Nghiên cứu tích hợp vi khuẩn edophyte với vật liệu nano ứng dụng trong bảo vệ cây trồng

Tôi xin trân trọng cảm ơn các cán bộ nhân viên trong Trung tâm nghiêncứu và triển khai các hoạt chất sinh học dưới sự hướng dẫn khoa học củaGS.TS Trần Đại Lâm và TS Lê Đăng Quang, trong

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

quả nghiên cứu đƣợc trình bày trong luận văn là trung thực, khách quan vàchƣa từng đƣợc ai công bố trong bất kỳ công trình khoa học nào khác.

Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc hoàn thành luận văn đãđƣợc cảm ơn, các thông tin trích dẫn trong luận văn này đều đƣợc chỉ rõnguồn gốc Nếu có gì sai sót tôi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm

Hà Nội, tháng 09 năm 2019

Tác giả luận văn

Đinh Thị Hiền

Luận văn này được hoàn thành tại Học viện Khoa Học & Công nghệ Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

-Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tôi xin gửi lời cám ơn chân thành

nhất tới GS.TS Trần Đại Lâm và TS Lê Đăng Quang đã tận tình hướng

dẫn, động viên và giúp đỡ em trong suốt quá trình thực hiện luận văn

Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới thầy, cô giáo trong Họcviện Khoa Học & Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ ViệtNam đã chỉ bảo và giảng dạy tôi trong năm học qua cũng như hoàn thiện luậnvăn này

Tôi xin trân trọng cảm ơn các cán bộ nhân viên trong Trung tâm nghiêncứu và triển khai các hoạt chất sinh học dưới sự hướng dẫn khoa học củaGS.TS Trần Đại Lâm và TS Lê Đăng Quang, trong khuôn khổ đề tài “Nghiêncứu ứng dụng chế phẩm nano – vi khuẩn PGPR nhằm phòng trừ bệnh giảsương mai trên cây dưa lưới” - Trung tâm phát triển công nghệ cao – ViệnHàn Lâm Khoa Học và Công nghệ Việt Nam (Hợp đồng thực hiện nghiên cứukhoa học và công nghệ số 47/2018/HĐ-QKHCN ngày 28/12/2018 giữa Quỹphát triển khoa học và công nghệ thành phố Hồ Chí Minh và Trung tâm pháttriển công nghệ cao) đã quan tâm giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi tốt nhấtcũng như những đóng góp về chuyên môn cho tôi trong quá trình học tập vànghiên cứu thực hiện và bảo vệ luận văn

Cuối cùng tôi xin cám ơn những người thân trong gia đình và bạn bè đãdành cho tôi sự khích lệ, động viên và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập

Hà Nội, ngày 20 tháng 09 năm 2019

Học viên

Đinh Thị Hiền

Môi trường nuôi cấy vi khuẩn (Peptone 10g, Cao nấm men5g, NaCl 10g)

Phổ hấp thụ hồng ngoạiMật độ quang

Vi khuẩn vùng rễ kích thích tăng trưởng thực vậtKính hiển vi điện tử quét

Kính hiển vi điện tử truyền quaTetraetyl orthosilicat

Thermogrametric Analysis (Phân tích nhiệt khối lượng)Hạt nano Titanium-Bis-Ammonium-Lactato-DihydrohydeTitanium Isopropoxide

Bảng 2.2 Bảng các nồng độ nano TiO2 thử nghiệm với vi khuẩn 46

Bảng 2.3 Bảng các nồng độ nano SiO2 thử nghiệm với vi khuẩn 47

Bảng 3.1 Kết quả phân tích DLS các mẫu TiO2 54

Bảng 3.2 Kết quả phân tích DLS các mẫu SiO2 58

Bảng 3.3 Kết quả khảo sát OD các mẫu vi khuẩn và nano TiO2 63

Bảng 3.4 Kết quả khảo sát OD các mẫu chứa vi khuẩn và nano SiO2 66

Bảng 3.5 Thời gian sinh trưởng của các mẫu dưa lưới 70

Bảng 3.6 Chiều cao trung bình của các mẫu cây dưa lưới theo thời gian 71

Bảng 3.7 Số lá trung bình ở các mẫu cây dưa lưới theo thời gian 74

Bảng 3.8 Số nhánh trung bình ở các mẫu cây dưa lưới theo thời gian 74

Bảng 3.9 Kết quả khảo sát các mẫu mạ sau gieo hạt 79

Bảng 3.10 Động thái tăng trưởng các mẫu lúa sau gieo trồng 80

và tinh thể khuyết tật mạng (d) [1] 4

Hình 1.2 Giản đồ năng lượng của TiO2 pha anatas và rutil [1] [8] 7

Hình 1.3 Sơ đồ mô tả các quá trình oxy hoá và khử trong tinh thể bán dẫn [1] [3] [4] 9

Hình 1.4 Cấu trúc phân tử Silica 11

Hình 1.5 Sơ đồ tổng hợp oxit bằng phương pháp sol-gel 16

Hình 1.6 Các cơ chế đã biết của vi khuẩn PGPR Bacillus spp đối với cây trồng [21] [22] 21

Hình 1.7. Hạt nano Titanium-Bis-Ammonium-Lactato-Dihydrohyde (TiBALDH) [23] 23

Hình 1.8 Hình ảnh cây lúa trên ruộng 29

Hình 1.9 Cây dưa lưới trồng trong nhà kính 32

Hình 2.1 Sơ đồ nguyên tắc của kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM) 38

Hình 2.2 Thiết bị kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM) 39

Hình 2.3 Sơ đồ nguyên tắc của kính hiển vi điện tử quét (SEM) 40

Hình 2.4 Thiết bị kính hiển vi điện tử quét (SEM) 41

Hình 2.5 Sơ đồ nguyên lý của máy quang phổ hồng ngoại biến đổi Fourier 42

Hình 2.6 Thiết bị phân tích IR 43

Hình 2.7 Một số thiết bị dùng trong nuôi cấy và đánh giá sự phát triển của vi khuẩn 44

Hình 3.1 Hình ảnh mẫu T3 55

Hình 3.2 Kết quả phân tích DLS mẫu T3 55

Hình 3.3 Thế zeta mẫu T3 55

Hình 3.4 Kết quả phân tích SEM mẫu T3 56

Hình 3.5 Kết quả phân tích TEM mẫu T3 56

Hình 3.6 Kết quả phân tích IR mẫu T3 57

Hình 3.7 Hình ảnh mẫu S2 59

Hình 3.8 Kết quả phân tích DLS mẫu S2 59

Hình 3.9 Thế zeta mẫu S2 59

Hình 3.10 Kết quả phân tích TEM của mẫu S2 60

Hình 3.11 Kết quả phân tích TEM của mẫu S2 sau khi siêu âm 60

Hình 3.12 Kết quả phân tích SEM mẫu S2 61

Hình 3.13 Phổ IR của mẫu S2 62

Hình 3.14 Đồ thị biểu diễn mối quan hệ giữa giá trị OD và thời gian của các mẫu chứa vi khuẩn và nano TiO2 64

Hình 3.15 Hình ảnh mẫu nano TiO2 60 µg/ml – vi khuẩn - LB ở các thời gian khác nhau 4 giờ ( a ); 8 giờ ( b ); 24 giờ ( c ) và 48 giờ ( d ) 65

