xơ
tủy nguyên phát Phương pháp được sử dụng
rộng rãi nhất để phát hiện đột biến JAK2V617F là
PCR đặc hiệu alen Trên cơ sở đó, chúng tôi đã
xây dựng quy trình xét nghiệm đột biến
JAK2V617F bằng phương pháp PCR mồi đặc
hiệu Sau hơn 4 năm áp dụng (2012 - 2017), quy
trình này còn tồn tại một vấn đề là nhiều mẻ xét
nghiệm băng sản phẩm đột biến xuất hiện
không đặc hiệu ở cả mẫu âm tính, gây khó khăn
trong phân tích kết quả (Hình 1) Qua tham khảo
tài liệu, chúng tôi nhận thấy hiện tượng xuất
hiện sản phẩm không đặc hiệu thường gặp phải
khi xác định các đột biến điểm bằng PCR mồi
đặc hiệu Nguyên nhân của hiện tượng này là do
mồi đặc hiệu cho alen đột biến chỉ sai khác với
alen bình thường 1 nucleotide, vì vậy mồi đặc
hiệu vẫn có thể bắt cặp alen bình thường với
hiệu suất thấp hơn Nhằm ổn định quy trình xét
nghiệm và giải quyết triệt để hiện tượng sản
phẩm không đặc hiệu, chúng tôi đã thay đổi
thiết kế của mồi đặc hiệu sang mồi suy biến Đối
với mồi suy biến thì ngoài nucleotide sai khác tại
vị trí đột biến còn chủ ý tạo thêm một sai khác nữa so với alen bình thường tại vị trí thứ 3 từ đầu 3’ của mồi Như vậy, với 2 sai khác mồi suy biến sẽ mất khả năng bắt cặp alen bình thường Kết quả áp dụng quy trình hoàn thiện từ năm
2018 đến nay cho thấy hiện tượng sản phẩm không đặc hiệu được giải quyết triệt để và đã giúp ổn định xét nghiệm thường quy đột biến
JAK2V617F (Hình 2)
Trong tăng sinh tủy mạn tính đột biến trên
gen CALR tuy mới được phát hiện gần đây
(2013) nhưng đã cho thấy vai trò quan trọng trong sinh bệnh học của bệnh, với tần suất từ 17% đến 27% ở bệnh nhân tăng tiểu cầu tiên phát hoặc xơ tủy nguyên phát(9) Cho đến nay,
hơn 50 đột biến đã được công bố trên gen CALR exon 9 trong đó 2 thể phổ biến nhất là CALR
type 1 mất 52 nucleotide (chiếm hơn 50%) và
CALR type 2 chèn 5 nucleotide “TTGTC” (chiếm
hơn 30%)(4) Nhờ vào những ưu điểm vượt trội về cỡ mẫu lớn trong một mẻ chạy, đòi hỏi rất ít lượng ADN/ARN đầu vào và độ chính xác cao mà công nghệ giải trình tự NGS đã được ứng dụng rộng rãi trong nhiều bệnh lý huyết học Hơn nữa, NGS còn một thế mạnh là phát hiện được nhiều dạng đột biến như: biến đổi đơn nucleotide (SNV), chèn và mất đoạn nhỏ (ins/dels), biến đổi số lượng bản sao (CNV)(10,14,15) Trên cơ sở đó, chúng tôi đã ứng dụng thành công giải trình tự NGS để phân tích đột biến trên
Trang 6toàn bộ gen CALR (exon 1 đến exon 9) Khi phân
tích dữ liệu NGS chúng tôi đã xác định được
những trường hợp mang đột biến CALR type 2
và các biến thể chèn 5 nucleotide tương tự (Hình
4a) Tuy nhiên không xác định được đột biến
CALR type 1 mà thay vào đó là những mẫu gọi
ra hàng loạt biến thể trong vùng ~50 bp khi phân
tích trên CLC và không phát hiện thấy đột biến
khi phân tích trên IGV (Hình 4b) Như vậy kết
quả trên CLC cho thấy sự bất thường về dữ liệu
sau khi phân tích
Qua tìm hiểu nghiên cứu của Kluk (2016),
chúng tôi biết được hạn chế khi phân tích đột
biến bằng công nghệ NGS của Illumina là không
