Cùng với sự phát triển của xã hội, hiện nay số người mắc bệnh ung thư ở Việt Nam cũng như trên thế giới ngày càng gia tăng, trở thành mối đe dọa cộng đồng, kể cả trẻ em. Trong các loại ung thư ở trẻ từ 1 đến 5 tuổi, u nguyên bào thần kinh là loại u ác tính thường gặp, gây tử vong hàng đầu. Việc nghiên cứu tìm kiếm các loại thuốc điều trị căn bệnh này là cần thiết, đặc biệt các thuốc có nguồn gốc thảo dược, ít tác dụng phụ, đang ngày càng được các nhà khoa học quan tâm. Để ngăn chặn sự tăng sinh mất kiểm soát của tế bào ung thư, tác động vào chu kỳ tế bào được xem là mục tiêu của các tác nhân hóa trị liệu. Nhiều nghiên cứu chỉ ra các hoạt chất chiết xuất từ lá dâu, cây dừa cạn có đặc tính kháng ung thư qua cơ chế ức chế chu kỳ tế bào và có tác động ức chế sự tăng sinh các tế bào u nguyên bào thần kinh. Tại Việt Nam nói chung và Sóc Trăng nói riêng có nhiều kinh nghiệm dân gian sử dụng thuốc nam điều trị ung thư cho thấy hiệu quả, trong đó có bài thuốc phối hợp Lá dâu, Dừa cạn. Tuy nhiên, cho đến hiện nay vẫn chưa có nghiên cứu về các cơ sở khoa học chính thức về bài thuốc này. Chính vì vậy, nhằm tìm kiếm bằng chứng khoa học, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đánh giá hiệu quả ức chế chu kỳ tế bào của bài thuốc lá dâu, dừa cạn thu thập tại tỉnh Sóc Trăng trên dòng tế bào u nguyên bào thần kinh.
Trang 1ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG ỨC CHẾ CHU KỲ TẾ BÀO CỦA BÀI THUỐC LÁ DÂU, DỪA CẠN THU THẬP TẠI TỈNH SÓC TRĂNG
TRÊN DÒNG TẾ BÀO U NGUYÊN BÀO THẦN KINH SKN-DZ
Tạ Nguyên Thảo Bình * , Khổng Lê Trường Giang ** , Bùi Chí Bảo * , Trịnh Thị Diệu Thường *
TÓM TẮT
Đặt vấn đề: Cùng với sự phát triển của xã hội, hiện nay số người mắc bệnh ung thư ở Việt Nam cũng như
trên thế giới ngày càng gia tăng, trở thành mối đe dọa cộng đồng, kể cả trẻ em Trong các loại ung thư ở trẻ từ 1 đến 5 tuổi, u nguyên bào thần kinh là loại u ác tính thường gặp, gây tử vong hàng đầu Việc nghiên cứu tìm kiếm các loại thuốc điều trị căn bệnh này là cần thiết, đặc biệt các thuốc có nguồn gốc thảo dược, ít tác dụng phụ, đang ngày càng được các nhà khoa học quan tâm Để ngăn chặn sự tăng sinh mất kiểm soát của tế bào ung thư, tác động vào chu kỳ tế bào được xem là mục tiêu của các tác nhân hóa trị liệu Nhiều nghiên cứu chỉ ra các hoạt chất chiết xuất từ lá dâu, cây dừa cạn có đặc tính kháng ung thư qua cơ chế ức chế chu kỳ tế bào và có tác động ức chế
sự tăng sinh các tế bào u nguyên bào thần kinh Tại Việt Nam nói chung và Sóc Trăng nói riêng có nhiều kinh nghiệm dân gian sử dụng thuốc nam điều trị ung thư cho thấy hiệu quả, trong đó có bài thuốc phối hợp Lá dâu, Dừa cạn Tuy nhiên, cho đến hiện nay vẫn chưa có nghiên cứu về các cơ sở khoa học chính thức về bài thuốc này Chính vì vậy, nhằm tìm kiếm bằng chứng khoa học, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đánh giá hiệu quả ức chế chu
