Phạm Thị Thanh Tuyền Xây dựng phương pháp xác định một số thuốc chống dị ứng trộn trái phép trong chế phẩm đông dược bằng LC-MS/MS

Ở Việt Nam, đã có nhiều nghiên cứu phát hiện thuốc hóa dược trộn lẫn trong đông dược, chủ yếu thuộc các nhóm giảm đau chống viêm không steroid, hạ huyết áp, hạ đường máu, glucocorticoid

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

PHẠM THỊ THANH TUYỀN

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH MỘT SỐ THUỐC CHỐNG DỊ ỨNG TRỘN TRÁI PHÉP TRONG CHẾ PHẨM ĐÔNG

DƯỢC BẰNG LC-MS/MS

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

HÀ NỘI 2019

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

PHẠM THỊ THANH TUYỀN

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH MỘT SỐ THUỐC CHỐNG DỊ ỨNG TRỘN TRÁI PHÉP TRONG CHẾ PHẨM ĐÔNG

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt quá trình thực hiện đề tài Luận văn thạc sĩ dược học, các thầy cô, gia

đình, bạn bè và đồng nghiệp là những người đã luôn động viên, hỗ trợ, giúp đỡ và

tạo điều kiện thuận lợi để tôi có thể hoàn thành đề tài một cách hoàn thiện nhất

Lời đầu tiên tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Nguyễn Thị Kiều

Anh, là người đã tận tình hướng dẫn và luôn tạo điều kiện thuận lợi để tôi có thể

hoàn thành tốt đề tài của mình

Tôi xin được cảm ơn PGS.TS Nguyễn Xuân Trường và các anh chị cán bộ

Trung tâm giám định ma túy – Viện Khoa học hình sự - Bộ Công an đã hỗ trợ cho

tôi về thiết bị LC-MS/MS để tôi có thể hoàn thành đề tài nghiên cứu

Tôi xin chân thành cảm ơn NCS.Ths Trần Thúy Hạnh – Viện Kiểm nghiệm

thuốc Trung ương và NCS.Ths Đào Thị Cẩm Minh – Trường Đại học Y Dược Huế

đã giúp đỡ tôi trong quá trình nghiên cứu, thực hiện luận văn

Tôi xin được cảm ơn các thầy cô Trường Đại học Dược Hà Nội, đặc biệt là các

thầy cô Bộ môn Hóa phân tích – Độc chất đã truyền đạt cho tôi những kiến thức cần

thiết, là nền tảng để tôi có thể xây dựng, thực hiện và hoàn thành đề tài nghiên cứu

Đồng thời tôi cũng xin chân thành cảm ơn Công ty Cổ phần Traphaco đã giúp

đỡ tôi trong quá trình tạo nền mẫu nghiên cứu, xin được cảm ơn Ban lãnh đạo và

các anh chị cán bộ Viện Công nghệ dược phẩm quốc gia đã tạo điều kiện về trang

thiết bị, máy móc để hỗ trợ tôi suốt trong quá trình thực hiện đề tài

Lời cuối cùng tôi xin dành lời cám ơn đến gia đình, bạn bè, đồng nghiệp đã luôn

khích lệ, tạo động lực cho tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu vừa qua

Hà Nội, tháng 3 năm 2019

Học viên Phạm Thị Thanh Tuyền

MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

Chương 1 TỔNG QUAN 3

1.1 Tổng quan về các đối tượng nghiên cứu 3

1.1.1 Nhóm thuốc đối kháng thụ thể histamin H1 3

1.1.2 Nhóm thuốc glucocorticoid 5

1.1.3 Dược liệu và chế phẩm đông dược điều trị và hỗ trợ điều trị dị ứng 8

1.2 Một số nghiên cứu phát hiện thuốc chống dị ứng trộn trái phép trong chế phẩm đông dược 10

1.2.1 Trên thế giới 10

1.2.2 Tại Việt Nam 12

1.3 Tổng quan về sắc ký lỏng khối phổ 14

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18

2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị và đối tượng nghiên cứu 18

2.1.1 Hoá chất - chất chuẩn 18

2.1.2 Máy móc - trang thiết bị 18

2.1.3 Đối tượng nghiên cứu 19

2.2 Phương pháp nghiên cứu 20

2.2.1 Xử lý mẫu 20

2.2.2 Xây dựng phương pháp phân tích bằng LC-MS/MS 20

2.2.3 Thẩm định quy trình phân tích đã xây dựng 21

2.2.4 Ứng dụng quy trình phân tích trên mẫu thực 21

2.3 Phương pháp xử lý số liệu 22

Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 23

3.1 Xây dựng phương pháp phân tích 23

3.1.1 Chuẩn bị các dung dịch chuẩn 23

3.1.2 Khảo sát và lựa chọn các điều kiện khối phổ 23

3.1.3 Khảo sát và lựa chọn điều kiện xử lý mẫu 29

3.2 Thẩm định phương pháp phân tích 35

3.2.1 Độ phù hợp của hệ thống 35

3.2.2 Độ đặc hiệu 36

3.2.3 Khoảng nồng độ tuyến tính 38

3.2.4 Độ đúng và độ chính xác 40

3.2.5 Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng 43

3.3 Ứng dụng phân tích trên mẫu thực 45

Chương 4 BÀN LUẬN 50

4.1 Về nền mẫu 50

4.2 Về phương pháp phân tích 50

4.3 Về xử lý mẫu 52

4.4 Về thẩm định phương pháp phân tích 52

4.5 Ứng dụng 53

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 55 TÀI LIỆU THAM KHẢO

DANH MỤC CÁC PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

Từ viết tắt Tiếng anh hoặc tên khoa học Tiếng việt

Chromatography

Sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao

LC – MS/MS

Liquid Chromatography – Mass Spectrometry/ Mass Spectrometry

Sắc ký lỏng hai lần khối phổ

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Một số dược liệu điều trị và hỗ trợ điều trị mề đay, mẩn ngứa, dị ứng 8

Bảng 1.2 Một số chế phẩm đông dược điều trị và hỗ trợ điều trị mề đay, mẩn ngứa, dị ứng lưu hành trên thị trường 9

Bảng 1.3 Một số nghiên cứu phân tích các thuốc chống dị ứng trộn trái phép trong chế phẩm đông dược 11

Bảng 2.4 Các nguyên vật liệu dùng trong nghiên cứu 18

Bảng 3.5 Các thông số máy khối phổ 24

Bảng 3.6 Điều kiện khối phổ của các chất phân tích 24

Bảng 3.7 Điều kiện khảo sát pha động theo chế độ gradient 26

Bảng 3.8 Kết quả khảo sát dung môi chiết (n=3) 31

Bảng 3.9 Kết quả khảo sát thời gian siêu âm (n = 3) 33

Bảng 3.10 Kết quả đánh giá độ phù hợp của hệ thống LC-MS/MS (n=6) 35

Bảng 3.11 Chuẩn bị dãy dung dịch chuẩn hỗn hợp 38

Bảng 3.12 Sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ và diện tích pic của các chất phân tích 39

Bảng 3.13 Kết quả độ đúng và độ chính xác trong ngày trên 3 nền mẫu (n=7) 40

Bảng 3.14 Kết quả độ đúng và độ chính xác khác ngày trên 3 nền mẫu (n=7) 41

Bảng 3.15 Kết quả độ đúng và độ chính xác trên 3 nền mẫu (n=14) 42

Bảng 3.16 Kết quả LOD và LOQ trên 3 nền mẫu 44

Bảng 3.17 Kết quả định tính trên mẫu thực 48

Bảng 3.18 Kết quả đánh giá các mẫu thực dương tính 49

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Hình 1.1 Sơ đồ hệ thống LC-MS/MS 15

Hình 1.2 Sơ đồ sự tạo thành ion dương trong ESI 16

Hình 1.3 Bộ phân tích tứ cực 16

Hình 1.4 Mô hình bộ phân tích tứ cực chập ba 16

Hình 3.5 Sắc ký đồ khảo sát cột sắc ký 25

Hình 3.6 Sắc ký đồ khảo sát tỷ lệ pha động 27

Hình 3.7 Sắc ký đồ khảo sát tốc độ dòng pha động 28

Hình 3.8 Biểu đồ đánh giá hiệu suất chiết phụ thuộc loại dung môi (nền N3) 32

Hình 3.9 Biểu đồ đánh giá hiệu suất chiết phụ thuộc thời gian siêu âm (nền N3) 34

