luận văn thạc sĩ tuyển chọn và nghiên cứu các đặc tính sinh học của một số vi sinh vật nhằm sản xuất phân vi sinh

Do vậy, đề tài “ Tuyển chọn và nghiên cứu các đặc tính sinh học của một số vi sinh vật nhằm sản xuất phân vi sinh " được đề xuất thực hiện nhằm giải quyết được một phần vấn đề có tính c

CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

Khoa: Công nghệ Sinh học

LUẬN VĂN THẠC SĨ: SINH HỌC THỰC NGHIỆM

HƯỚNG DẪN KHOA HỌC

Hướng dẫn 1: TS Nguyễn Thành Đức Hướng dẫn 2: TS Lê Thị Nhi Công

Hà Nội - 2019

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan bản luận văn này là kết quả nghiên cứu của cá

nhân tôi dưới sự hướng dẫn của TS Nguyễn Thành Đức và TS Lê Thị Nhi Công Các số liệu và tài liệu được trích dẫn trong luận văn là trung

thực Kết quả nghiên cứu này không trùng với bất cứ công trình nào đã được công bố trước đó

Tôi xin chịu trách nhiệm với lời cam đoan của mình./

Hà Nội, tháng năm 2019

Tác giả

Mai Thị Vân Khánh

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Học viện Khoa học và Công nghệ, Viện Di truyền Nông nghiệp, các thầy giáo, cô giáo đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi được học tập và hoàn thành khóa học này

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS Nguyễn Thành Đức - Viện Di truyền Nông nghiệp và TS Lê Thị Nhi Công - Viện Công nghệ

sinh học, đã tận tình giúp đỡ, hướng dẫn tôi hoàn thành luận văn này

Tôi xin được cảm ơn GS TS Đỗ Năng Vịnh và tập thể cán bộ

Phòng Thí nghiệm trọng điểm công nghệ tế bào - Viện Di truyền Nông nghiệp luôn động viên, giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi về cơ sở vật chất

- trang thiết bị để tôi có thể hoàn thành luận văn này

Luận văn được sử dụng một phần số liệu và kết quả thuộc chương

trình Nghị định thư với Cộng hòa Liên bang Đức: “Nghiên cứu sản xuất và

ứng dụng một số vật liệu mới (Chất hấp thụ, hạt cải tạo và vải địa kỹ thuật)

từ phế phụ phẩm mía đường và lúa để nâng cao giá trị gia tăng và phục vị nông nghiệp bền vững”, mã số: NĐT.22.GER/16 do GS.TS Đỗ Năng Vịnh

làm chủ nhiệm Tôi xin chân thành cám ơn

Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn vô cùng sâu sắc tới gia đình, bạn bè, đồng nghiệp những người đã luôn bên cạnh, động viên, góp ý cho tôi trong suốt quá trình học tập

Hà Nội, tháng năm 2019

Tác giả

Mai Thị Vân Khánh

10 NCBI Ngân hàng dữ liệu trình tự gen

11 DNA Phân tử mang thông tin di truyền

12 PCR Phản ứng chuỗi polymerase

13 Gauze I Môi trường Gauze bổ sung thêm bột CMC

14 AT Môi trường nuôi cấy thích hợp cho các chủng vi

khuẩn chi Azotobacter

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 3.1 Đặc điểm hình thái khuẩn lạc của các chủng vi sinh vật phân giải

xenlulo phân lập từ các mẫu đất thu thập 24

Bảng 3.2 Đặc điểm hình thái khuẩn lạc của các chủng VSV có khả năng cố định nitơ 26

Bảng 3.3 Đặc điểm hình thái khuẩn lạc của các chủng vi sinh vật có khả năng phân giải lân từ các mẫu đất thu thập 27

Bảng 3.4 Đặc điểm hình thái khuẩn lạc của các chủng VSV ( phân lập trên môi trường King B) 28

Bảng 3.5 Đánh giá hoạt tính phân giải xenlulo của các chủng vi sinh vật 30

Bảng 3.6 Khả năng cố định nitơ của các chủng vi khuẩn phân lập 32

Bảng 3.7 Đánh giá hoạt tính phân giải lân của các chủng VSV phân lập 33

Bảng 3.8 Đánh giá hoạt tính sinh IAA sau 48 h của các chủng vi khuẩn phân lập 35

Bảng 3.9 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa của chủng vi sinh vật phân giải xenlulo tuyển chọn 37 Bảng 3.10 Ảnh hưởng của nguồn cacbon khác nhau (glucose, sacharose, tinh bột, CMC) đến sinh trưởng, phát triển của chủng VSV 37

Bảng 3.11 Đặc điểm hình thái khuẩn lạc và hoạt tính sinh học của chủng X-VDT3 38 Bảng 3.12 Đặc điểm sinh học của chủng N-VDT10 38

Bảng 3.13 Đặc điểm hình thái khuẩn lạc và hoạt tính sinh học của chủng N-VDT10 39