kỳ tế bào của bài thuốc lá dâu, dừa cạn thu thập tại tỉnh Sóc Trăng trên dòng tế bào u nguyên bào thần kinh
Đối tượng và phương pháp nghiên cứu: Đối tượng nghiên cứu là cao chiết nước của bài thuốc Lá dâu và
Dừa cạn thu thập trên địa bàn tỉnh Sóc Trăng Dòng tế bào: Tế bào u nguyên bào thần kinh (SKN-DZ) Phương pháp dòng chảy tế bào
Kết quả: Tỉ lệ tế bào ở pha G2-M của lô xử lý với bài thuốc Lá dâu, Dừa cạn ở nồng độ 621,3 µg/ml là
82,8% lớn hơn so với lô đối chứng là 17,8% (Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê với p <0,05)
Kết luận: Bài thuốc Lá dâu và Dừa cạn thu thập trên địa bàn tỉnh Sóc Trăng có khả năng ức chế chu kỳ tế
bào trên tế bào u nguyên bào thần kinh SKN-DZ
Từ khóa: Lá dâu, Dừa cạn, ức chế chu kỳ tế bào, phương pháp dòng chảy tế bào, kháng ung thư
ABSTRACT
EVALUATING THE CELL CYCLE INHIBITORY EFFECT OF A HERBAL FORMULA CONTAINING MORUS ALBA L AND CANTHARANTHUS ROSEUS (L.) G DON COLLECTED IN SOC TRANG
PROVINCE ON SKN-DZ NEUROBLASTOMA CELL LINE
Ta Nguyen Thao Binh, Khong Le Truong Giang, Bui Chi Bao, Trinh Thi Dieu Thuong
* Ho Chi Minh City Journal of Medicine * Supplement of Vol 23 – No 4 - 2019: 174 - 178
Objectives: Along with the development of society, the number of people suffering from cancer in Vietnam
and in the world is increasing, becoming a community threat, including children Among the types of cancers in children aged 1 to 5 years, neuroblastoma is the most common, fatal malignant tumor The search for drugs to treat this disease is necessary, especially the drugs from herbal medicines, with few side effects, currently attracting the attention of scientists The cell cycle is currently considered the target of novel therapeutic agents Many studies showed the active ingredients extracted from Morus alba L and Cantharanthus roseus (L.) G Don had anti-cancer properties through cell cycle inhibitory mechanism to stop proliferation of neuroblastoma cells In
*Đại học Y dược TP Hồ Chí Minh **Trường ĐH Công nghệ TP Hồ Chí Minh
Tác giả liên lạc: BS Tạ Nguyên Thảo Bình ĐT: 0986892766 Email: thaobinh@ump.edu.vn
Trang 2Vietnam, we have many folk experiences of using herbal medicine in cancer treatment, which showed effectiveness, including the combined remedy containing Morus alba L and Cantharanthus roseus (L.) G Don However, up to now, there has been no scientific evidence to support this treament on neuroblastoma cell Therefore, we conducted this research to evaluate the effectiveness of cell cycle inhibitory effect of the combined herbal formula containing Morus alba L and Cantharanthus roseus (L.) G Don., collected in Soc Trang province
on the SKN-DZ neuroblastoma cell line
Materials and Methods: The object of the study: The aqueous extract of Morus alba L and Cantharanthus roseus (L.) G Don collected in Soc Trang province Cell line: SKN-DZ neuroblastoma cells Method: Flow cytometry
Result: The ratio of cells in G2-M of the group treated with Morus alba L and Cantharanthus roseus