Hình 3.10 Quy trình xử lý mẫu 34

Hình 3.11 Sắc ký đồ khảo sát độ đặc hiệu trên nền N1 37

Hình 3.12 Sắc ký đồ khảo sát độ đặc hiệu trên nền N2 37

Hình 3.13 Sắc ký đồ khảo sát độ đặc hiệu trên nền N3 37

Hình 3.14 Sắc ký đồ các chất phân tích ở nồng độ LOD trên nền N3 44

Hình 3.15 Sắc ký đồ và phổ định danh cyproheptadin hydroclorid trong mẫu H05 46 Hình 3.16 Sắc ký đồ phân tích mẫu dương tính H05 để định lượng 46

Hình 3.17 Sắc ký đồ và phổ định danh dexamethason acetat trong mẫu B13 47

Hình 3.18 Sắc ký đồ và phổ định danh chlorpheniramin maleat trong mẫu B13 47

Hình 3.19 Sắc ký đồ phân tích mẫu dương tính B13 để định lượng 48

ĐẶT VẤN ĐỀ

Dị ứng ngày nay được coi là bệnh của cuộc sống hiện đại, hiện trên thế giới có hơn 1 tỉ người đang mắc bệnh này và ở Việt Nam tỉ lệ mắc là khoảng 20% dân số cả nước [36], [39] Các nhóm thuốc hóa dược để điều trị dị ứng bao gồm nhóm đối kháng thụ thể histamin H1 và glucocorticoid Tuy nhiên cả hai nhóm này đều có thể gây những tác dụng phụ nghiêm trọng như: buồn ngủ, khô mắt, dị ứng, lệ thuộc thuốc; loãng xương, giữ nước gây phù, tăng huyết áp, viêm loét dạ dày, đái tháo

đường, rối loạn tâm thần, đục thủy tinh thể, suy thượng thận [5] Đặc biệt khi được

trộn lẫn vào các chế phẩm đông dược và dùng trong thời gian dài thì sẽ càng làm

trầm trọng hơn các tác dụng không mong muốn

Gần đây các chế phẩm đông dược đang ngày càng được sử dụng rộng rãi để phòng bệnh, cải thiện sức khỏe và điều trị những bệnh mãn tính Nhiều chế phẩm đông dược đã được đưa vào thị trường để đáp ứng nhu cầu chăm sóc sức khỏe của người dân Tuy nhiên, để tăng cường hoặc ngụy tạo tác dụng của các chế phẩm này

mà một số nhà sản xuất đã pha trộn với thuốc hóa dược không được khai báo [17] Các thuốc hóa dược được tìm thấy điển hình là thuốc điều trị đái tháo đường, chất

ức chế phosphodiesterase-5 (PDE's-5), thuốc giảm béo, thuốc chống cao huyết áp, thuốc giảm đau chống viêm không steroid, thuốc chống dị ứng, glucocorticoid…[16], [24], [26], [32] Trong đó, đã có một số công bố về các thuốc chống dị ứng bao gồm nhóm thuốc đối kháng thụ thể histamin H1 như chlorpheniramin, cetirizin, diphenhydramin, loratadin…[24], [27], [34] và các glucocorticoid như dexamethason, betamethason [14], [23]

Với tình hình trên, Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) đã ban hành một số hướng dẫn nhằm giám sát sự an toàn của thuốc thảo dược và tăng cường cơ quan quản lý thuốc của các quốc gia thành viên khác nhau Ví dụ, trong năm 2007, Cơ quan Quản

lý Thực phẩm và Dược phẩm (FDA) đã ban hành các quy định về thực hành sản xuất tốt (GMP) cho các thực phẩm chức năng và ghi nhãn thích hợp cho các sản phẩm thảo dược [22] Các nước thành viên EU (Liên minh Châu Âu) cũng có các quy tắc để kiểm soát các sản phẩm thảo dược

Ở Việt Nam, đã có nhiều nghiên cứu phát hiện thuốc hóa dược trộn lẫn trong đông dược, chủ yếu thuộc các nhóm giảm đau chống viêm không steroid, hạ huyết

áp, hạ đường máu, glucocorticoid [8], [9], [10], [12], nhưng hiện nay chưa có nghiên cứu nào về việc trộn lẫn các thuốc hóa dược chống dị ứng nhóm đối kháng thụ thể histamin H1 trong chế phẩm đông dược được công bố

Các phương pháp hay được sử dụng trong phát hiện thuốc hóa dược trộn trái phép trong chế phẩm đông dược bao gồm sắc ký lớp mỏng (TLC), sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC), sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao (HPTLC) Tuy nhiên những phương pháp trên vẫn còn hạn chế như có thể cho kết quả âm tính giả hoặc dương tính giả Hiện nay, sắc ký lỏng ghép hai lần khối phổ là một kỹ thuật mà gắn kết tiềm năng phân tích lý học của sắc ký lỏng (LC) với một khả năng phân tích khối (m/z) của bộ phận khối phổ (MS) Thiết bị LC-MS là một kỹ thuật được ứng dụng ngày càng nhiều do có độ nhạy và độ đặc hiệu cao, phù hợp để phân tích trên các nền mẫu phức tạp như các chế phẩm đông dược

Để góp phần vào công tác kiểm tra phát hiện các chất cấm trộn lẫn trong chế

phẩm đông dược, chúng tôi tiến hành đề tài nghiên cứu: “Xây dựng phương pháp

xác định một số thuốc chống dị ứng trộn trái phép trong chế phẩm đông dược bằng LC-MS/MS” Với mục tiêu:

1 Xây dựng phương pháp xác định đồng thời betamethason, dexamethason acetat, chlorpheniramin maleat, cyproheptadin hydroclorid, loratadin trộn trái phép trong chế phẩm đông dược dạng rắn bằng LC-MS/MS

2 Ứng dụng phương pháp đã xây dựng để xác định các dược chất trên trộn trái phép trong một số chế phẩm đông dược đang lưu hành trên thị trường

Chương 1 TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về các đối tượng nghiên cứu

Theo Tổ chức Y tế Thế giới, dị ứng là một rối loạn quá mẫn của hệ miễn dịch Phản ứng dị ứng xảy ra để chống lại các chất vô hại trong môi trường được gọi là chất gây dị ứng, các phản ứng này xảy ra nhanh chóng và có thể dự đoán được Thực tế, dị ứng là một trong bốn hình thức của chứng quá mẫn cảm Nó kích hoạt quá mức các tế bào bạch cầu lympho B và một loại kháng thể được gọi là IgE, dẫn đến một phản ứng viêm nặng thông thường bao gồm chàm, phát ban, sốt, lên cơn hen suyễn, ngộ độc thức ăn, phản ứng với nọc độc của côn trùng chích như ong, muỗi, kiến Dị ứng nhẹ rất phổ biến, gây ra các triệu chứng như viêm kết mạc dị ứng, ngứa và chảy nước mũi

Để điều trị dị ứng, ngoài tránh tiếp xúc với các tác nhân gây dị ứng, còn có thể

sử dụng các thuốc hóa dược chống dị ứng như nhóm thuốc đối kháng thụ thể histamin H1, nhóm thuốc glucocorticoid hoặc có thể dùng các chế phẩm đông dược

1.1.1 Nhóm thuốc đối kháng thụ thể histamin H1

Trên lâm sàng thuốc kháng histamin H1 dùng để ngăn ngừa các biểu hiện dị ứng, ngăn ngừa chứng say tàu xe Vài thuốc kháng histamin H1 khác còn có thể dùng để điều trị ốm nghén, chúng có tác dụng chống nôn và chống dị ứng

Thuốc kháng histamin H1 có 2 thế hệ Thuốc kháng histamin H1 thế hệ 1 như: chlorpheniramin, diphenhydramin thường có tác dụng ức chế hệ thần kinh trung ương gây an thần, tuy nhiên mức độ tác dụng không giống nhau giữa các thuốc và các cá thể Thuốc kháng histamin H1 thế hệ 2 như: loratadin, cyproheptadin ít có tác dụng này