thể xác định được những mất đoạn lớn hơn 25
bp(10) Đây là lý do mà chúng tôi không thể xác
định đột biến CALR type 1 mất đoạn 52 bp khi
phân tích kết quả NGS Như vậy quy trình xét
nghiệm bằng NGS giúp phân tích hiệu quả đột
biến trên gen CALR ngoại trừ những mất đoạn
>25 bp Một số giải pháp đã được bổ sung để
phát hiện những mất đoạn này gồm: phân tích
đường cong biến tính (HRM), PCR phân tích
đoạn trên máy điện di mao quản, giải trình tự
trực tiếp theo phương pháp Sanger(3,5) Cả 3 giải
pháp trên đều cho phép phát hiện đột biến
CALR type 1 và những mất đoạn khác, tuy nhiên
đây đều là những phương pháp khá phức tạp và
yêu cầu thiết bị đặc thù Với HRM được thực
hiện trên máy realtime PCR và khá nhạy cảm;
PCR phân tích đoạn đòi hỏi máy điện di mao
quản Đối với giải trình tự theo phương pháp
Sanger, việc phân tích kết quả đột biến mất đoạn
tương đối khó khăn do hiện tượng chồng đỉnh
tín hiệu khi giải trực tiếp từ sản phẩm PCR
Phương pháp này đòi hỏi phải tinh sạch đoạn
sản phẩm chứa vùng mất đoạn bằng thôi gel
Trong nghiên cứu này chúng tôi đơn giản hóa
quy trình xét nghiệm đột biến CALR type 1 bằng
phương pháp PCR mồi đặc hiệu Kết quả trong
Hình 5a cho thấy mẫu dương tính đột biến CALR
type 1 thì ngoài băng nội kiểm còn xuất hiện
thêm một băng sản phẩm kích thước 89 bp Tính
chính xác của quy trình xét nghiệm được kiểm
chứng và xác nhận giá trị thông qua việc giải trình tự đoạn sản phẩm đặc hiệu (89 bp) trên hệ
thống AB3500, kết quả phân tích trong Hình 7
Trong nghiên cứu này, chúng tôi cũng xác định một trường hợp mang mất đoạn 31 nucleotide
hiếm gặp (Hình 5b) Mất đoạn này cũng được
chúng tôi xây dựng quy trình xét nghiệm bằng PCR mồi đặc hiệu và xác nhận giá trị bằng phương pháp giải trình tự theo nguyên lý
Sanger (Hình 8) Nhằm đơn giản hóa hơn nữa quy trình xét nghiệm đột biến gen CALR chúng
tôi tiếp tục xây dựng quy trình PCR xác định đặc
hiệu đột biến CALR type 2, kết quả được thể hiện trong Hình 6
Sau khi đã hoàn thiện quy trình xét nghiệm
đột biến gen JAK2 và gen CALR, chúng tôi đã áp
dụng bộ quy trình hoàn thiện cho 51 mẫu bệnh nhân MPNs Kết quả về tỷ lệ đột biến gen cũng tương đồng với nghiên cứu của tác giả Kim, Seon Young và Lin, Yani(8,13) Với đột biến gen
CALR, chúng tôi mới phát hiện trên các bệnh
nhân tăng tiểu cầu tiên phát (11,4% type 1 và 5,7% type 2) mà chưa có trường hợp nào với bệnh lý xơ tủy nguyên phát Điều này có thể do
số lượng bệnh nhân xơ tủy nguyên phát của chúng tôi chưa đủ lớn
KẾT LUẬN
Nghiên cứu đã hoàn thiện quy trình xét nghiệm đột biến gen JAK2V617F bằng phương pháp mồi suy biến; xây dựng quy trình PCR để phát hiện đột biến CALR type 1, type 2; và quy trình NGS phát hiện đột biến ít gặp Bộ quy trình hoàn thiện đã được ứng dụng trong phân tích đột biến cho 51 bệnh nhân MPNs
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1 Arber DA, Orazi A, Hasserjian R, et al (2016) The 2016 revision
to the World Health Organization classification of myeloid