(L.) G Don extract at the concentration of 621.3 µg/ml is 82.8%, much higher than the control group at
17.8% (p <0.05)
Conclusion: Morus alba L and Cantharanthus roseus (L.) G Don remedy collected in Soc Trang province
has the ability to inhibit the cell cycle on SKN-DZ neuroblastoma cells
Key words: Morus alba L., Cantharanthus roseus (L.) G Don., the cell inhibition mechanism, anti-cancer,
flow cytometry method
ĐẶT VẤN ĐỀ
Cùng với sự phát triển của xã hội, hiện nay
số người mắc bệnh ung thư ở Việt Nam cũng
như trên thế giới ngày càng gia tăng, trở thành
mối đe dọa cộng đồng, kể cả trẻ em(2,12) Trong
các loại ung thư ở trẻ nhỏ hơn 5 tuổi, u nguyên
bào thần kinh là loại u rắn ngoại bào phổ biến
nhất Đây là nguyên nhân chính gây tử vong do
ung thư ở trẻ trong độ tuổi từ 1 đến 5, chiếm
13% trong tổng số tử vong do ung thư ở trẻ em(7)
Việc nghiên cứu tìm kiếm các loại thuốc điều trị
căn bệnh này là cần thiết, đặc biệt các thuốc có
nguồn gốc loại thảo dược, ít tác dụng phụ, đang
ngày càng được các nhà khoa học quan tâm
Để ngăn chặn sự tăng sinh mất kiểm soát của
tế bào ung thư, tác động vào chu kỳ tế bào được
xem là mục tiêu của các tác nhân hóa trị liệu
Nhiều nghiên cứu chỉ ra các hoạt chất chiết xuất
từ Lá dâu, Dừa cạn có khả năng ức chế chu kỳ tế
bào, tác động đến tế bào u nguyên bào thần kinh
như: vinblastin, vincristin, vinorelbin(3,4,5,13) Đặc
biệt hoạt chất vincristin từ Dừa cạn được dùng
trong hóa trị liệu nhiều loại ung thư, bao gồm
căn bệnh kể trên(1,9,11,13) Tại Việt Nam nói chung
và Sóc Trăng nói riêng có nhiều kinh nghiệm
dân gian sử dụng thuốc nam điều trị ung thư
cho thấy hiệu quả, một trong số đó là bài thuốc phối hợp Lá dâu, Dừa cạn
Tuy nhiên, cho đến hiện nay vẫn chưa có nghiên cứu chính thức về bài thuốc này Chính
vì vậy, nhằm tìm kiếm bằng chứng khoa học, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đánh giá hiệu quả ức chế chu kỳ tế bào của bài thuốc Lá dâu, Dừa cạn thu thập tại tỉnh Sóc Trăng trên dòng tế
bào u nguyên bào thần kinh
Mục tiêu nghiên cứu
Khảo sát khả năng ức chế chu kỳ tế bào của cao chiết nước bài thuốc Lá dâu và Dừa cạn
ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tượng nghiên cứu
Cao chiết nước của bài thuốc Lá dâu và Dừa
cạn thu thập được trên địa bàn tỉnh Sóc Trăng,
với nồng độ 6213,0µg/ml
Dòng tế bào
Tế bào u nguyên bào thần kinh SKN-DZ được cung cấp từ tiến sĩ Akira Nakagawa, Nhật Bản
Phương pháp nghiên cứu
Thiết kế nghiên cứu
Nghiên cứu thí nghiệm
Trang 3Phương pháp dòng chảy tế bào
Mục đích phương pháp
Phương pháp dòng chảy tế bào là kỹ thuật
có khả năng đo được các đặc tính huỳnh quang
và quang học của một tế bào đơn hoặc các hạt
như vi sinh vật, nhân và nhiễm sắc thể được
chuẩn bị trong dung dịch lỏng khi chúng đi qua
một nguồn sáng Các máy flow cytometry đầu
tiên là một thiết bị đơn thông số
(single-parameter) chỉ được sử dụng để phát hiện kích