Hình 3.16 Đồ thị biểu diễn mối quan hệ giữa giá trị OD và thời gian của các mẫu chứa vi khuẩn và nano SiO2 66

Hình 3.19 Hình ảnh SEM mẫu nano SiO2 – vi khuẩn trên rễ cây dưa 69

Hình 3.20 Bộ rễ cây trước khi đưa ra ruộng sản xuất 69

Hình 3.21 Hình ảnh các mẫu dưa lưới sau trồng 21 ngày 72

Hình 3.22 Hình ảnh các mẫu dưa lưới sau trồng 28 ngày 73

Hình 3.23 Hình ảnh hạt thóc được ngâm trong thời gian 1 giờ và 24 giờ với các dung dịch khác nhau 76

Hình 3.24 Hình ảnh mạ các mẫu giống ngâm trong các dung dịch 1 giờ 77

Hình 3.25 Hình ảnh mạ các mẫu giống ngâm trong các dung dịch 24 giờ 77

Hình 3.26 Hình ảnh lúa các mẫu giống ngâm trong các dung dịch 1 giờ chuyển lên đất trồng sau 28 ngày 78

Hình 3.27 Hình ảnh lúa các mẫu giống ngâm trong các dung dịch 24 giờ chuyển lên đất trồng sau 28 ngày 78

1 LÍ DO CHỌN ĐỀ TÀI 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 3

1.1 TỔNG QUAN VỀ NANO TiO2, SiO2 3

1.1.1 Tổng quan về nano TiO 2 3

1.1.1.1 Cấu trúc, tính chất của vật liệu nano TiO 2 3

1.1.1.2 Tính chất xúc tác quang của TiO 2 7

1.1.1.3 Ứng dụng nano TiO 2 trong nông nghiệp 10

1.1.2 Tổng quan về SiO 2 11

1.1.2.1 Tổng quan về cấu trúc 11

1.1.2.2 Tính chất 12

1.1.2.3 Ứng dụng nano SiO 2 trong nông nghiệp 13

1.1.3 Các phương pháp tổng hợp nano TiO 2 và nano SiO 2 14

1.1.3.1 Phương pháp hóa ướt (wet chemical) 14

1.1.3.2 Phương pháp cơ học (mechanical) 14

1.1.3.3 Phương pháp bốc bay 14

1.1.3.4 Phương pháp hình thành từ pha khí (gas-phase) 15

1.1.3.5 Phương pháp sol- gel 15

1.2 TỔNG QUAN VỀ VI KHUẨN Bacillus subtilis 20

1.2.1 Giới thiệu chung về nhóm vi khuẩn PGPR 20

1.2.2 Vai trò PGPR trong kích thích sinh trưởng thực vật 20

1.2.3 Vi khuẩn Bacillus subtilis 23

1.2.3.1 Đặc điểm phân loại 23

1.2.3.2 Đặc điểm phân bố 24

1.2.3.3 Đặc điểm hình thái 24

1.2.3.4 Đặc điểm sinh hóa 25

1.2.3.5 Các chất kháng sinh do Bacillus subtilis tổng hợp 26

1.2.3.6 Tính đối kháng của Bacillus subtilis 27

1.3 CÂY LÚA VÀ DƯA LƯỚI 27

1.3.1 Tổng quan về cây lúa 27

1.3.2 Tổng quan về cây dưa lưới 32

CHƯƠNG 2 NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 34

2.1 TỔNG HỢP VẬT LIỆU NANO 34

2.1.1 Nguyên vật liệu và thiết bị 34

2.1.2.2 Phương pháp đánh giá cấu trúc hạt 38

2.2 PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY VI KHUẨN Bacillus subtilis 44

2.2.1 Chủng vi sinh PGPR 44

2.2.2 Dụng cụ, hóa chất, thiết bị và môi trường nuôi cấy vi sinh, chủng vi khuẩn 44

2.2.3 Trình tự tiến hành 45

2.2.3.1 Nuôi cấy vi khuẩn 45

2.2.3.2 Nuôi cấy vi khuẩn và nano 45

2.3 PHƯƠNG PHÁP THỬ NGHIỆM VỚI CÂY LÚA VÀ CÂY DƯA 47

2.3.1 Thử nghiệm trên cây dưa 47

2.3.1.1 Chọn giống dưa 47

2.3.1.2 Yêu cầu sinh thái đối với cây dưa lưới 47

2.3.1.3 Kỹ thuật canh tác 48

2.3.1.4 Các chỉ tiêu theo dõi 50

2.3.2 Thử nghiệm trên cây lúa 51

2.3.2.1 Chọn giống lúa 51

2.3.2.2 Quy trình thực hiện 51

2.3.2.3 Phương pháp đánh giá 52

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 54

3.1 TỔNG HỢP VẬT LIỆU 54

3.1.1 Tổng hợp nano TiO 2 54

3.1.1.1 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ TTIP/H 2 O tới kích cỡ hạt 54 3.1.1.2 Khảo sát cấu trúc hạt TiO 2 56

3.1.2 Tổng hợp nano SiO 2 58

3.1.2.1 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ TEOS/H 2 O tới kích cỡ hạt 58 3.1.2.2 Khảo sát cấu trúc hạt SiO 2 60

3.2 KHẢO SÁT QUÁ TRÌNH PHÁT TRIỂN CỦA VI KHUẨN ENDOPHYTE - NANO 63

3.2.1 Vi khuẩn Endophyte và nano TiO 2 63

3.2.2 Vi khuẩn Endophyte và nano SiO 2 65

3.3 THỬ NGHIỆM TRÊN LÚA VÀ DƯA LƯỚI 67

3.3.1 Khảo sát ảnh hưởng của nano – vi khuẩn đến khả năng sinh trưởng và phát triển cây dưa 68

3.3.1.1 Ảnh hưởng của nano – vi khuẩn đến tỷ lệ, tốc độ nảy mầm,

3.3.1.3 Ảnh hưởng của nano – vi khuẩn đến động thái tăng trưởng

chiều cao của dưa lưới 70

3.3.1.4 Ảnh hưởng của nano – vi khuẩn đến động thái tăng trưởng số lá của cây dưa lưới 73

3.3.1.5 Ảnh hưởng của nano – vi khuẩn đến khả năng phân nhánh của cây dưa lưới 74

3.3.2 Thử nghiệm trên cây lúa 75

3.3.2.1 Gieo và chăm sóc 75

3.3.2.2 Đánh giá 79

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 82

4.1 Kết luận 82

4.2 Kiến nghị 82

TÀI LIỆU THAM KHẢO 84

MỞ ĐẦU

1 LÍ DO CHỌN ĐỀ TÀI

Cho đến ngày nay khi khoa học kỹ thuật phát triển, đặc biệt là ngànhkhoa học công nghệ nano, việc ứng dụng các hạt nano trong công nghệ sinhhọc, đặc biệt trong nông nghiệp đang là vấn đề thu hút được sự quan tâm củanhiều nhà khoa học trên thế giới