Tác dụng không mong muốn:

Thay đổi tuỳ theo từng cá thể, thường biểu hiện ức chế thần kinh (ngủ gà, khó chịu, giảm phản xạ, mệt), chóng mặt, thường gặp ở các thuốc kháng histamin H1 thế hệ 1 Tác dụng an thần trên gây nguy hiểm cho người sử dụng thuốc khi lái tàu,

xe, làm việc trên cao, công việc cần sự tỉnh táo

Các kháng histamin H1 làm tăng tác dụng của rượu và các thuốc ức chế thần kinh trung ương, gây chóng mặt, mệt mỏi, mất sự phối hợp nhịp nhàng, ù tai, bồn chồn, tăng co giật (động kinh) ở trẻ em Ở cùng liều điều trị, các thuốc thế hệ 2 ít gây tác dụng không mong muốn hơn

Các kháng histamin H1 thế hệ 1 còn có tác dụng kháng cholinergic nên gây khô miệng, họng và mũi Ngoài ra còn gây căng ngực, đau đầu Trên tiêu hóa, gây

ăn kém ngon, nôn, buồn nôn, tiêu chảy…

- Tên khoa học: 4-(5H-dibenzo[a,d] cyclohepten-5-yliden)-1-methylpiperidin

hydroclorid

- Tính chất vật lý: Bột tinh thể trắng hoặc trắng ngà, không mùi, vị hơi đắng Tương đốì bển với ánh sáng, không khí và hơi ẩm ở nhiệt độ phòng Chảy ở khoảng 162°C,

dạng khan ỏ 250°C Ít tan trong nước, tan trong ethanol, không tan trong ether [7]

- Chỉ định: Dùng cho các trường hợp viêm mũi dị ứng; dị ứng nhẹ, mề đay, phù mạch, da nổi quầng Chủ yếu điều trị ngứa do các dị ứng tại chỗ do côn trùng cắn,

do dị ứng vật lý, do thuốc, huyết thanh ; phòng và chống chứng đau nửa đầu, kích thích ăn ngon ở người gầy yếu, chán ăn

- Tác dụng phụ: Chóng mặt, buồn nôn, khô miệng, mệt mỏi, run, nhức đầu

- Liều dùng: Người lớn: 4 mg/lần x 3-4 lần/ngày Tối đa 0,5 mg/kg/24 giờ [3]

- Liều dùng: Người lớn và trẻ em từ 12 tuổi trở lên: 10 mg/24 giờ [3]

1.1.2 Nhóm thuốc glucocorticoid

Hormon vỏ thượng thận gồm 3 loại: mineral corticoid có tác dụng trao đổi chủ yếu lên chất khoáng, glucocorticoid có tác dụng chủ yếu lên trao đổi hydrat carbon và các steroid sinh dục Glucocorticoid tự nhiên do vùng bó vỏ thượng thận sản xuất ra gồm 2 chất hydrocortison và cortison Glucocorticoid tổng hợp gồm rất nhiều chất

khác nhau

Tác dụng của glucocorticoid:

Ở nồng độ sinh lý các chất này cần cho cân bằng nội môi, tăng sức chống đỡ của cơ thể với stress và duy trì các chức năng khác của cơ thể như tác dụng trên chuyển hóa glucid, protid, lipid và chuyển hóa muối nước, trên các cơ quan… Trong đó tác dụng chống viêm, chống dị ứng hay được áp dụng trong điều trị một

số bệnh mãn tính như: thấp khớp, hen phế quản, viêm xoang, mề đay, mẩn ngứa…

Tác dụng không mong muốn:

Glucocorticoid có khả năng gây ra tác dụng phụ đáng kể, tác dụng phụ phụ thuộc vào liều lượng thuốc sử dụng và có thể bao gồm: gây phù, tăng huyết áp do giữ natri và nước; loét dạ dày tá tràng; làm vết thương chậm liền sẹo, dễ nhiễm trùng; gây tăng đường huyết hoặc làm nặng thêm bệnh đái tháo đường; làm loãng xương, xốp xương; gây nhược cơ, teo cơ, mỏi cơ; đặc biệt gây suy thượng thận cấp khi ngừng dùng thuốc đột ngột… Ngoài ra có thể gặp các tác dụng không mong muốn khác như đục thủy tinh thể, mất ngủ, rối loạn tâm thần Khi dùng tại chỗ có thể gây viêm da, teo da, rạn da… [5]

-methylpregna-1,4-dien-3,20 Tính chất vật lý: Bột kết tinh trắng hay gần như trắng Thực tế không tan trong nước, ít tan trong ethanol, rất ít tan trong methylen clorid [7]

- Chỉ định: Điều trị thay thế khi vỏ thượng thận không tiết đủ hormon Điều trị các bệnh tự miễn Điều trị dị ứng, sốc phản vệ và các bệnh liên quan đến phản ứng dị ứng như hen phế quản, viêm mũi dị ứng, mề đay, viêm da tiếp xúc Điều trị viêm

cơ, khớp, viêm da

- Tác dụng phụ: Rối loạn nước và điện giải, suy yếu cơ, loãng xương, loét dạ dày, chậm lành vết thương, rối loạn nội tiết…

- Liều dùng: 0,5 - 4 mg/ngày Liều duy trì: 0,5 – 2 mg/ngày [5]

- Liều dùng: dùng đường uống 0,5 - 10 mg/24 giờ/lần hoặc chia vài lần [4]

Cả 5 thuốc hóa dược chống dị ứng ở trên là những thuốc hay được kê đơn trong các phác đồ điều trị mề đay, mẩn ngứa, dị ứng do có hiệu quả điều trị cao và

có mức liều điều trị thấp nên nếu được pha trộn vào các chế phẩm đông dược thì khó bị phát hiện bởi một số phương pháp phân tích thông thường như TLC, HPLC

Hơn nữa, tác dụng an thần của các thuốc kháng histamin H1 đặc biệt là chlorpheniramin có thể được lợi dụng để làm xoa dịu những cơn khó chịu của người bệnh do ngứa ngáy đem lại, do đó các thuốc này có nguy cơ bị trộn trái phép vào các chế phẩm đông dược cao hơn so với các thuốc khác trong cùng nhóm tác dụng dược lý Do đó lựa chọn 5 thuốc hóa dược trên để tiến hành nghiên cứu

1.1.3 Dƣợc liệu và chế phẩm đông dƣợc điều trị và hỗ trợ điều trị dị ứng

Hiện nay, trên thị trường có rất nhiều các chế phẩm đông dược có số đăng ký

có tác dụng điều trị và hỗ trợ điều trị dị ứng, mề đay, mẩn ngứa Chúng đa dạng về thành phần các loại dược liệu (liên kiều, kim ngân hoa, kinh giới, bồ công anh, ngưu bàng tử, cúc hoa …) cũng như dạng bào chế (viên hoàn, thuốc bột, viên nang, cốm tan) Một số vị dược liệu và chế phẩm đông dược có tác dụng điều trị và hỗ trợ điều trị dị ứng, mề đay, mẩn ngứa theo „Thông tư danh mục thuốc cổ truyền được

Bộ Y tế công nhận‟ do bộ trưởng Bộ y tế ban hành ngày 31/10/2016 được minh họa trong bảng dưới đây :

Bảng 1.1 Một số dược liệu điều trị và hỗ trợ điều trị mề đay, mẩn ngứa, dị ứng

14 Xuyên khung Rhizoma Ligustici wallichii Thân rễ

Bảng 1.2 Một số chế phẩm đông dược điều trị và hỗ trợ điều trị mề đay, mẩn ngứa,

dị ứng lưu hành trên thị trường

Đạm đậu xị 133 mg; Ngưu bàng tử 160mg; Cát cánh 160 mg; Đạm trúc diệp 107 mg; Cam thảo 133 mg)

Viên nang cứng

Công ty

cổ phần Dược phẩm OPC

Bạc hà 2 g; Cát cánh 2 g; Mạch môn 2,7 g; Hoàng cầm 2,7 g; Quả dành dành 2,7 g)

Cốm tan

Công ty

Cổ phần

BV Pharma

Sài hồ 0,10 g; Kim ngân hoa 0,10g;