thước của tế bào Hiện nay, các thiết bị với độ
phức tạp cao có khả năng phát hiện đồng thời 14
thông số đang được phát triển
Nguyên tắc phương pháp
Phương pháp dòng chảy tế bào phân tích
dựa trên tia laser để đếm số lượng tế bào (hoặc
các thành phần khác như nhân tế bào, nhiễm sắc
thể) dương tính với chất chỉ thị Các thành phần
chính của máy đếm tế bào theo dòng chảy (flow
cytometer) và phân loại tế bào (cell sorter) bao
gồm: hệ dung dịch, hệ thống quang học (ánh
sáng kích thích và bộ thu ánh sáng kích thích),
một thiết bị dò điện tử và một máy tính
Đầu tiên, tiến hành nhuộm các tế bào với
kháng thể gắn huỳnh quang đặc hiệu cho từng
loại chất chỉ thị
Sau đó, tế bào được đưa tới đèn laser trong
một dòng chất lỏng Khi tia laser chiếu vào các tế
bào dương tính với chất chỉ thị sẽ tạo ra các ánh
sáng huỳnh quang và được thu tại thấu kính tại
vị trí thích hợp Sự kết hợp giữa bộ phận tách
chùm tia và các kính lọc sẽ hướng ánh sáng
huỳnh quang tới thiết bị dò điện tử (detector)
một cách chính xác
Cuối cùng các detector phát tín hiệu và
chuyển các tín hiệu thành các thông tin số tỉ lệ
thuận với cường độ ánh sáng và máy tính sẽ
phân tích các thông tin này và biểu thị chúng
dưới dạng biểu đồ gồm các quần thể dương tính
và âm tính với các huỳnh quang tương ứng với
các kháng nguyên cần khảo sát Theo đó, các tế
bào không gắn hoặc gắn rất ít với kháng thể gắn
huỳnh quang đặc hiệu sẽ biểu hiện thành cột âm
tính nằm ở góc trái biểu đồ và quần thể tế bào gắn được nhiều kháng thể đơn dòng sẽ được biểu hiện thành cột dương tính nằm ở góc phải biểu đồ
Quy trình thực hiện
Xử lý mẫu với thuốc
Tế bào sau khi phân lập được cấy trên hai giếng của đĩa 6 giếng với mật độ 1x106 tế bào/giếng Khi tế bào đã ổn định và đủ mật độ (bao phủ 80% bề mặt cấy), tiến hành phân lô và
xử lý thuốc như sau:
- Lô 1 (2x106 tế bào/lô): không xử lý với dịch chiết bài thuốc Lá dâu, Dừa cạn
- Lô 2 (2x106 tế bào/lô): xử lý với dịch chiết bài thuốc Lá dâu, Dừa cạn ở độ pha loãng 1/50 (tương ứng với nồng độ 124,3 µg/ml)
- Lô 3 (2x106 tế bào/lô): xử lý với dịch chiết bài thuốc Lá dâu, Dừa cạn ở độ pha loãng 1/10 (tương ứng với nồng độ thuốc 621,3 µg/ml)
- Lô 4 (2x106 tế bào/lô): xử lý với dịch chiết bài thuốc Lá dâu, Dừa cạn ở độ pha loãng 1/5 (tương ứng với nồng độ thuốc 1242,6 µg/ml) Sau đó ủ các tế bào trong 24 giờ, ở điều kiện
37oC và 5% CO2 Tiếp đến tiến hành cố định tế bào với Ethanol 70% lạnh và nhuộm nhân tế bào (1x105
tế bào) với 100 µl PI (Kit thương mại BD) trong
15 phút trong tối
Phân tích chu kỳ tế bào bằng kỹ thuật dòng chảy tế bào
Các tế bào của mẫu chứng và những mẫu xử
lý thuốc được phân tích dựa trên số lượng nhiễm sắc thể (NST) để xác định chu kỳ tế bào bằng máy đếm dòng chảy tế bào (FACS Canto II- BD)
Tế bào ở pha G1 được xác định có bộ NST là 2n, các tế bào ở pha G2-M có bộ NST là 4n, các tế bào đa bội được xác định dựa trên bộ NST > 4n
Xử lý số liệu