neoplasms and acute leukemia Blood, 127(20):2391–2405
2 Baxter EJ, et al (2005) Acquired mutation of the tyrosine kinase
JAK2 in human myeloproliferative disorders The Lancet,
365(9464):1054–1061
3 Chi J, Manoloukos M, Pierides C, et al (2015) CALReticulin
mutations in myeloproliferative neoplasms and new
methodology for their detection and monitoring Annals of
Hematology, 94(3):399–408
Trang 74 Chi J, Nicolaou KA, et al (2014) CALReticulin gene exon 9
frameshift mutations in patients with thrombocytosis Leukemia,
28(5):1152–1154
5 Doyle LJ, Betz BL, Weigelin HC, et al (2019) Comparison of
real‐time PCR vs PCR with fragment length analysis for the
detection of CALR mutations in suspected myeloproliferative
neoplasms International Journal of Laboratory Hematology,
25(7):1429-1431
6 James C, et al (2005) A unique clonal JAK2 mutation leading to
constitutive signalling causes polycythaemia vera Nature,
434(7037):1144–1148
7 Jones AV, et al (2015) Evaluation of methods to detect CALR
mutations in myeloproliferative neoplasms Leukemia Research,
39(1):82–87
8 Kim SY, Im K, Park SN, Kwon J, Kim JA (2015) CALR, JAK2,
and MPL Mutation Profiles in Patients with Four Different
Subtypes of Myeloproliferative Neoplasms American Journal of
Clinical Pathology, 143(5):635–644
9 Klampfl T., et al (2013) Somatic Mutations of CALReticulin in
Myeloproliferative Neoplasms New England Journal of Medicine,
369(25):2379–2390
10 Kluk MJ, Lindsley RC, Aster JC, et al (2016) Validation and
Implementation of a Custom Next-Generation Sequencing
Clinical Assay for Hematologic Malignancies Journal of
Molecular Diagnostics, 18(4):507–515
11 Kralovics R, Passamonti F, Buser AS, et al (2005) A
Gain-of-Function Mutation of JAK2 in Myeloproliferative Disorders
New England Journal of Medicine, 352(17): 1779–1790
12 Levine RL, Wadleigh M, Cools J, et al (2005) Activating
mutation in the tyrosine kinase JAK2 in polycythemia vera,
essential thrombocythemia, and myeloid metaplasia with
myelofibrosis Cancer Cell, 7(4):387–397
13 Lin Y, et al (2015) The Prevalence of JAK2, MPL and CALR Mutations in Chinese Patients with BCR-ABL1 –Negative Myeloproliferative Neoplasms American Journal of Clinical
Pathology, 144(1):165–171
14 Murugesan G, Guenther-Johnson J, et al (2016) Validation of a
molecular diagnostic assay for CALR exon 9 indels in myeloproliferative neoplasms: identification of coexisting JAK2 and CALR mutations and a novel 9 bp deletion in CALR
International Journal of Laboratory Hematology, 38(3):284–297
15 Palumbo GA, Stella S, Pennisi MS, et al (2019) The Role of New
Technologies in Myeloproliferative Neoplasms, Frontiers in
Oncology, 9: 321
16 Pavlov I, Hadjiev E, Alaikov T, et al (2018) CALReticulin Mutations in Bulgarian MPN Patients Pathology & Oncology
Research, 24(1):171–174
Ngày nhận bài báo: 22/07/2019 Ngày phản biện nhận xét bài báo: 15/08/2019 Ngày bài báo được đăng: 15/10/2019