Liên kiều 0,10 g; Ma hoàng 0,10 g; Tô diệp 0,05 g; Bạc hà 0,05 g; Cam thảo 0,05 g

Thuốc bột

Cơ sở Phú Sơn

Viên nang cứng

Công ty TNHH Dược phẩm Hoa Linh

1.2 Một số nghiên cứu phát hiện thuốc chống dị ứng trộn trái phép trong chế phẩm đông dƣợc

1.2.1 Trên thế giới

Trong những năm gần đây, đã có sự gia tăng trong việc sử dụng các sản phẩm

có nguồn gốc từ thảo dược để điều trị hoặc hỗ trợ điều trị bệnh, điều này có thể do

hệ quả mà các tác dụng phụ của các thuốc hóa dược mang lại và sự gia tăng vấn đề

tự sử dụng thuốc và thực phẩm chức năng Theo WHO, có tới 80% số người sống ở các nước đang phát triển vẫn chủ yếu dựa vào các loại thuốc truyền thống để chăm sóc sức khỏe của họ [22] Tuy nhiên sự pha trộn với các loại thuốc hóa dược là một mối quan tâm lớn cho các cơ quan quản lý thuốc khi có nhiều báo cáo về các rủi ro ảnh hưởng nghiêm trọng đến sức khỏe mà nguyên nhân là từ các chế phẩm đông dược được khẳng định là "hoàn toàn tự nhiên" Các thuốc hóa dược hay được trộn thuộc các nhóm thuốc điều trị đái tháo đường, chất ức chế phosphodiesterase-5 (PDE's-5), thuốc chống cao huyết áp, thuốc giảm đau chống viêm không steroid, thuốc chống dị ứng, glucocorticoid, thuốc giảm béo …[16], [24]

Đặc biệt, nhóm hóa dược hay bị trộn điển hình nhất là glucocorticoid Ở Hàn Quốc, So-Hyun Cho và cộng sự đã khảo sát trên 294 loại thực phẩm và thực phẩm chức năng được quảng cáo là có hiệu quả trong điều trị viêm khớp, xương và đã phát hiện 30% các mẫu có chứa hóa dược gồm dexamethason, cortison-21-acetat, prednison-21-acetat, betamethason, prednison and prednisolon [18] Ở Anh, Ramsay H.M và cộng sự đã xác định được hydrocortison, clobetason butyrat, betamethason valerat, and clobetasol propionat trong 24 loại kem thảo dược điều trị eczema bằng phương pháp HPLC [29]

Nhóm thuốc kháng histamin H1 cũng được cho thấy là hay bị trộn vào các chế phẩm đông dược vì tác dụng chống dị ứng và tác dụng an thần của nó Một nghiên cứu ở Mỹ chỉ ra rằng trong số 243/260 loại thuốc đông dược ở châu Á đã được thu thập từ các cửa hàng thảo dược bán lẻ ở California, có 17 loại (7%) chứa thuốc hóa dược không được khai báo Trong đó, chlorpheniramin là 1 trong 4 loại hóa dược không khai báo phổ biến nhất [28] Ở Trung Quốc, YE Lin-hu và cộng sự sử dụng phương pháp LC-MS/MS khảo sát 7 antihistamin bao gồm loratadin,

diphenhydramin hydrochlorid, cyproheptadin hydrochlorid, cetirizin hydrochlorid, promethazin hydrochlorid, mizolastin, and chlorpheniramin maleat trên 9 loại chế phẩm thảo dược, kết quả đã xác định 4 mẫu chế phẩm đã bị lẫn với các antihistamin trên [34] Ở Hàn Quốc, Jung Yeon Kim và cộng sự sử dụng phương pháp LC-MS/MS khảo sát trên 117 mẫu chế phẩm chăm sóc sức khỏe và đã phát hiện 1 mẫu chứa diphenhydramin [27]

Các nghiên cứu phát hiện các thuốc hóa dược này trộn trái phép trong chế phẩm đông dược sử dụng nhiều phương pháp phân tích khác nhau, được trình bày trong bảng sau :

Bảng 1.3 Một số nghiên cứu phân tích các thuốc chống dị ứng trộn trái phép trong

Pha động: acetonitril /0,1% acid formic (tt/tt)

bằng acetonitril, tinh chế theo quy trình

Pha động: 0,1% acid formic trong nước và 0,1% acid formic trong

Viên nén,

thuốc mỡ,

kem

Loratadin, Diphenhydramin hydrochlorid Cyproheptadin hydrochlorid Cetirizin hydrochlorid Promethazin hydrochlorid Mizolastin Chlorpheniramin maleat

LC-MS/MS Cột Agilent Eclipse Plus C18 (2,1 mm × 50 mm; 3,5 μm）

Tốc độ dòng: 0,4 ml/phút

Pha động: 0,1% acid formic trong nước và 0,1% acid formic trong acetonitril

Detector: ESI-MS

bằng methanol 80%, siêu âm

LC-MS/MS

BEH C18 (2,1 × 100 mm; 1,7 µm)

Pha động: 0,1% acid formic trong nước (A)

và ACN (B) Detector: ESI-MS

1.2.2 Tại Việt Nam

Tại Việt Nam, các chế phẩm đông dược và thực phẩm chức năng có mặt trên thị trường hiện nay rất đa dạng, nhiều thành phần, khó kiểm soát vì được bán qua nhiều kênh khác nhau như trong hiệu thuốc, cửa hàng bán các sản phẩm chăm sóc sức khỏe, qua mạng internet, đa cấp, siêu thị … nên có nguy cơ cao các sản phẩm này được làm giả gây ra nhiều tác dụng không mong muốn khi sử dụng

Năm 2010, phát hiện cơ sở sản xuất thuốc YHCT Hinh Hòa có mẫu ”Khu phong tê thấp thủy” và “Truy phong tê thấp thủy” điều trị đau lưng, mỏi gối, đau khớp xương bị trộn betamethason [13] Năm 2011, Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương đã kiểm tra mẫu „Thuốc bổ Tỳ‟ của cơ sở Phước Lợi Đường tại Đà Nẵng với công dụng kích thích ngon miệng đã phát hiện có trộn dexamethason và cyproheptadin

Năm 2014, Thanh tra Sở Y tế Hà Nội kiểm tra Cơ sở thuốc đông y gia truyền

Hà Tộc ở số 34, khu tập thể Ngân hàng Ba La, Hà Đông, Hà Nội, đã phát hiện trong gói thuốc bột “Thuốc Đông y gia truyền” có thành phần hoạt chất hóa dược là prednisolon, dexamethason acetat và paracetamol [37]

Năm 2017, Sở Y tế thành phố Hồ Chí Minh đã phát hiện cơ sở đông y Nhơn Tâm Tế (quận 12) lưu giữ và bày bán nhiều chế phẩm đông dược điều trị biếng ăn cho trẻ em, kết quả kiểm nghiệm cho thấy có chứa corticoid và cyproheptadin [38]

Từ những thực trạng trên có thể thấy rõ tình hình trộn trái phép các thuốc hóa dược chống dị ứng trong chế phẩm đông dược đang xảy ra thường xuyên và phức tạp, tuy nhiên các nghiên cứu để phát hiện vẫn chưa thật sự nhiều, chủ yếu là các nghiên cứu trên nhóm corticoid Lê Đào Khánh Long và cộng sự đã tiến hành xây dựng phương pháp phát hiện dexamethason, betamethason, prednison, prednisolon

và hydrocortison pha trộn trong các chế phẩm đông dược bổ tỳ vị, trừ phong thấp bằng kỹ thuật sắc ký lớp mỏng 5 hệ dung môi đã được xây dựng để tách các corticoid ra khỏi hỗn hợp, phát hiện bằng thuốc thử xanh tetrazolium và thuốc thử

H2SO4/cồn có formaldehyd Kết quả khảo sát trong 26 mẫu đông dược lấy từ thị trường, có 7 mẫu (22%) cho thấy có dexamethason hoặc betamethason [9] Trần Thị Hoàng Chi đã tiến hành định tính, định lượng dexamethason acetat và betamethason trộn trái phép trong chế phẩm đông dược bằng HPLC Phương pháp đã sử dụng ethyl acetat làm dung môi chiết mẫu, cột C18, pha động gồm nước và acetonitril tỷ

lệ 55:45, bước sóng phát hiện 240 nm, hiệu suất thu hồi 104 - 109 % LOD và LOQ lần lượt là 0,5 ppm và 1,6 ppm Kết quả cho thấy 6 mẫu trong tổng số mẫu khảo sát

có chứa corticoid Hàm lượng dexamethason acetat và betamethason được phát hiện trong khoảng 0,029 - 0,13 mg/g chế phẩm [6]