Vi khuẩn nội ký sinh thực vật (Endophytic bacteria) được tìm thấytrong hầu hết ở các loài thực vật, chúng cư trú ở trong nội mô của thực vật kýchủ và giữa chúng hình thành một loạt các mối quan hệ khác nhau như cộngsinh tương hỗ, công sinh dinh dưỡng, hội sinh Endophytic bacteria thúc đẩythực vật tăng trưởng, tăng năng suất và đóng vai trò là một tác nhân điều hòasinh học Endophytic bacteria sản xuất hàng loạt các sản phẩm tự nhiên có lợicho thực vật ký chủ mà ta có thể khai thác những tác nhân đó để ứng dụngtrong y học, nông nghiệp hay công nghiệp Ngoài ra nó còn có tiềm năng loại

bỏ các chất gây ô nhiễm trong đất bằng cách tăng cường khả năng khử độctrên thực vật và làm cho đất trở nên màu mỡ thông qua chu trình photphat và

cố định đạm Ngày càng có nhiều quan tâm trong việc phát triển các ứng dụngtiềm năng công nghệ sinh học của Endophytic bacteria để phát triển các giốngcây trồng có khả năng khử độc đồng thời có khả năng sản xuất sinh khối vànhiên liệu sinh học

Tích hợp vật liệu nano TiO2/ nano SiO2 và vi khuẩn endophyte giúpcho quá trình chuyển hóa và hấp thụ phân bón của cây diễn ra nhanh chóng vàhiệu quả giúp giảm lượng phân bón và thuốc tăng trưởng thực vật Đồng thờikhi Endophyte phát triển mạnh, thì cây trồng sẽ phải tiết ra nhiều hoạt chấtphytoalexin (PA) hơn, đây là hoạt chất miễn dịch tự nhiên có trong cây Hoạtchất này sẽ giúp cây tăng thêm khả năng chống chịu khi gặp những điều kiệnbất lợi từ môi trường giúp người nông dân giảm đi việc sử dụng thuốc BVTVtrong quá trình chăm sóc cây Hiện nay có rất ít các nghiên cứu tích hợp vậtliệu nano với vi khuẩn endophyte và đánh giá tác dụng của chúng đối với câytrồng và vi sinh vật hại cây trồng

Từ những luận điểm trên chúng tôi lựa chon để tài nghiên cứu:

“Nghiên cứu tích hợp vi khuẩn endophyte với vật liệu nano ứng dụng trong

bảo vệ cây trồng”.

2 NHIỆM VỤ CỦA ĐỀ TÀI:

- Chế tạo được hạt nano TiO2 và nano SiO2 có kích thước đồng đều nhắm tiến tới khảo sát cho thí nghiệm tích hợp với vi khuẩn

- Nuối cấy được chủng vi khuẩn Bacillus sp trong môi trường LB bổ

sung nano nano TiO2/nano SiO2

- Phân tích được khả năng ảnh hưởng tới sinh khối của cây và vi khuẩnsau các quy trình thực nghiệm để đưa ra kết luận

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 TỔNG QUAN VỀ NANO TiO2, SiO2

1.1.1 Tổng quan về nano TiO 2

1.1.1.1 Cấu trúc, tính chất của vật liệu nano TiO 2

 Cấu trúc tinh thể của TiO2

Titan đioxit là chất bột màu trắng, khi đun nóng có màu vàng, khi làmlạnh trở lại màu trắng Tinh thể TiO2 có độ cứng cao, không độc và khó nóngchảy (t0nc = 18700C)

Vật liệu TiO2 có thể tồn tại dưới nhiều dạng thù hình khác nhau Đếnnay các nhà khoa học đã công bố những nghiên cứu về 7 dạng thù hình (gồm

4 dạng là cấu trúc tự nhiên, còn 3 dạng kia là dạng tổng hợp) của tinh thểTiO2 Trong đó, 3 dạng thù hình phổ biến và được quan tâm hơn cả của tinhthể TiO2 là rutil, anatas và brookit Pha rutil là dạng bền, pha anatas và brookit

là dạng giả bền và dần chuyển sang pha rutil khi nung ở nhiệt độ cao (thườngkhoảng trên 900 oC) [1]

Tinh thể TiO2 pha rutil và anatas đều có cấu trúc tứ giác (tetragonal) vàđược xây dựng từ các đa diện phối trí bát diện (octahedra), trong mỗi bát diện

có 1 ion Ti4+ nằm ở tâm và 6 ion O2- nằm ở 2 đỉnh, 4 góc bao bọc

Trong một ô cơ sở của tinh thể TiO2 anatas có 4 ion Ti4+ và 7 ion O2-.Mỗi bát diện tiếp giáp với 8 bát diện lân cận (4 bát diện chung cạnh và 4 bátdiện chung góc) (Hình 1.1a) Trong một ô cơ sở của tinh thể TiO2 rutil có 2ion Ti4+ và 4 ion O2- Các bát diện oxit titan sắp xếp thành các chuỗi đối xứngbậc 4 với các cạnh chung nhau, mỗi bát diện tiếp giáp với 10 bát diện lân cận(4 bát diện chung cạnh và 6 bát diện chung góc) (Hình 1.1b) Qua đó ta có thểthấy tinh thể TiO2 anatas khuyết O nhiều hơn tinh thể TiO2 rutil Điều này ảnhhưởng tới một số tính chất vật lý của vật liệu TiO2 ở các dạng thù hình khácnhau vì các nút khuyết O có vai trò như tạp chất donor

Khoảng cách Ti-Ti trong tinh thể TiO2 ở pha anatas (3,79 Å; 3,03 Å)lớn hơn trong pha rutil (3,57 Å; 2,96 Å) còn khoảng cách Ti-O trong tinh thểTiO2 ở pha anatas (1,394 Å; 1,98 Å) nhỏ hơn trong pha rutil (1,949 Å; 1,98

Å) Điều đó cũng ảnh hưởng đến cấu trúc điện tử, cấu trúc vùng năng lượngcủa hai dạng tinh thể và kéo theo sự khác nhau về các tính chất vật lý, hóa họccủa vật liệu [1] [2].

Hình 1.1c mô tả mô hình cấu trúc tinh thể của TiO2 brookit, một phakhác của TiO2 có thể gặp trong quá trình chế tạo

Hình 1.1 Mô hình cấu trúc tinh thể TiO2 pha anatas (a), rutil (b) brookit (c)

và tinh thể khuyết tật mạng (d) [1]

Ở pha tinh thể khác nhau, cấu trúc khác nhau, tính chất của TiO2 cũng

có sự khác biệt Bảng 1.1 cho biết các thông số vật lý của TiO2 ở hai dạng thùhình chính anatas và rutil Các số liệu cho thấy TiO2 anatas có độ xếp chặtkém hơn TiO2 rutil Do đó, rutil là pha bền của TiO2, còn anatas chỉ là pha giảbền của TiO2 Ở dạng tinh thể với kích thước lớn, TiO2 rutil bền tại áp suấtthường, nhiệt độ thường và ở mọi nhiệt độ nhỏ hơn nhiệt độ nóng chảy của

nó Sự khác nhau về cấu trúc tinh thể của vật liệu ở các pha khác nhau cũngdẫn đến sự khác nhau về cấu trúc các vùng năng lượng trong tinh thể củachúng [3] [4]

Bảng 1.1 Một số tính chất vật lý của anatas và rutil [3]

 Sự chuyển pha của tinh thể TiO2

Khi điều chế TiO2, người ta thường thu được các sản phẩm ở dạng vôđịnh hình, anatas hoặc rutil do trong quá trình xử lý nhiệt, cấu trúc vật liệuchuyển dần từ dạng vô định hình sang pha anatas ở nhiệt độ cỡ 300 ÷ 450 oC

và chuyển dần sang pha rutil khi nung ở nhiệt độ cao (cỡ trên 800 oC) Sựchuyển cấu trúc sang pha rutil hoàn thành ở nhiệt độ khoảng 900 oC TiO2

cũng có thể chuyển từ pha anatas sang pha rutil ở nhiệt độ gần 500oC tuỳ theotạp chất, áp suất, môi trường, công nghệ chế tạo [1] [5] [6] [7].