Số liệu được xử lý bằng phần mềm STATA 13.0
Số lượng tế bào trong các pha G1, S, G2-M và
số tế bào đa bội được trình bày dưới dạng tỉ lệ %
Trang 4Sử dụng phép kiểm chi bình phương để so
sánh hai tỉ lệ
Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê với p <0,05
KẾT QUẢ
Hình 1: Kết quả phân tích chu kỳ tế bào khi xử lý với bài thuốc lá dâu, dừa cạn Bảng 1 Tỉ lệ tế bào trong từng pha của các lô thí nghiệm
Kết quả cho thấy, ở lô xử lý với bài thuốc lá
dâu, dừa cạn ở ở nồng độ thuốc 621,3 µg/ml tỉ lệ
tế bào ở pha G2-M (82,8%,) lớn hơn so với lô đối
chứng (17,8%), sự khác biệt có ý nghĩa thống kê
với p <0,05 (Bảng 1)
BÀN LUẬN
Khác với tế bào bình thường, các tế bào ung
thư có đặc điểm là chu kì tế bào không được
kiểm soát cùng với việc giảm sự chết tế bào theo
chu trình (apoptosis)(6) Đây là nguyên nhân
khiến khối u lan rộng Chính vì thế, gây ra bắt
giữ chu kì tế bào hoặc gây apoptosis là hai mục tiêu hướng đến của hầu hết các tác nhân hóa trị liệu Chu kỳ tế bào là một quá trình kiểm soát sự phát triển và tăng sinh liên tục của tế bào Quá trình này được điều chỉnh chặt chẽ bởi các điểm kiểm soát nghiêm ngặt áp dụng cho từng pha để tránh bất kỳ lỗi nào trong sự phát triển tổng thể của các mô
Trong nghiên cứu của chúng tôi, khi tiến hành phân tích chu kỳ tế bào, ở lô xử lý với bài thuốc Lá dâu, Dừa cạn với nồng độ thuốc 621,3 µg/ml, kết quả cho thấy tỉ lệ tế bào ở pha G2-M lớn hơn so với lô chứng Nghĩa là có sự ngăn chặn phân bào ở pha G2-M dưới tác dụng của thuốc Điều này có thể liên quan đến tác dụng của một số hoạt chất chiết xuất từ Lá dâu và Dừa cạn
Vincristin là một chất chiết xuất từ cây dừa
Lô 1
Lô 2
Trang 5cạn, được sử dụng kết hợp trong hóa trị liệu
ung thư Nghiên cứu của các tác giả Tu Y,
Cheng SX về tác dụng ức chế chu kỳ tế bào của
vincristin trên tế bào u nguyên bào thần kinh
SH-SY5Y: Phân tích chu kỳ tế bào của các tế
bào u nguyên bào thần kinh SH-SY5Y được xử
lý với vincristin bằng phương pháp dòng chảy
tế bào Kết quả ghi nhận tại thời điểm 18 giờ tỷ
lệ tế bào pha G2-M (72,3 ± 9,4%) cao hơn so với
nhóm đối chứng không xử lý với vincristin
(13,3 ± 3,8%) (p <0,01) Những dữ liệu này cho
thấy rằng vincristin gây dừng chu kỳ tế bào ở
pha G2-M(10,13)
Chưa có nghiên cứu chính xác về tác dụng
ức chế chu kỳ tế bào của Lá dâu trên dòng tế
bào u nguyên bào thần kinh Tuy nhiên một
nghiên cứu của tác giả Naowaratwattana W đã
chỉ ra các polyphenol trong Lá dâu gây tác
dụng tương tự như trong nghiên cứu của
chúng tôi trên tế bào HepG2 liên quan đến ung
thư biểu mô tế bào gan(8)
Trong nghiên cứu của chúng tôi sử dụng
cao chiết nước toàn phần của Lá dâu và Dừa
cạn Điều này chưa tìm thấy ở các nghiên cứu
trước đó hầu hết sử dụng các hoạt chất chiết
suất từ hai dược liệu này Tuy nhiên kết quả
vẫn cho thấy cao chiết nước toàn phần Lá dâu,
Dừa cạn có tác dụng ức chế chu kì tế bào trên
dòng tế bào u nguyên bào thần kinh SKN-DZ
Qua đây, bước đầu khẳng định cơ sở khoa học