Gần đây, nhóm nghiên cứu của Đào Thị Cẩm Minh và cộng sự đã xây dựng quy trình định tính, định lượng đồng thời 9 chất thuộc nhóm giảm đau và chống viêm: betamethason, dexamethason acetat, hydrocortison acetat, prednisolon, prednison, paracetamol, piroxicam, indomethacin, ketoprofen trộn lẫn trong chế phẩm đông dược bằng phương pháp LC/MS Đối tượng nghiên cứu là các chế phẩm đông dược và thực phẩm chức năng hỗ trợ điều trị bệnh xương khớp ở dạng thuốc bột, hoàn cứng, viên nang, viên nén và trà túi lọc Phương pháp đã sử dụng cột sắc

ký Restek Ultra II C18 (100 mm x 2,1 mm; 1,9 µm), cột bảo vệ Restek Ultra C18 Guard Cartridge (10 mm x 4 mm; 3 µm), thể tích tiêm mẫu 2µl, tốc độ dòng 3 ml/phút, pha động gồm 0,1% acid formic trong nước (kênh A) và 0,1% acid formic trong acetonitril (kênh B) ở chế độ gradient Kết quả phân tích trên 30 mẫu chế phẩm đông dược hỗ trợ điều trị bệnh xương khớp đã phát hiện 5 chế phẩm bị trộn trái phép các hoạt chất giảm đau và chống viêm (cả nhóm NSAIDs và corticoid), trong đó có 2 mẫu dương tính với dexamethason acetat [11]

Tuy nhiên, các nghiên cứu phát hiện thuốc hóa dược chống dị ứng nhóm đối kháng thụ thể histamin H1 trộn trái phép trong chế phẩm đông dược cho đến nay vẫn còn hạn chế Vì vậy, nghiên cứu này sẽ phát triển phương pháp xác định các thuốc hóa dược chống dị ứng trộn trái phép trong chế phẩm đông dược có độ chính xác và độ nhạy cao ở mức nồng độ ppb, góp phần vào công tác đảm bảo chất lượng thuốc và bảo vệ sức khỏe cho người dân

1.3 Tổng quan về sắc ký lỏng khối phổ

Sắc ký lỏng khối phổ là kỹ thuật phân tích có sự kết hợp khả năng phân tách các chất trong hỗn hợp của bộ phận sắc ký lỏng hiệu năng cao (High performance liquid chromatography – HPLC) và khả năng phân tích số khối (m/z) của bộ phận khối phổ (Mass spectrometry – MS) Thiết bị LC-MS là một kỹ thuật đầy tiềm năng được ứng dụng ngày càng rộng rãi vì có tính chọn lọc và độ nhạy cao, giới hạn phát hiện có thể đến 10-14

gam, thời gian phân tích nhanh, có thể định lượng đồng thời các chất có thời gian lưu gần giống nhau mà các phương pháp sắc ký lỏng thông thường không làm được [1]

Sắc ký lỏng (LC) cho phép tách riêng biệt các chất phân tích trong hỗn hợp nhiều thành phần dựa vào sự khác biệt về ái lực của các chất này với pha động và pha tĩnh Tùy vào bản chất của chất cần phân tích mà chúng có thể được phát hiện bằng các loại detector khác nhau

Khối phổ (MS) phân tích các chất dựa trên cơ sở xác định khối lượng phân tử của các hợp chất hóa học bằng việc phân tách các ion phân tử theo tỉ số giữa khối lượng và điện tích (m/z) của chúng Các ion có thể tạo ra bằng cách thêm hay bớt điện tích của chúng như loại bỏ electron, proton hóa Các ion tạo thành này được tách theo tỉ số m/z và được phát hiện ở detector, từ đó có thể cho thông tin về khối lượng hoặc cấu trúc phân tử của hợp chất [2]

 Cấu tạo thiết bị khối phổ

Một thiết bị khối phổ gồm có các bộ phận sau (Hình 1.1) :

Hình 1.1 Sơ đồ hệ thống LC-MS/MS

 Bộ nạp mẫu: đưa mẫu vào máy Nếu mẫu ở dạng lỏng hoặc rắn cần chuyển sang dạng hơi Trong sắc ký lỏng khối phổ, bộ phận nạp mẫu chính là đầu ra của cột sắc ký

 Bộ nguồn ion hóa: ion hóa các phân, nguyên tử của mẫu ở trạng thái khí hoặc hơi

Các kiểu hình thành ion phổ biến: Ion hóa phun điện tử (Electrospray Ionizaton – ESI), Ion hóa hóa học ở áp suất khí quyển (Atmospheric Pressure Chemical Ionization – APCI), Ion hóa bằng photon tại áp suất khí quyển (Atmospheric Pressure Photonization – APPI) Trong đó, kiểu Ion hóa phun điện tử (ESI) được sử dụng phổ biến nhất

Hình 1.2 Sơ đồ sự tạo thành ion dương trong ESI

 Bộ phân tích khối: tách các ion theo tỷ số m/z Các ion được gia tốc và tách riêng nhờ tác dụng của từ trường, điện trường để đi đến detector Có nhiều bộ phân tích khối khác nhau như: Bộ phân tích tứ cực, phân tích tứ cực chập ba, phân tích bẫy ion, phân tích thời gian bay

Trong đó, bộ tứ cực (Quadrupole) dựa trên nguyên tắc các ion có khối lượng khác nhau sẽ dao động khác nhau theo điện áp tổng hợp một chiều và xoay chiều đặt vào môi trường di chuyển của nó

Hình 1.3 Bộ phân tích tứ cực Hiện nay, có loại dùng bộ phân tích gồm ba tứ cực xếp nối tiếp nhau Q1, Q2, Q3 (gọi là bộ tứ cực chập ba) để ghi phổ

Hình 1.4 Mô hình bộ phân tích tứ cực chập ba Trong đó:

Q0: Nguồn ion mẹ

Q1 Q2 Q3 Q0

Q1: Bộ tứ cực thứ nhất, có nhiệm vụ tách các ion Lựa chọn ion mẹ với m/z nhất định từ nguồn ion chuyển đến để chuyển đến Q2

Q2: Bộ tứ cực thứ hai, ở điều kiện áp suất cao, các ion mẹ bị phân ly do va chạm với khí trơ có mặt như khí N2, Ar, He Bộ Q2 tạo ra phân ly do các ion mẹ bị phân mảnh tiếp theo tạo ra các ion nhỏ hơn, ion con (daughter ions) Q2 không đóng vai trò là bộ lọc ion mà nó chấp nhận tất cả các ion do Q1 chuyển đến Sau đó tất cả các ion con được chuyển qua bộ tách Q3

Q3: Bộ tứ cực thứ ba làm nhiệm vụ tách các ion được chuyển từ Q2 để đi tới

bộ phận phát hiện

Thiết bị khối phổ ba tứ cực gọi là máy khối phổ hai lần (LC-MS/MS)

 Bộ phận phát hiện ion (detector): có nhiệm vụ chuyển các ion đã đến, khuếch đại thành tín hiệu điện đo bằng hệ điện tử của máy khối phổ

 Bộ phận ghi và xử lý số liệu (data system):

Tín hiệu điện từ detector được khuếch đại trước khi chuyển thành tín hiệu số phục vụ xử lý dữ liệu theo yêu cầu khác nhau như: ghi phổ khối, so sánh với thư viện phổ, định lượng… Một số kỹ thuật ghi phổ trong đầu dò khối phổ bao gồm :

ion để cho khối phổ toàn ion đối với tất cả các chất trong suốt quá trình phân tích

hiệu của các ion đã được lựa chọn trước đó, chế độ SIM thường được lựa chọn để khảo sát năng lượng phân mảnh khi đã biết ion mẹ

Monitoring):