Một số nghiên cứu cho thấy sự chuyển cấu trúc từ pha anatas sang rutilcòn phụ thuộc vào kích thước hạt Kích thước hạt càng nhỏ, năng lượng hoạthoá cần để chuyển cấu trúc từ pha anatas sang rutil càng nhỏ, sự chuyển phacàng dễ xảy ra Ngoài ra, sự có mặt của pha brookit cũng ảnh hưởng đến sựchuyển pha đó Tỷ lệ pha brookit trong tinh thể TiO2 anatas càng lớn thì sựchuyển pha càng xảy ra nhanh vì pha brookit dễ chuyển sang pha rutil hơn

Như vậy, pha rutil là dạng phổ biến nhất của TiO2, pha anatas hiếm gặptrong tự nhiên Thực tế TiO2 không tồn tại riêng biệt dưới một dạng nhất địnhtrong các khoáng chất mà thường có nhiều pha khác cùng tồn tại: rutil, anatas,brookit, quarzt, feldspars…Tuy nhiên, trong các dạng thù hình trên của TiO2 thìpha anatas thể hiện tính hoạt động dưới ánh sáng mặt trời cao hơn hẳn so với cácpha khác do sự khác biệt về cấu trúc vùng năng lượng của nó

 Giản đồ năng lượng của tinh thể TiO2

Các hiện tượng vật lý, hóa học xảy ra liên hệ rất mật thiết đến sự dịchchuyển điện tử giữa các dải năng lượng của vật liệu TiO2 anatas có vùng cấmrộng 3,25 eV - ứng với một lượng tử ánh sáng có bước sóng 388 nm TiO2rutil có độ rộng vùng cấm là 3,05 eV - ứng với một lượng tử ánh sáng cóbước sóng 413 nm

Giản đồ năng lượng của TiO2 anatas và rutil được thể hiện trong Hình1.2

Hình 1.2 Giản đồ năng lượng của TiO2 pha anatas và rutil [1] [8]

Giản đồ trên cho thấy vùng cấm của TiO2 anatas và rutil tương đốirộng và xấp xỉ bằng nhau cho thấy chúng đều có khả năng oxy hóa mạnh.Nhưng dải dẫn của TiO2 anatas cao hơn (khoảng 0,3 eV), ứng với một thếkhử mạnh hơn, có khả năng khử O2 thành O2- còn dải dẫn của TiO2 rutil thấphơn, chỉ ứng với thế khử nước thành khí hiđro Do vậy, TiO2 pha anatas cótính hoạt động mạnh hơn

Với những lý do trên, TiO 2 pha anatas được quan tâm chế tạo, nghiên cứu và ứng dụng nhiều hơn các pha khác.

1.1.1.2 Tính chất xúc tác quang của TiO 2

TiO2 anatas là bán dẫn loại n có độ linh động hạt tải lớn, vùng cấmrộng Nó có hệ số truyền qua cao trong vùng ánh sáng nhìn thấy và vùng hồngngoại Chiết suất và hằng số điện môi của TiO2 anatas cũng lớn

Ngoài ra, với cấu trúc điện tử có vùng hoá trị điền đầy và vùng dẫntrống, các chất bán dẫn như TiO2 có thể hoạt động như những chất tăng nhạycho các quá trình oxy hoá khử trong ánh sáng (tính chất quang xúc tác) Cácnghiên cứu cho thấy tinh thể nano TiO2 anatas (kích thước hạt tinh thể cỡ 5 -

50 nm) có tính oxy hoá khử mạnh dưới tác dụng của tia tử ngoại trong ánhsáng mặt trời hoặc đèn huỳnh quang Quá trình quang xúc tác tiến hành ở phakhí hoặc pha lỏng được chia thành 6 giai đoạn sau:

1- Các chất tham gia phản ứng đƣợc khuếch tán ở pha lỏng hoặc khí

Ở dải dẫn, điện tử có tính khử mạnh, phản ứng với các chất “ƣa điện tử” nhƣ O2 để tạo các nhân oxy hoá mạnh nhƣ H2O2, O2-, OH-

TiO2(e-) + O2 → TiO2 + O2- (1.1)

TiO2(e-) + H2O2 → TiO2 + HO* + HO- (1.4)Đồng thời, lỗ trống ở dải hóa trị có tính oxy hóa mạnh, phản ứng vớicác chất giàu điện tử nhƣ H2O, OH- và các hợp chất hữu cơ RX (hấp phụ trên

bề mặt chất xúc tác) để tạo các gốc tự do RX+, OH* trên bề mặt xúc tác:

TiO2(h+) + H2O → OH* + H+ + TiO2 (1.5)TiO2(h+) + OH- → OH* + TiO2 (1.6)TiO2(h+) + RX → RX+ + TiO2 (1.7)Các gốc OH* và O2- có tính oxy hoá mạnh gấp hàng trăm lần các chấtôxy hoá quen thuộc hiện nay nhƣ clo, ozon Chúng giúp phân hủy các hợpchất hữu cơ, khí thải độc hại, vi khuẩn, rêu mốc bám trên bề mặt vật liệuthành những chất vô hại nhƣ CO2, H2O

Hình 1.3 Sơ đồ mô tả các quá trình oxy hoá và khử trong tinh thể bán dẫn

vì TiO2 anatas và rutil đều có năng lƣợng vùng hoá trị nhƣ nhau nhƣng rutil

có năng lƣợng vùng dẫn thấp hơn năng lƣợng vùng dẫn của anatas 0,3 eVnên điện tử quang sinh dễ dàng đi vào vùng dẫn của TiO2 rutil rồi sau đó dễ đivào vùng dẫn của TiO2 anatas hơn Đây là giai đoạn khởi đầu cho chuỗi cácquá trình sau Do vậy, để một chất có khả năng quang xúc tác thì nó phải cóhoạt tính quang hoá, phải có độ rộng vùng cấm thích hợp để hấp thụ đƣợc tia

tử ngoại hoặc ánh sáng nhìn thấy (tức là Eg ≤ hν)

4- Phản ứng quang hóa: gồm 2 giai đoạn nhỏ:

• Phản ứng quang hóa sơ cấp: các phân tử chất bán dẫn bị kích thích

tham gia trực tiếp vào phản ứng với các chất bị hấp phụ

• Phản ứng quang hóa thứ cấp (còn gọi là giai đoạn phản ứng “tối” hay

phản ứng nhiệt): là giai đoạn phản ứng của các sản phẩm của giai đoạn sơ cấp

5- Các sản phẩm sau phản ứng được nhả ra khỏi bề mặt chất xúc tác 6- Các sản phẩm được khuếch tán vào pha khí hoặc lỏng.