Bảng 3.14 Điểm sinh học của các chủng vi sinh vật tuyển chọn 40

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ

Hình 3.1 Đánh giá hoạt tính phân giải xenlulo của các vsv phân lập (vòng tròn trong suốt bao quanh lỗ thạch) 31 Hình 3.2 Phản ứng màu của các chủng cố định N2 với thuốc thử Nessler 32 Hình 3.3 Vòng tròn trong suốt bao quanh khuẩn lạc của các vsv phân lập (trên môi trường chứa Ca 3 (PO 4 ) 2 ) 34 Hình 3.4 Khả năng sinh tổng hợp IAA thô của các chủng vi sinh vật 36 Hình 3.5 Cây phát sinh chủng loại của hai chủng X-VDT3 và X-VDT6 44

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT iii

DANH MỤC CÁC BẢNG iv

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ v

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU, SẢN XUẤT PHÂN BÓN HỮU CƠ VI SINH 3

1.1.1 Tình hình nghiên cứu phân bón trong sản xuất nông nghiệp 3

1.1.2 Tình hình sản xuất phân bón trong sản xuất nông nghiệp 5

1.1.3 Tình hình nghiên cứu, ứng dụng phân bón hữu cơ vi sinh trên thế giới 7

1.2 NHÓM VI SINH VẬT CÓ ÍCH PHỤC VỤ SẢN XUẤT PHÂN BÓN VI SINH 10

1.2.1 Vi sinh vật cố định đạm 10

1.2.2 Vi sinh vật phân giải lân 10

1.2.3 Vi sinh vật phân giải xenlulo 11

1.2.4 Vi sinh vật sinh hocmon sinh trưởng thực vật 13

1.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU, ĐỊNH DANH VI SINH VẬT 14

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17 2.1 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 17

2.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 17

2.2.1 Phân lập và lưu giữ các chủng vi sinh vật từ mẫu đất 17

2.2.2 Tuyển chọn và đánh giá các hoạt tính sinh học của các chủng vi sinh vật có ích 17

2.2.3 Định danh chủng vi sinh vật phân giải xenlulo 17

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17

2.3.1 Phương pháp phân lập và lưu trữ các chủng vi sinh vật 17

2.3.2 Phương pháp xác định định tính hoạt tính CMC- aza (Williams,

1983) 19

2.3.3 Phương pháp đánh giá hoạt tính cố định nitơ của vi sinh vật 19

2.3.4 Phương pháp tuyển chọn vi sinh vật phân giải phốt pho 20

2.3.6 Phân loại vi sinh vật 23

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 24

3.1 PHÂN LẬP VÀ LƯU GIỮ CÁC CHỦNG VI SINH VẬT TỪ MẪU ĐẤT 24 3.1.1 Vi sinh vật phân giải xenlulo 24

3.1.2 Vi sinh vật cố định nitơ 25

3.1.3 Vi sinh vật phân giải lân 27

3.1.4 Vi sinh vật kích thích sinh trưởng thực vật 28

3.2 ĐÁNH GIÁ CÁC HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CÁC CHỦNG VI SINH VẬT CÓ ÍCH 29

3.2.1 Đánh giá hoạt tính phân giải xenlulo 29

3.2.2 Đánh giá hoạt tính cố định Nitơ 31

3.2.3 Đánh giá khả năng phân giải Phốt pho (lân) khó tiêu 33

3.2.4 Đánh giá khả năng sinh IAA của các chủng vi sinh vật 35

3.3 ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CÁC CHỦNG VI SINH VẬT CÓ ÍCH PHỤC VỤ SẢN XUẤT PHÂN BÓN VI SINH 36

3.4 ĐỊNH DANH CHỦNG VSV PHÂN GIẢI XENLULO BẰNG PHƯƠNG PHÁP GIẢI TRÌNH TỰ GENE RNA RIBOXOM ĐẶC TRƯNG CHO LOÀI 40

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 45

4.1 KẾT LUẬN 45

4.2 KIẾN NGHỊ 45

TÀI LIỆU THAM KHẢO 46

MỞ ĐẦU

1 Lý do chọn đề tài

Với lợi thế là đất nước nông nghiệp, Việt Nam có tiềm năng rất lớn

về nguồn phế phụ phẩm trồng trọt từ các cây trồng chính( lúa, ngô, mía, lạc, đậu tương ), riêng mía lượng bã bùn mía sau chế biến đường là rất lớn, mỗi năm diện tích trồng mía khoảng 257.546 ha, sản lượng ép là 15,76 triệu tấn mía cây, trong sản xuất đường sẽ sinh ra một lượng phế thải khổng lồ: 2,5 triệu tấn bã mía, 500.000 tấn bã bùn (sau khi đã lấy nước đường) và 250.000 tấn mật rỉ Trước đây 80% lượng bã mía này được dùng để đốt lò hơi trong các nhà máy sản xuất đường, sinh ra 50.000 tấn tro và 20% còn lại (khoảng 500.000 tấn) được dùng làm ván ép, còn mật rỉ dùng sản xuất cồn, mỳ chính hoặc các công nghệ vi sinh khác như chế biến thành thức ăn chăn nuôi Riêng tro, đặc biệt là bã bùn không sử dụng phải đổ bỏ gây ô nhiễm môi trường nghiêm trọng, vì trong bã bùn mía có chứa một lượng dinh dưỡng cao như đạm, lân, lưu huỳnh và canxi, nếu được sử dụng làm nguồn phân hữu cơ thì rất tốt cho cây trồng, đặc biệt là cây mía Đứng trước tình hình đó, đã có nhiều giải pháp được đặt ra như sử dụng nguồn chất thải này làm thức ăn chăn nuôi, nhưng chỉ sử dụng những loại bã mía sạch, chất lượng tốt nên vẫn chưa giải quyết được bã bùn (nguyên nhân chính gây hôi thối khi đổ ra ngoài môi trường)