SRM: cô lập ion cần chọn, sau đó phân mảnh ion cô lập đó, trong các mảnh ion sinh ra, cô lập 1 mảnh ion con cần quan tâm và đưa vào đầu dò để phát hiện MRM: cô lập ion cần chọn (ion mẹ) ở tứ cực thứ nhất, phân mảnh ion cô lập

đó tại tứ cực thứ 2 (thực chất là buồng va chạm) thu được các ion con, cô lập 2 (hoặc nhiều) ion con cần quan tâm ở tứ cực thứ 3 và đưa vào đầu dò để phát hiện

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị và đối tượng nghiên cứu

2.1.1 Hoá chất - chất chuẩn

Bảng 2.4 Các nguyên vật liệu dùng trong nghiên cứu

STT Nguyên liệu Tiêu

acetat

Chuẩn DĐVN

Chuẩn VKNTTW SKS: 0200014 HL: 99,7%

maleat

Chuẩn DĐVN

Chuẩn VKNTTW SKS: WS.0317032.03 HL: 99,10%

hydroclorid

Chuẩn PTN

Chuẩn VKNTTW SKS: 0102126 HL: 100,64%

PTN

Chuẩn VKNTTW SKS: SKS 0108242 HL: 99,6%

Hóa

chất

2.1.2 Máy móc - trang thiết bị

- Máy sắc ký lỏng 2 lần khối phổ LC/MS/MS: Triple Quadrupole BRUKER EVOQ Qube – Mỹ

- Cân phân tích METTLER – AB204 – Thụy Sỹ (d = 0,1 mg)

- Cân phân tích METTLER – TOLEDO XPE105 – Thụy Sỹ (d = 0,01 mg)

- Máy lắc siêu âm DAIHAN WUC – A22H – Hàn Quốc

- Máy ly tâm HERMLE Z306 – Đức

- Tủ sấy MEMMERT ULM 500 – Đức

- Máy lắc xoáy Vortex ZX3 -Ý

- Các dụng cụ trong phân tích: bình định mức, pipet, micropipet

2.1.3 Đối tƣợng nghiên cứu

- Mẫu thử: Các chế phẩm đông dược và thực phẩm bảo vệ sức khỏe dạng bào

chế viên nang cứng, viên hoàn, bột thuốc có tác dụng điều trị hoặc hỗ trợ điều trị mề đay, mẩn ngứa, dị ứng đang lưu hành tại Việt Nam

+ Nơi thu thập mẫu: từ các hiệu thuốc đông y, thuốc gia truyền, mạng internet, mẫu gửi

+ Nơi lưu hành mẫu: Hà Nội, Đà Nẵng, Khánh Hòa, Hà Tĩnh, An Giang, Phú Yên

+ Dạng bào chế: viên hoàn, viên nang cứng, thuốc bột

- Mẫu trắng: 3 nền mẫu dùng để xây dựng và thẩm định phương pháp phân

tích được xây dựng dựa trên nguyên lý Y học cổ truyền phương Đông, các bài thuốc kinh điển, các nghiên cứu khoa học về dược liệu có tác dụng điều trị mề đay, mẩn ngứa, dị ứng đã công bố Cả 3 nền mẫu được chế tạo tại Công ty Cổ phần Traphaco

- Hà Nội

+ Nền N1 (viên hoàn) : Dựa vào bài thuốc cổ truyền Ngân kiều tán trong sách

Ôn bệnh điều biện và theo Dược điển Việt Nam V, gia giảm thành phần của bài thuốc cho phù hợp với tác dụng điều trị, gồm 9 loại dược liệu như sau: kim ngân hoa, liên kiều, cát cánh, bạc hà, đạm trúc diệp, kinh giới tuệ, lô căn, ngưu bàng tử, cam thảo Các bước tiến hành: điều chế cao đặc dược liệu và bột mịn dược liệu, trộn đều, vê thành viên, bao màu, sấy khô, đóng gói

+ Nền 2 (bột cốm): Dựa vào bài thuốc cổ truyền Liên kiều bại độc tán trong sách Thương hàn toàn sinh tập gồm 14 loại dược liệu như sau: liên kiều, chi tử, khương hoạt, huyền sâm, bạc hà, phòng phong, sài hồ, cát cánh, thăng ma, xuyên khung, đương quy, hoàng cầm, bạch thược, ngưu bàng tử Các bước tiến hành: điều chế cao đặc dược liệu, thêm tá dược tạo khối ẩm, xát hạt qua rây, sấy hạt, sửa hạt, đóng gói

+ Nền 3 (viên nang): Dựa vào bài thuốc cổ truyền Tiêu phong tán trong sách Y tông kim giám, gia giảm thành phần của bài thuốc cho phù hợp với tác dụng điều

trị, gồm 11 loại dược liệu như sau: kinh giới, phòng phong, ngưu bàng tử, thuyền thoái, sinh địa, đan bì, bạch thược, thổ phục linh, ké đầu ngựa, bồ công anh, cam thảo Các bước tiến hành: điều chế cao đặc dược liệu và bột mịn dược liệu, trộn đều tạo khối ẩm, rây qua rây tạo hạt, sấy hạt, thêm tá dược thích hợp, đóng nang

- Mẫu tự tạo: Mẫu trắng có thêm các chất phân tích với tỉ lệ phù hợp

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Xử lý mẫu

Dựa vào tính tan của các chất phân tích và một số nghiên cứu đã công bố [7],[11], [18], [27], [34] tiến hành khảo sát khả năng chiết các thuốc hóa dược từ nền mẫu qua các bước như sau :

 Khảo sát dung môi chiết: methanol, ethanol, acetonitril, hỗn hợp methanol : nước theo các tỉ lệ khác nhau

 Khảo sát thời gian siêu âm : 5-15 phút

Quy trình chiết xuất cho đối tượng nghiên cứu là các chế phẩm đông dược dạng viên nang, bột cốm, viên hoàn gồm các bước như sau:

- Xác định khối lượng trung bình đơn vị mẫu, làm đồng nhất mẫu

- Cân chính xác một lượng mẫu tương ứng 1/10 liều dùng vào ống falcon 50ml, thêm chính xác 25 ml dung môi chiết, lắc đều

- Lắc xoáy 5 phút, siêu âm trong thời gian thích hợp ở nhiệt độ phòng

- Ly tâm 6000 vòng/phút trong 10 phút, lấy phần dịch trong pha loãng tới nồng độ thích hợp bằng dung môi chiết, lọc qua màng lọc 0,22 µm, tiến hành phân tích

2.2.2 Xây dựng phương pháp phân tích bằng LC-MS/MS

Tiến hành khảo sát theo các nội dung sau:

- Khảo sát điều kiện khối phổ: Lựa chọn điều kiện nguồn ion hóa, ion mẹ, điều kiện bắn phá ion mẹ để tạo ion con, lựa chọn ion con để định tính, định lượng Khảo sát, tìm điều kiện khối phổ phân tích đồng thời 5 chất nghiên cứu trên

- Khảo sát điều kiện sắc ký: Lựa chọn pha động, cột sắc ký, nhiệt độ cột, thể tích tiêm mẫu, tốc độ dòng để có thể tách và phát hiện đồng thời các chất phân tích

ở nồng độ ng/ml, các pic nhỏ gọn, cân xứng, thời gian phân tích không quá dài

2.2.3 Thẩm định quy trình phân tích đã xây dựng

Tiến hành thẩm định phương pháp theo hướng dẫn của AOAC 2016 [15] và ICH 2005 [25] trên 3 nền mẫu tự tạo chứa các chất phân tích với các chỉ tiêu:

- Độ phù hợp của hệ thống: Tiêm lặp lại sáu lần dung dịch chuẩn hỗn hợp gồm betamethason (BET) và dexamethason acetat (DEX) có nồng độ 30 ng/ml; 3 chất chlorpheniramin maleat (CLO), cyproheptadin hydroclorid (CYP) và loratadin (LOR) có nồng độ 50 ng/ml vào hệ thống LC-MS/MS Đánh giá độ biến thiên của diện tích pic và thời gian lưu (RSD < 15 % đối với mức nồng độ ≤ 100 ppb)