Thực tế việc đo số photon bị hấp thụ còn gặp khó khăn do sự tán xạ củachúng trên bề mặt vật liệu Nhiều nghiên cứu cho thấy khi pha các kim loạichuyển tiếp hoặc đất hiếm vào TiO2, độ rộng vùng cấm của bán dẫn giảm, kéotheo sự tăng khả năng quang xúc tác của vật liệu với bức xạ kích thích nằmsâu trong vùng khả kiến hơn Trong thời gian gần đây, các nghiên cứu cònhướng tới mục tiêu chế tạo TiO2 có kích thước nano-mét nhằm rút ngắnquãng đường di chuyển của điện tử và lỗ trống quang sinh trên bề mặt để hạnchế đến mức tối đa khả năng tái kết hợp của lỗ trống quang sinh và điện tửquang sinh và đồng thời hạn chế những khuyết tật cấu trúc

1.1.1.3 Ứng dụng nano TiO 2 trong nông nghiệp

TiO2 là chất màu trắng không độc hại được sử dụng rộng rãi trong sảnxuất sơn, nghiên cứu, mực in, mỹ phẩm, gốm sứ, da thuộc, và là một chất khửtrùng rất mạnh so với chlorine và ozon Vì TiO2 vô hại, nên nó được chấpnhận sử dụng trong các sản phẩm thực phẩm, với lượng tối đa 1% trọnglượng cuối cùng của sản phẩm Kỹ thuật quang xúc tác TiO2 có tiềm năng lớntrong các ứng dụng nông nghiệp khác nhau, bao gồm bảo vệ thực vật vì nókhông tạo thành các hợp chất độc hại và có hiệu quả khử trùng tốt Các nhàkhoa học đã cố gắng để cải thiện hiệu quả khử trùng bằng phiến mỏng TiO2thông qua phương pháp nhuộm và các phương pháp thích hợp khác [9] Bêncạnh đó, các nhà khoa học còn nghiên cứu khả năng kích thích tăng trưởngmột số chủng vi khuẩn vùng rễ kích thích tăng trưởng thực vật và đạt đượcmột số kết quả khả quan ban đầu [10] [11] [12]

1.1.2 Tổng quan về SiO 2

1.1.2.1 Tổng quan về cấu trúc

Silica là tên thường gọi của silic điôxit (SiO2), trong đó mỗi nguyên tửôxi nằm ở đỉnh, còn silic nằm ở tâm của tứ diện đều, nếu các tứ diện nàyđược sắp xếp một cách trật tự và đều đặn ta có silica cấu trúc tinh thể, ngoài

ra silica còn có cấu trúc vô định hình [13]

Silica không tồn tại dưới dạng phân tử riêng lẻ mà tồn tại dưới dạngtinh thể, nghĩa là dưới dạng một phân tử lớn Ở điều kiện thường, silica códạng tinh thể là thạch anh, triđimit và cristtobalit Tất cả những dạng tinh thểnày đều bao gồm những nhóm tứ diện SiO4 nối với nhau qua những nguyên tử

O chung Trong tứ diện SiO4, nguyên tử Si nằm ở trung tâm của tứ diện liênkết hóa trị với bốn nguyên tử O nằm ở các đỉnh của tứ diện Độ dài liên kếtsilic-oxy thay đổi đối với mỗi dạng tinh thể khác nhau, ví dụ trong thạch anh

là 161 pm, hoặc là 154 - 171 pm trong triđimit Góc Si-O-Si cũng thay đổi từ

140o đến 180o, trong tinh thể thạch anh, giá trị này đạt 144o [14]

Hình 1.4 Cấu trúc phân tử Silica

Ba dạng tinh thể của silica có cách sắp xếp khác nhau của nhóm tứ diệnSiO4 ở trong tinh thể: Trong thạch anh, những nhóm tứ diện được sắp xếp saocho các nguyên tử Si nằm trên đường xoắn ốc Tùy theo chiều của đườngxoắn ốc mà ta có thạch anh quay trái hay quay phải Trong triđimit, cácnguyên tử Si chiếm vị trí của các nguyên tử S và Zn trong mạng lưới vuazit

Trong cristobalit, các nguyên tử Si chiếm vị trí của các nguyên tử S và Zntrong mạng lưới sphelarit.

Ngoài ba dạng trên, trong tự nhiên còn có một số dạng khác nữa củasilica có cấu trúc vi tinh thể như: mã não, opan Mã não là chất rắn, trongsuốt, gồm có những vùng có màu sắc khác nhau và rất cứng Opan là một loại

đá quý không có cấu trúc tinh thể Nó gồm những hạt cầu SiO2 liên kết vớinhau tạo nên những lỗ trống chứa không khí, nước hay hơi nước Opan cócác màu sắc khác nhau như vàng, nâu, đỏ, lục và đen do có chứa các tạp chất.Silica đã nóng chảy hoặc khi đun nóng bất kì dạng nào nếu để nguội chậmđến nhiệt độ hóa mềm, ta đều thu được một vật liệu vô định hình giống nhưthủy tinh Khác với dạng tinh thể, chất giống thủy tinh có tính đẳng hướng vàkhông nóng chảy ở nhiệt độ không đổi mà hóa mềm ở nhiệt độ thấp hơn nhiều

so với khi nóng chảy ra Bằng phương pháp Rơnghen người ta xác định đượcrằng trong trạng thái thủy tinh, mỗi nguyên tử vẫn được bao quanh bởi nhữngnguyên tử khác giống như trong trạng thái tinh thể nhưng những nguyên tử

đó sắp xếp một cách hỗn loạn hơn

1.1.2.2 Tính chất

Silica xốp, diện tích bề mặt lớn vì vậy silica rất dễ hấp phụ, ví dụ trongkhông khí ẩm silica hấp phụ nước trên bề mặt tạo các nhóm OH Silica khônghòa tan trong nước và bất kỳ dung môi, không độc, không mùi, ổn định hóahọc

Silic đioxit rất trơ về mặt hóa học Nó không tác dụng với oxi, clo,brom và axit ngay cả khi đun nóng Ở điều kiện thường, nó chỉ tác dụng với

F2 và HF Silic đioxit rất trơ về mặt hóa học Nó không tác dụng với oxi, clo,brom và axit ngay cả khi đun nóng Ở điều kiện thường, nó chỉ tác dụng với

F2 và HF

SiO2 + 2F2→ SiF4 + O2SiO2 + 4HF → SiF4 + 2H2OSilic đioxit còn tan trong kiềm hay cacbonat kim loại kiềm nóng chảy:

SiO2 + 2NaOH → Na2SiO3 + H2OSiO2 + Na2CO3 → Na2SiO3 + CO2Những phản ứng này cũng xảy ra chậm ở trong dung dịch khi đun sôisilic đioxit ở dạng bột mịn.