của bài thuốc Lá dâu, Dừa cạn thu thập tại tỉnh
Sóc Trăng
KẾT LUẬN
Bài thuốc Lá dâu và Dừa cạn thu thập trên
địa bàn tỉnh Sóc Trăng có khả năng ức chế chu
kỳ tế bào trên dòng tế bào u nguyên bào thần
kinh SKN-DZ
Lời cảm ơn: Bài báo này là một phần kết quả
của đề tài Nghiên cứu khoa học thuộc Sở Khoa học
và công nghệ tỉnh Sóc Trăng, đã được công nhận
kết quả theo Quyết định số 177/QĐ-SKHCN ngày 28/12/2018
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1 Blajeski AL, Phan VA, Kottke TJ, Kaufmann SH (2002) "G(1) and G(2) cell-cycle arrest following microtubule
depolymerization in human breast cancer cells" J Clin Invest,
110:9-91
2 Bray F, Ferlay J, Soerjomataram I, Siegel RL, Torre LA, et al (2018) "Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185
countries" CA Cancer J Clin, 68:394-424
3 Coderch C, Morreale A, Gago F (2012) "Tubulin-based structure-affinity relationships for antimitotic Vinca alkaloids"
Anticancer Agents Med Chem, 12:25-219
4 de Oliveira AM, da Silva MM, da Silva GC, et al (2015)
"Evaluation of Toxicity and Antimicrobial Activity of an Ethanolic Extract from Leaves of Morus alba L (Moraceae)"
Hindawi, http://dx.doi.org/10.1155/2015/513978
5 Deepa M, Sureshkumar T, Satheeshkumar PK., Priya S (2013)
"Antioxidant rich Morus alba leaf extract induces apoptosis in human colon and breast cancer cells by the downregulation of
nitric oxide produced by inducible nitric oxide synthase" Nutr
Cancer, 65:10-305
6 Knudson AG (2001) "Two genetic hits (more or less) to cancer"
Nat Rev Cancer, 1(2):62-157
7 Maris JM, Hogarty MD, Bagatell R, Cohn SL (2007)
"Neuroblastoma" Lancet, 369:20-2106
8 Naowaratwattana W, De-Eknamkul W, De Mejia EG (2010)
"Phenolic-containing organic extracts of mulberry (Morus alba L.) leaves inhibit HepG2 hepatoma cells through G2/M phase arrest, induction of apoptosis, and inhibition of topoisomerase
IIalpha activity" J Med Food, 13(5):56-1045
9 Packer RJ, Ater J, Allen J, Phillips P, Geyer R, et al (1997)
"Carboplatin and vincristine chemotherapy for children with
newly diagnosed progressive low-grade gliomas" J Neurosurg,
86:54-747
10 Park S, Kim J, Kim Y (2012) "Mulberry leaf extract inhibits
cancer cell stemness in neuroblastoma" Nutr Cancer,
64(6):98-889
11 Qaddoumi I, Billups CA, Tagen M, Stewart CF, Wu J, et al (2012) "Topotecan and vincristine combination is effective against advanced bilateral intraocular retinoblastoma and has
manageable toxicity" Cancer, 118:70-5663
12 Quỹ Dân số Liên hợp quốc (UNFPA) (2011) “Già hóa dân số và người cao tuổi ở Việt Nam: thực trạng, dự báo và một số khuyến nghị chính sách”, pp.12-36
13 Tu Y, Cheng S, Zhang S, Sun H, Xu Z (2012) "Vincristine induces cell cycle arrest and apoptosis in SH-SY5Y human
neuroblastoma cells" Int J Mol Med, 31(1):9-113
Ngày nhận bài báo: 28/07/2019 Ngày phản biện nhận xét bài báo: 20/08/2019 Ngày bài báo được đăng: 14/09/2019