- Độ đặc hiệu của phương pháp: phân tích mẫu trắng, mẫu trắng thêm chuẩn và mẫu chuẩn Trên sắc ký đồ mẫu trắng không xuất hiện pic trùng với thời gian lưu của các chất phân tích Trên sắc ký đồ mẫu trắng thêm chuẩn, các pic xuất hiện trùng thời gian lưu với mẫu chuẩn

- Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng (LOD, LOQ): Xác định giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) của phương pháp bằng cách phân tích các mẫu trắng thêm chuẩn ở các nồng độ nhỏ khác nhau Tiến hành phân tích, nồng

độ tại đó cho tỷ số S/N (tín hiệu/ nhiễu) = 3 là LOD và S/N = 10 là LOQ

- Khoảng nồng độ tuyến tính: Từ dung dịch chuẩn gốc hỗn hợp pha loãng thành dãy các dung dịch chuẩn hỗn hợp bằng dung môi đã khảo sát Xây dựng đường biểu diễn sự phụ thuộc giữa diện tích pic của từng chất chuẩn với nồng độ các chất phân tích

- Độ đúng và độ chính xác của phương pháp: Tiến hành chuẩn bị mẫu trắng theo quy trình xử lý mẫu đã xây dựng, thêm chuẩn ở 3 mức nồng độ (thấp, trung bình, cao) phù hợp Phân tích lặp lại 7 lần ở mỗi nồng độ để xác định độ đúng và độ chính xác trong ngày và khác ngày (độ thu hồi trong khoảng 80,0 - 110,0 % và RSD

< 15% ở nồng độ ≤ 100 ppb)

2.2.4 Ứng dụng quy trình phân tích trên mẫu thực

- Áp dụng phương pháp LC-MS/MS phát hiện các chất phân tích trong một số chế phẩm đông dược điều trị hoặc hỗ trợ điều trị mề đay, mẩn ngứa, dị ứng thu thập trên thị trường Dựa vào thời gian lưu, mảnh mẹ, hai mảnh con, tỷ lệ cường độ hai

mảnh con của mẫu thử so với mẫu chuẩn để xác định sự có mặt của chất phân tích (định tính)

- Xác định nồng độ các chất phân tích trên (nếu có) trong các mẫu thử thu thập được dựa vào phương trình hồi quy tuyến tính tương ứng của 5 chất phân tích (định lượng)

Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 Xây dựng phương pháp phân tích

3.1.1 Chuẩn bị các dung dịch chuẩn

- Dung dịch chuẩn gốc đơn 1 mg/ml: Cân chính xác khoảng 10 mg mỗi chất BET,

DEX, CLO, CYP, LOR chuẩn vào các bình định mức 10 ml, hòa tan và định mức vừa đủ 10 ml bằng methanol được các dung dịch chuẩn gốc đơn có nồng độ chính xác khoảng 1 mg/ml

- Dung dịch chuẩn đơn 10 µg/ml: Dùng micropipet hút chính xác 100 µl mỗi dung dịch chuẩn gốc đơn cho vào bình định mức 10 ml, thêm methanol vừa đủ thu được các dung dịch chuẩn đơn có nồng độ chính xác khoảng 10 µg/ml

- Dung dịch chuẩn hỗn hợp 100 ng/ml: Dùng micropipet hút chính xác 100 µl mỗi dung dịch chuẩn đơn có nồng độ chính xác khoảng 10 µg/ml cho vào bình định mức

10 ml, thêm methanol vừa đủ thu được các dung dịch chuẩn hỗn hợp có nồng độ chính xác khoảng 100 ng/ml

- Dung dịch chuẩn hỗn hợp 50 ng/ml: Dùng pipet hút chính xác 5 ml dung dịch chuẩn hỗn hợp có nồng độ chính xác khoảng 100 ng/ml cho vào bình định mức 10

ml, thêm methanol vừa đủ thu được dung dịch chuẩn hỗn hợp có nồng độ chính xác khoảng 50 ng/ml

- Dung dịch chuẩn gốc hỗn hợp: Cân chính xác khoảng 7,5 mg đối với BET và

DEX; 12,5 mg đối với CLO, CYP và LOR chuẩn vào bình định mức 20 ml Hòa tan

và định mức vừa đủ 20 ml bằng methanol thu được dung dịch chuẩn gốc hỗn hợp có nồng độ BET và DEX là 0,375 mg/ml; CLO, CYP và LOR là 0,625 mg/ml

3.1.2 Khảo sát và lựa chọn các điều kiện khối phổ

3.1.2.1 Khảo sát điều kiện khối phổ

Phương pháp LC-MS/MS phân tích các chất dựa trên cơ sở xác định ion phân

tử (ion mẹ) và ion sản phẩm (ion con) đối với từng hoạt chất Với kỹ thuật ion hóa ESI ở chế độ ion dương, các ion mẹ thường được tạo thành bằng cách thêm một proton [M-H]+ hay thêm hai proton [M-2H]++ Từ ion mẹ đã xác định được, tiến hành bắn phá để lựa chọn các ion con dùng cho định tính và định lượng

Tiêm không qua cột vào hệ thống MS các dung dịch chuẩn đơn có nồng độ 5 µg/ml (được pha loãng 2 lần từ dung dịch chuẩn đơn 10 µg/ml bằng methanol) để xác định ion mẹ và các ion con Các điều kiện phân mảnh ion, năng lượng bắn phá phân mảnh (CE) được tối ưu hóa tự động theo thiết bị khối phổ Lựa chọn 2 ion con

có tín hiệu lớn, ổn định để định tính và định lượng, trong đó ion con có tín hiệu lớn

và ổn định hơn làm ion định lượng, ion con còn lại dùng để định tính Điều kiện khối phổ lựa chọn được trình bày trong các bảng sau:

Bảng 3.5 Các thông số máy khối phổ

Thông số Giá trị tối ƣu (đơn vị)

Bảng 3.6 Điều kiện khối phổ của các chất phân tích

Tên chất Ion mẹ (m/z) Ion con (m/z) CE (eV) Tỷ lệ (%)

Nhận xét: Từ Bảng 3.5 và Bảng 3.6, xác định được điều kiện MS/MS để phân

tích các chất phân tích Kết quả khảo sát cho thấy ion mẹ của 5 chất phân tích đều ở

dạng [M-H]+ có số khối lớn hơn khối lượng phân tử một đơn vị (m/z=M+1) cho cường độ tín hiệu lớn nhất Từ đó, mỗi chất phân tích được xác định bằng một ion

mẹ và hai ion con dùng để định lượng và định tính Kết quả này đáp ứng yêu cầu hiện nay đối với phương pháp phân tích bằng LC-MS/MS theo quy định của Châu

Âu (2002/657/EC) với số điểm nhận dạng (IP) là 4 (1 ion mẹ – 1 điểm và 2 ion con – mỗi ion 1,5 điểm)

3.1.2.2 Khảo sát và lựa chọn điều kiện sắc ký

a) Cột sắc ký

Sử dụng cùng hệ pha động gồm acid formic 0,1 % /nước (A) và acetonitril (B), thể tích tiêm mẫu là 2 µl, tốc độ dòng là 0,3 ml/phút, tiêm vào hệ thống sắc ký hỗn hợp 5 chất phân tích nồng độ 50 ng/ml theo chương trình gradient 0 → 7,5 phút: 15 → 75 % B; 7,5 → 8,5 phút: 75 → 15% B; 8,5 → 12 phút: 15 % B Tiến hành khảo sát trên hai cột là: cột Ultra II C18 (100 x 2,1 mm; 1,9 µm) (cột 1) và cột InertSustain AQ-C18 (100 mm x 2,1 mm; 3,0 µm) (cột 2) Sắc ký đồ tổng hợp của

các chất phân tích sử dụng hai loại cột trên được trình bày ở Hình 3.5

Hình 3.5 Sắc ký đồ khảo sát cột sắc ký

Nhận xét: từ Hình 3.5 cho thấy: Cột 1 các chất phân tích rửa giải chậm hơn,

pic loratadin bị doãng chân Cột 2 cho các pic nhỏ gọn, cân đối, thời gian phân tích ngắn hơn Vì vậy cột 2 được lựa chọn để tiến hành phân tích

- MP1: Acid formic 0,1% /nước (A) và acetonitril (B)