1.1.2.3 Ứng dụng nano SiO 2 trong nông nghiệp

Silic có nhiều loại và có nhiều nguồn gốc khác nhau, nhưng chỉ có ởdạng hòa tan cây trồng mới hấp thụ được như khoáng Clinoptiolit có chứahàm lượng SiO2 cao hơn nhiều so với các khoáng khác và đặc biệt có tỉ lệSiO2 hữu hiệu cao (có thể hòa tan) đạt tới 60 - 70%, cây trồng có thể hấp thuđược ngay khi bón vào trong đất

Cây hút Silic và tích lũy trong thành tế bào ngăn chặn sự xâm nhập của tếbào sượi nấm vào tế bào, đồng thời nó tăng tính chống chụi bệnh hại do nấmbằng cách tạo vách ngăn cơ học và tích lũy chất phenol (chất diệt nấm) Trongmột số thí nghiệm của Datnoff và Willow đã đưa ra kết luận khi bón SiO2 vàocây lúa đã làm tăng khả năng kháng bệnh, trong việc chịu hạn và mặn, nó giúpcây hạn chế thoát hơi nước, tạo sừng cứng (lớp biểu bì kép silica

- cutic)… giúp cây cứng cáp hơn và tăng năng suất lúa lên 56 – 88% [15] [16]

Ngoài ra, Belanger và Mezies đã kết luận silic làm giảm đáng kể bệnh

phấn trắng, thối gốc (Pythium ultimum) và thối rễ (Pythium aphanidermatum)

trên dưa chuột trong điều kiện thuỷ canh trong nhà kính [17]

Đối với một số cây như dưa, cà chua, đậu nành,… thiếu SiO2 làm giảmmạnh năng suất quả và gây dị hình quả, các lá phát triển sớm, héo, lão suysớm, khử năng tạo chất lượng phấn giảm ảnh hưởng tới khả năng thụ phấn

Ngoài ra, nhiều nghiên cứu cho thấy SiO2 còn loại bỏ khả năng bị ngộđộc một số nguyên tố kim loại như mangan, nhôm và sắt

1.1.3 Các phương pháp tổng hợp nano TiO 2 và nano SiO 2

1.1.3.1 Phương pháp hóa ướt (wet chemical)

Bao gồm các phương pháp chế tạo vật liệu dùng trong hóa keo(colloidal chemistry), phương pháp thủy nhiệt, sol- gel và kết tủa Theophương pháp này, các dung dịch chứa ion khác nhau được trộn với nhau theomột tỷ phần thích hợp, dưới tác động của nhiệt độ, ánh sáng mà các vật liệunano được kết tủa từ dung dịch Sau quá trình lọc, sấy khô, ta thu được cácvật liệu nano

Ưu điểm của phương pháp hóa ướt là các vật liệu có thể chế tạo được rất

đa dạng, chúng có thể là vật liệu vô cơ, hữu cơ, kim loại Đặc điểm của phươngpháp này là rẻ tiền và có thể chế tạo được một khối lượng lớn vật liệu Nhưng

nó cũng có nhược điểm là các hợp chất có liên kết với phân tử nước có thể làmột khó khăn, phương pháp sol- gel thì không có hiệu suất cao

1.1.3.2 Phương pháp cơ học (mechanical)

Bao gồm các phương pháp tán, nghiền, hợp kim cơ học Theo phươngpháp này, vật liệu ở dạng bột được nghiền đến kích thước nhỏ hơn Ngày nay,các máy nghiền thường dùng là máy nghiền kiểu hành tinh hay máy nghiềnquay Phương pháp cơ học có ưu điểm là đơn giản, dụng cụ chế tạo không đắttiền và có thể chế tạo với một lượng lớn vật liệu Tuy nhiên nó lại có nhượcđiểm là các hạt bị kết tụ với nhau, phân bố kích thước hạt không đồng nhất,

dễ bị nhiễm bẩn từ các dụng cụ chế tạo và thường khó có thể đạt được hạt cókích thước nhỏ Phương pháp này được dùng để chế tạo vật liệu không phải

là hữu cơ như là kim loại

1.1.3.3 Phương pháp bốc bay

Gồm các phương pháp quang khắc (lithography), bốc bay chân không(vacuum deposition) vật lý, hóa học Các phương pháp này áp dụng hiệu quả đểchế tạo màng mỏng hoặc lớp phủ bề mặt, tuy vậy người ta cũng có thể dùng nó

để chế tạo hạt nano bằng cách chế tạo vật liệu từ đế Tuy nhiên phương pháp nàykhông hiệu quả lắm để có thể chế tạo ở quy mô thương mại

1.1.3.4 Phương pháp hình thành từ pha khí (gas-phase)

Gồm các phương pháp nhiệt phân (flame pyrolysis), nổ điện explosion), đốt laser (laser ablation), bốc bay nhiệt độ cao, plasma Nguyêntắc của phương pháp này là hình thành vật liệu nano từ pha khí Nhiệt phân làphương pháp có từ rất lâu, được dùng để chế tạo các vật liệu đơn giản nhưcarbon, silicon Phương pháp đốt laser thì có thể tạo được nhiều loại vật liệunhưng lại chỉ giới hạn trong phòng thí nghiệm vì hiệu suất của chúng thấp.Phương pháp plasma một chiều và xoay chiều có thể dùng để tạo rất nhiều vậtliệu khác nhau nhưng lại không thích hợp để tạo vật liệu hữu cơ vì nhiệt độcủa nó có thể lên đến 900oC Phương pháp hình thành từ pha khí dùng chủyếu để tạo lồng carbon (fullerene) hoặc ống carbon, rất nhiều các công tydùng phương pháp này để chế tạo mang tính thương mại

(electro-Có nhiều các phương pháp để chế tạo vật liệu nano, nhưng trong luận văn này, chúng tôi nghiên cứu chế tạo vật liệu nano bằng phương pháp sol-gel.

1.1.3.5 Phương pháp sol- gel

Trong những năm gần đây phương pháp sol-gel phát triển rất mạnh và

là một cụng cụ hữu hiệu cho công nghệ tổng hợp vật liệu nano

Phương pháp sol-gel do R.Roy đề xuất năm 1956 cho phép trộn lẫn cácchất ở qui mô nguyên tử do đó sản phẩm thu được có độ đồng nhất và độ tinhkhiết cao, bề mặt riêng lớn, sự phân bố kích thước hạt hẹp Sơ đồ tổng hợpoxit theo phương pháp sol-gel được biểu diễn trên hình:

Hình 1.5 Sơ đồ tổng hợp oxit bằng phương pháp

sol-gel Khái niệm về sol và gel

Sol: là hệ phân tán vi dị thể rắn phân tán trong lỏng, trong đó các

hạt của pha phân tán có kích thước d = 10-9 - 10-7 nm

Gel: là hệ phân tán vi dị thể lỏng phân tán trong rắn và rắn phân tán

trong lỏng

Trong đó: + Rắn: tạo thành khung ba chiều

+ Lỏng: nằm trong lỗ hổng của khung đó

Phương pháp sol-gel được phát triển rất đa dạng, có thể quy tụ theo

ba hướng chính sau:

- Thủy phân các muối

- Theo con đường tạo phức

- Thủy phân các alkoxide

Phương pháp sol-gel theo con đường thủy phân các alkoxide

Các alkoxide có công thức tổng quát là M(OR)n

Trong đó:

Mn+: là ion kim loại hoặc phi kim có tính ái điện tử

R: gốc alkyl (có thể no hoặc không no, mạch thẳng hay mạch nhánh).n: số oxi hóa của M

O: oxi được đính trực tiếp vào M

Các alkoxide phản ứng với nước rất mạnh theo phương trình sau:

M(OR)n + nH2O → M(OH)n + nROHTrong thực tế, phản ứng trên xảy ra rất phức tạp và được quy thành hai quá

trình chính là: quá trình thủy phân và quá trình ngưng tụ.

Quá trình thủy phân alkoxide M(OR) n

Quá trình thủy phân theo cơ chế thế ái nhân SN:

Giai đoạn (a) là cộng ái nhân (An), các tác nhân ái nhân (nucleophile)tấn công vào nhân Mn+ của alkoxide Giai đoạn (b) hình thành trạng tháichuyển tiếp Sau đó là giai đoạn (c) vận chuyển proton từ phân tử nước sangnhóm RO Giai đoạn (d) là giai đoạn loại rượu ROH Các quá trình trên xảy

ra thuận lợi khi:

- Tính chất ái nhân của phân tử đi vào (H2O) và tính chất ái điện tử của

Về cơ bản quá trình này giống quá trình thủy phân Nhiệt động học vàđộng học của phản ứng do cùng các thông số như đối với sự thủy phân chiphối.

Oxolation

Phản ứng tạo thành cầu nối oxo bằng cách loại phân tử nước:

Cơ chế này giống cơ chế alkoxolation nhưng R được thay thế bằng H

Như vậy bốn phản ứng: thủy phân, alkoxolation, oxolation, olationtham gia vào sự biến đổi alkoxide thành khung oxit Do đó cấu trúc, hình tháihọc của các oxit thu được phụ thuộc rất nhiều vào sự đóng góp tương đối củamỗi phản ứng Sự đóng góp này có thể tối ưu hóa bằng sự điều chỉnh điềukiện thực nghiệm liên quan đến:

- Thông số nội: bản chất của kim loại và các nhóm alkyl, cấu trúc của alkoxide

- Thông số ngoại: tỉ số thủy phân h = H2O/alkoxide, xúc tác, nồng độ, dung môi và nhiệt độ

Các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình sol-gel

- Bản chất của nguyên tố M

- Bản chất của nhóm alkyl: Tốc độ của phản ứng thủy phân phụ thuộc

rất nhiều vào bản chất của nhóm alkyl đối với alkoxide của Si và Ti kết quảnghiên cứu cho thấy khi kích thước của nhóm alkyl tăng lên thì tốc độ thủyphân giảm:

Ảnh hưởng của kích thước và cấu trúc của nhóm alkyl được giải thích bằng

sự cản trở không gian Nếu gốc R càng cồng kềnh thì sự xoay phân tử tạo điềukiện cho H2O tấn công vào nhân Si4+ càng khó khăn

- Tỉ số thủy phân (r): Tỉ số thủy phân r được tính bằng [H2O]/

[alkoxide] Nói chung khi r tăng thì tốc độ thủy phân tăng

- Xúc tác: Thường dùng xúc tác axít cho quá trình thủy phân, còn bazơ

cho quá trình ngưng tụ

- Dung môi: Dung môi được sử dụng làm môi trường hòa tan các chất

không trộn lẫn với nhau Khi dùng dung môi ta có thể kiểm soát được nồng

độ của các chất tham gia phản ứng

- Nhiệt độ: Thực nghiệm cho thấy, khi nhiệt độ tăng sẽ làm tăng sự

thủy phân và ngưng tụ và do đó thời gian gel hóa sẽ ngắn

1.2 TỔNG QUAN VỀ VI KHUẨN Bacillus subtilis

1.2.1 Giới thiệu chung về nhóm vi khuẩn PGPR

Vi khuẩn vùng rễ kích thích tăng trưởng thực vật (Plant growthpromoting rhizobacteria – PGPR) là những vi khuẩn phân bố tự do trong đất,sinh sống xung quanh hoặc trên bề mặt rễ, cộng sinh bên trong rễ, trực tiếphoặc gián tiếp tham gia việc kích thích sinh trưởng và phát triển của thực vậtthông qua sản xuất và tiết ra những chất hóa học khác nhau ở xung quanhvùng rễ Vì vậy, việc nghiên cứu sử dụng các chủng vi sinh vật nội sinh đểbảo vệ cây trồng là vấn đề rất quan trọng và đã được nhiều nước trên thế giớiquan tâm

Các PGPR nổi bật gồm thành viên của các chi Arthrobacter, Azoarcus, Azospirillum, Bacillus, Burkholderia, Enterobacter, Gluconacetobacter, Herbaspirillum, Klebsiella, Paenibacillus, Pseudomonas, Serratia,…

1.2.2 Vai trò PGPR trong kích thích sinh trưởng thực vật

Các nghiên cứu về vi khuẩn PGPR tập trung nhiều vào vai trò tăng khảnăng chống chịu với điều kiện môi trường khắc nghiệt của nhóm vi khuẩnPGPR Chaiharn và Lumyong đã phân lập được tổng cộng có 216 phân lập vikhuẩn hòa tan phosphate được phân lập từ đất trồng lúa khác nhau ở miền

Bắc Thái Lan [18] Những chủng này được sàng lọc invitro cho các hoạt động

thúc đẩy tăng trưởng thực vật của chúng như hòa tan phosphate vô cơ,amoniac (NH3), catalase và hoạt động enzyme làm thoái hóa tế bào Kết quảcho thấy 100% phosphate hòa tan vô cơ, 77,77% sản xuất NH3 và hầu hết cácchủng phân lập đều dương tính với catalase Ngoài ra, một số chủng cũng sản

sinh ra các enzim làm thoái hóa tế bào như protease (7%), chitinase (1%),cellulase (3%) và β-glucanase Các chủng phân lập có thể biểu hiện nhiều hơnhai hoặc ba đặc tính thúc đẩy tăng trưởng thực vật (PGP), có thể thúc đẩy tăngtrưởng thực vật trực tiếp hoặc gián tiếp Đặc biệt, nghiên cứu còn cho thấy,chủng Acinetobacter CR 1.8 có thể phát triển ở nồng độ muối lên tới 25%.

Gần đây, nghiên cứu hoạt động của hỗn hợp vi khuẩn nội sinh

Pseudomonas pseudoalcaligenes) và vi khuẩn vùng rễ (Bacillus pumilus) trên Oryza sativa L với cũng cho thấy phản ứng tốt trong việc chống lại các tác

động bất lợi của độ mặn [19]

Một nghiên cứu khác cũng cho thấy vai trò tương tự của PGPR Nghiên

cứu này đánh giá ảnh hưởng của khả năng chịu mặn của vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens NBRISN13 (SN13) trên cây lúa trong điều kiện thủy canh

và đất bị nhiễm mặn SN13 tăng khả năng sinh trưởng của thực vật và khảnăng chịu mặn (NaCl 200 mM) [20]

Hình 1.6 Các cơ chế đã biết của vi khuẩn PGPR Bacillus spp đối với cây

trồng [21] [22]

(1) Biofertilizer (cố định đạm, sản sinh siderophore và hòa tan P trong đất);

(2) Kiểm soát sinh học đối với các tác nhân gây bệnh cây trồng (đốikháng ức chế các tác nhân gây bệnh, sản sinh enzyme lytic và cơ chếkích kháng trên cây trồng)

- Sử dụng phân bón vi sinh đa chức năng với các vi khuẩn PlantGrowth-Promoting Rhizobacteria (PGPR) có khả năng tăng dinh dưỡng vàchức năng tự nhiên vốn có của đất trồng giúp tiết kiệm phân bón vô cơ vàtăng sức đề kháng tự nhiên của cây trồng dẫn tới giảm lượng thuốc BVTV sửdụng đối với cây trồng