- MP2: Acid formic 0,1% /nước (A) và acid formic 0,1% /acetonitril (B)

Thể tích tiêm mẫu là 2 µl, tốc độ dòng là 0,3 ml/phút

Kết quả: cả 2 hệ pha động trên đều có thời gian phân tích tương tự nhau, các pic đều cân xứng và cường độ tín hiệu cao Hệ pha động MP1 đơn giản, dễ chuẩn bị hơn Do đó, lựa chọn hệ MP1 là pha động để tiến hành phân tích

 Tỷ lệ pha động

Sử dụng hệ pha động MP1 với kênh A: acid formic 0,1%/nước và kênh B: acetonitril, khảo sát chế độ đẳng dòng 50:50 (A:B) và các chế độ gradient sau:

Bảng 3.7 Điều kiện khảo sát pha động theo chế độ gradient

Thời gian (phút)

(a) Chế độ đẳng dòng A:B = 50:50 (b) Chế độ gradient 1

Hình 3.6 Sắc ký đồ khảo sát tỷ lệ pha động

Nhận xét: từ Hình 3.6 cho thấy:

- 3,0 phút Pic loratadin và dexamethason acetat không cân xứng, chlorpheniramin maleat bị chẻ pic

- Chế độ gradient 1 (hình b): thời gian lưu từ 1,6 – 6,0 phút, chlorpheniramin maleat bị chẻ pic, các pic còn lại nhỏ gọn, cân đối

- Chế độ gradient 2 (hình c): các pic ra sớm, thời gian lưu từ 1,1 – 3,3 phút Pic betamethason và loratadin bị đổ đầu; trên sắc ký đồ của chlorpheniramin maleat

có xuất hiện pic phụ và cyproheptadin hydroclorid không tách pic rõ ràng

- Chế độ gradient 3 (hình d): các pic có thời gian lưu từ 3,3 – 6,7 phút Các pic nhỏ gọn, sắc nét, cân đối, cường độ tín hiệu pic phù hợp để phân tích

Vì vậy, hệ pha động gồm acid formic 0,1% /nước và acetonitril chạy theo chế độ gradient 3 được lựa chọn để tiến hành phân tích

 Tốc độ dòng pha động

Tiêm vào hệ thống sắc ký hỗn hợp 5 chất nghiên cứu có nồng độ mỗi chất là

50 ng/ml với 2 tốc độ dòng 0,2 ml/phút và 0,3 ml/phút Kết quả sắc ký đồ các chất khi phân tích với 2 tốc độ dòng trên được thể hiện ở hình sau:

Hình 3.7 Sắc ký đồ khảo sát tốc độ dòng pha động

Nhận xét: từ Hình 3.7 cho thấy: ở cả 2 tốc độ dòng pha động khảo sát, các pic

đều có hình dáng nhỏ gọn, cân xứng Với tốc độ dòng 0,3 ml/phút, các chất phân tích rửa giải sớm hơn (thời gian lưu từ 3,3 đến 6,7 phút) Với tốc độ dòng 0,2 ml/phút, các chất phân tích rửa giải chậm hơn (thời gian lưu từ 4,4 đến 7,9 phút)

Do vậy, lựa chọn tốc độ dòng 0,3 ml/phút để tiến hành phân tích tiếp theo

Từ các kết quả khảo sát, lựa chọn điều kiện chạy LC-MS/MS nhƣ sau:

- Cột sắc ký: InertSustain AQ-C18 (100 mm x 2,1 mm; 3,0 µm)

- Điều nhiệt cột: 40oC

- Thể tích tiêm mẫu: 2 µl

- Tốc độ dòng: 0,3 ml/phút

- Thời gian phân tích: 12 phút

- Pha động: Kênh A: Acid formic 0,1% /nước

Kênh B: Acetonitril

- Chương trình pha động: Chế độ gradient 3: 0 → 7,5 phút: 15 → 75 % B; 7,5 → 8,5 phút: 75 → 15% B; 8,5 → 12 phút: 15 % B

- Các điều kiện khối phổ theo Bảng 3.5 và Bảng 3.6

3.1.3 Khảo sát và lựa chọn điều kiện xử lý mẫu

Chuẩn bị các mẫu như sau:

- Dung dịch chuẩn hỗn hợp: Chuẩn bị dung dịch chuẩn hỗn hợp trong methanol gồm BET và DEX có nồng độ 30 ng/ml; 3 chất CLO, CYP, LOR có nồng độ là 50 ng/ml

- Dung dịch mẫu tự tạo: Xác định khối lượng trung bình của mỗi đơn vị nền mẫu, nghiền mịn và làm đồng nhất Cân chính xác một lượng nền mẫu tương ứng 1/10 liều dùng cho vào ống falcon 50 ml (0,51 g đối với nền N1; 0,15 g đối với nền N2; 0,33 g với nền N3) Thêm 100 µl dung dịch chuẩn gốc hỗn hợp gồm BET và DEX

có nồng độ 0,375 mg/ml; 3 chất CLO, CYP và LOR có nồng độ 0,626 mg/ml vào nền mẫu, lắc nhẹ, để bay hơi dung môi ở điều kiện phòng Thêm chính xác 25 ml dung môi chiết, lắc đều Lắc xoáy 5 phút, siêu âm trong thời gian thích hợp ở nhiệt

độ phòng, ly tâm 6000 vòng/phút trong 10 phút Gạn lấy phần dịch trong ở phía trên, pha loãng 50 lần bằng methanol để các chất phân tích sau khi xử lý có nồng độ

30 ng/ml đối với BET và DEX, 50 ng/ml đối với mỗi chất CLO, CYP, LOR Lọc qua màng lọc 0,22 µm và tiến hành tiêm vào hệ thống LC-MS/MS Khảo sát điều kiện xử lý mẫu với các loại dung môi chiết khác nhau và thời gian siêu âm khác nhau Mỗi quá trình được thực hiện làm lặp lại 3 lần Tính độ thu hồi dựa vào diện tích pic của chất phân tích trong dung dịch thử so với dung dịch chuẩn

3.1.3.1 Khảo sát dung môi chiết

Tiến hành chiết mẫu tự tạo theo quy trình chung với thời gian siêu âm là 10 phút (cố định lượng nền mẫu, lượng chuẩn thêm vào, thể tích dung môi chiết mẫu, thời gian lắc xoáy, siêu âm, ly tâm) Khảo sát với các dung môi chiết như sau: ethanol, methanol – nước (50:50), methanol – nước (70:30), methanol, acetonitril Tiến hành

tiêm vào hệ thống LC-MS/MS Kết quả hiệu suất chiết được trình bày trong Bảng

3.8

Bảng 3.8 Kết quả khảo sát dung môi chiết (n=3)

Hình 3.8 Biểu đồ đánh giá hiệu suất chiết phụ thuộc loại dung môi (nền N3)

Nhận xét: Từ Bảng 3.8 và Hình 3.8 cho thấy: hiệu suất chiết của các dung môi

không có sự khác biệt lớn trên 3 nền mẫu, tuy nhiên hiệu suất chiết của các dung môi khác nhau có sự chênh lệch đáng kể Sử dụng dung môi chiết là ethanol 96% cho hiệu suất chiết các chất phân tích từ 70,18 – 87,85 % Dung môi chiết là hỗn hợp methanol : nước (50:50) cho hiệu suất chiết từ 79,89 – 90,06 % Dung môi chiết là hỗn hợp methanol : nước (70:30) cho hiệu suất chiết từ 85,39 – 95,85 % Dung môi chiết là methanol cho hiệu suất chiết từ 93,76 – 102,4 % Dung môi chiết là acetonitril cho hiệu suất chiết từ 69,55 – 90,98 % Với dung môi chiết là methanol, hiệu suất chiết các chất phân tích khá đồng đều nhau và cao hơn 4 dung môi còn lại,

do đó lựa chọn dung môi chiết mẫu là methanol

3.1.3.2 Khảo sát thời gian siêu âm

Tiến hành chiết mẫu theo quy trình chung với dung môi chiết là methanol Khảo sát các thời gian siêu âm như sau: 5 phút, 10 phút, 15 phút Tiến hành tiêm vào hệ

thống LC-MS/MS Kết quả hiệu suất chiết được trình bày trong Bảng 3.9