- Vi khuẩn nội ký sinh thực vật (Endophytic bacteria) được tìm thấytrong hầu hết ở các loài thực vật, chúng cư trú ở trong nội mô của thực vật kýchủ và giữa chúng hình thành một loạt các mối quan hệ khác nhau như cộngsinh tương hỗ, công sinh dinh dưỡng, hội sinh Endophytic bacteria khi kếthợp chức năng PGPR sẽ thúc đẩy thực vật tăng trưởng, tăng năng suất vàđóng vai trò là một tác nhân điều hòa sinh học Endophytic PGPR bacteria sảnxuất hàng loạt các sản phẩm tự nhiên có lợi cho thực vật ký chủ mà ta có thểkhai thác những tác nhân đó để ứng dụng trong y học, nông nghiệp hay côngnghiệp Ngoài ra nó còn có tiểm năng loại bỏ các chất gây ô nhiễm trong đấtbằng cách tăng cường khả năng khử độc đồng thời có khả năng sản xuất sinhkhối và nhiên liệu sinh học

Hình 1.7 Hạt nano

Titanium-Bis-Ammonium-Lactato-Dihydrohyde (TiBALDH) [23]

(A); hạt nano CaptiGel trong dung môi hữu cơ

(B); hạt nano CaptiGel trong nước

(C); sự hình thành bề mặt phức của hạt nano Ti với các phospholipids

(D); phương trình phản ứng trên bền mặt hạt nano Ti và các phospholipids (E); sự hình thành những tập hợp vi khuẩn Bacillus spp từ sự kích ứng của hạt nano Ti (F).

1.2.3 Vi khuẩn Bacillus subtilis

1.2.3.1 Đặc điểm phân loại

Theo phân loại của Bergey (1994) thuộc:

Bộ: Eubacteriales Họ: Bacillaceae Giống: Bacillus Loài: Bacillus subtilis 1.2.3.2 Đặc điểm phân bố

B subtilis là vi khuẩn thường có mặt trong nước, đất, không khí, xác

bã thực vật thối rữa và cả trong đường tiêu hóa của người và động vật B subtilis hiện diện trong đất với một số lượng phổ biến là 106 – 107 CFU/g Vikhuẩn này có khả năng sinh bào tử để có thể chịu đựng các điều kiện nhiệt độkhắc nghiệt và những thay đổi bất lợi của môi trường sống Thông thường có

khoảng 60% số lượng B subtilis trong đất tồn tại ở trạng thái này [24].

1.2.3.3 Đặc điểm hình thái

B subtilis là trực khuẩn nhỏ, hai đầu tròn, bắt màu tím Gram dương,

kích thước 0.5 – 0,8 µm x 1,5 – 3 µm, đứng đơn lẻ hay tạo thành chuỗi ngắn

Vi khuẩn có khả năng di động, có 8 – 12 chiên mao, sinh bào tử hình bầu dục

nhỏ hơn tế bào vi khuẩn và nằm giữa tế bào Bào tử B subtilis phát triển bằng

cách nảy chồi do sự nứt của vỏ, không kháng acid, có khả năng chịu nhiệt,chịu ẩm, tia tử ngoại, phóng xạ,… [25]

Hình dạng của vi khuẩn trên môi trường TSA (Trypcase Soya Agar) làkhuẩn lạc dạng tròn, rìa răng cưa không đều, đường kính 3 – 5 mm, màuvàng xám, tâm sẫm màu Sau 1- 4 ngày bề mặt nhăn nheo, màu hơi ngả nâu

Trên môi trường canh TSB (Trypton Soya Broth), B subtilis phát triển làm

đục môi trường, tạo màng nhăn, lắng cặn kết lại như vẩn mây ở đáy, khó tankhi lắc đều

1.2.3.4 Đặc điểm sinh hóa [26]

Trong đó: + có hoạt tính - không có hoạt tính

1.2.3.5 Các chất kháng sinh do Bacillus subtilis tổng

hợp Subtilin

Subtilin có khả năng chịu nhiệt rất cao, không mất hoạt tính khi hấpautoclave ở pH 2, tác động của subtilin là ức chế sự phát triển của vi sinh vậtbằng cách gắn với màng nguyên sinh chất bằng tương tác giữa điện tử tự dosinh ra bởi sự dehydrate với các nhóm sulfhydyl trên màng nguyên sinh chấtlàm ảnh hưởng đến hệ thống vận chuyển các chất có trọng lượng phân tử nhỏ

và hệ thống trao đổi proton

TasA

TasA có phổ kháng khuẩn rộng được tổng hợp và tiết vào môi trường

30 phút sau khi quá trình tạo bào tử được bắt đầu, đồng thời TasA cũng đượcchuyển vào giữa lớp màng kép của tiền bào tử sau đó định vị trong lớp

petidoglycan vách của lõi bào tử, TasA giúp cho Bacillus subtilis chiếm ưu

thế trong quá trình tạo bào tử và nảy mầm

Surfactin

Surfactin có tính đối kháng mạnh với vi khuẩn, virut và kháng lại các tếbào ung thư nhưng ít tác động đối với nấm Tác động của surfactin làm ứcchế các kênh chuyển ion trên lớp màng lipid kép đồng thời ức chế hoạt tínhcủa một số enzyme

Bacilysocin

Bacilysocin là kháng sinh có bản chất phospholipid có tính kháng

khuẩn mạnh với nấm được phát hiện đầu tiên trên Bacillus subtilis.

1.2.3.6 Tính đối kháng của Bacillus

subtilis Với vi sinh vật gây bệnh

Hình thức đối kháng chủ yếu của Bacillus subtilis đối với vi sinh vật

gây bệnh là cạnh tranh dinh dưỡng và tiết kháng sinh Tác dụng chủ yếu củakháng sinh đối với vi khuẩn có thể biểu hiện ở 3 hướng chủ yếu sau:



Làm ngừng tổng hợp thành (màng) tế bào hay làm tan màng tế bào

vi khuẩn và do đó phá hủy tính chất thẩm thấu của tế bào, các ion Mg2+, Na+,

Ca2+ thoát ra ngoài, tế bào chết



Ảnh hưởng quá trình tổng hợp protein của vi khuẩn Chất kháng sinh

có thể phong bế quá trình tổng hợp protein bằng cách ngăn cản ribosome tổnghợp chuỗi polypeptid hay đưa đến tổng protein bất thường



Ảnh hưởng đối với acid acetic cụ thể là phá hủy sự trao đổi củaADN và ARN bằng cách ức chế men RNA polymerase hay gắn vào các baselàm đứt đoạn chuỗi xoắn kép ADN

Thực tế khi nuôi cấy nấm bệnh có sự hiện diện của Bacillus subtilis với

một số lượng lớn sẽ xảy ra cạnh tranh dinh dưỡng, cạnh tranh không giansinh sống giữa vi khuẩn và nấm Do vi khuẩn phát triển nhanh hơn (trong 24giờ) sẽ sử dụng phần lớn chất dinh dưỡng trong môi trường, đồng thời tạo ramột số loại kháng sinh nên sự sinh trưởng của nấm bị ức chế

Với đồng loại

Trong môi trường dinh dưỡng bị cạn kiệt, Bacillus subtilis đã tạo ra

chất kháng sinh giết chết những tế bào vi khuẩn bên cạnh chưa bắt đầu quátrình này nhằm tiêu thụ chất dinh dưỡng giải phóng từ các tế bào này với mụcđích kéo dài thời kỳ trước khi tạo bào tử

1.3 CÂY LÚA VÀ DƯA LƯỚI

1.3.1 Tổng quan về cây lúa

Nguồn gốc cây lúa