Một giải pháp được coi là khả quan nhất xét cả về mặt kinh tế và môi trường đó là sử dụng bã bùn mía làm phân hữu cơ vi sinh Vì giải pháp này

sẽ trả lại một lượng hữu cơ quan trọng cho đất trồng mía Theo tính toán để trồng được 250.000 ha mía, ngoài phân bón vô cơ (đạm - lân - kali) tối thiểu phải bón 4 - 5 tấn phân chuồng cho 1 ha, tức là phải có 1 triệu tấn phân chuồng bón cho 250.000 ha Tuy nhiên, để sử dụng hiệu quả bã bùn mía thì việc xử lý nguyên liệu này bằng các chủng vi sinh vật là rất quan trọng Trong chất thải nhà máy mía đường thì thành phần của bã thải là bã bùn, váng bọt (chiếm 1 - 4% so với cây mía), chất xơ, đường, protein, lipit,… đây là thành phần rất tốt cho phân hữu cơ vi sinh, việc nghiên cứu, tuyển chọn vi sinh vật phân giải bã bùn mía là rất cần thiết

Do vậy, đề tài “ Tuyển chọn và nghiên cứu các đặc tính sinh học của một số vi sinh vật nhằm sản xuất phân vi sinh " được đề xuất thực hiện

nhằm giải quyết được một phần vấn đề có tính cấp thiết, mang tính khoa học và thực tiễn cao Kết quả thu được của đề tài sẽ cung cấp một số nhóm

chủng vi sinh vật có ích với hoạt tính mạnh cho quá trình sản xuất phân bón

vi sinh, phân bón hữu cơ vi sinh hay chế phẩm vi sinh, các chủng lưu giữ với danh tính rõ ràng, thuận tiện trong quá trình lưu giữ và sử dụng sau này

2 Mục tiêu của đề tài

Phân lập và xác định đặc điểm sinh học của 2 - 3 chủng vi sinh vật

có khả năng phân giải xenlulo, cố định đạm, phân giải lân khó tiêu, sinh hocmon sinh trưởng thực vật

3 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

- Đối tượng nghiên cứu là các chủng vi sinh vật được phân lập mới

từ các mẫu đất thu thập tại các ruộng lúa, ruộng mía ở các tỉnh Hà Tĩnh, Nghệ An, Thanh Hóa

- Phạm vi nghiên cứu: tuyển chọn các chủng vi sinh vật có hoạt tính mạnh trong phân hủy xenlulo, phân giải lân khó tiêu, cố định đạm và sinh hocmon sinh trưởng thực vật nhằm ứng dụng các chủng vi sinh này trong sản xuất phân bón hữu cơ vi sinh Đồng thời ứng dụng sinh học phân tử trong định danh các chủng vi sinh vật phân lập được

4 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài nghiên cứu

- Đề tài góp phần tuyển chọn, định danh một số chủng vi sinh vật có

có hoạt tính cao phục vụ sản xuất phân bón hữu cơ vi sinh

- Đề tài góp phần định danh chính xác tên loài một số chủng vi sinh vật phục vụ sản xuất phân bón hữu cơ vi sinh

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU, SẢN XUẤT PHÂN BÓN HỮU CƠ VI SINH

1.1.1 Tình hình nghiên cứu phân bón trong sản xuất nông nghiệp

Hiện nay, các nước đang phát triển có xu hướng sử dụng ngày càng tăng lượng phân bón hóa học và Việt Nam cũng nằm trong xu thế này Tuy nhiên, việc dùng quá nhiều phân đạm (N) tới mức lạm dụng đã làm tăng dần sự mất cân đối các dưỡng chất trong đất ảnh hưởng đến năng suất và chất lượng nông sản Đồng thời dùng lượng N quá cao sẽ gây khó khăn trong việc bảo quản nông sản cũng như tích lũy NO3- trong rau và các loại cây thực phẩm sẽ là nguy cơ đe dọa sức khỏe con người và vật nuôi Ngoài

ra, theo các nhà khoa học thì khí N2O gây hiệu ứng nhà kính lớn hơn khí

CO2 gấp 300 lần Trong sản xuất nông nghiệp, một lượng đáng kể N bị thất thoát vào không khí khi bón đạm Ure hoặc Sulphate Amon (SA), gây lãng phí và gia tăng hiệu ứng nhà kính

Muốn khai thác có hiệu quả tiềm năng dinh dưỡng của đất trồng nông nghiệp nhằm hạn chế dần việc bón bổ sung những loại phân hóa học hay các loại khoáng vô cơ khác, hạn chế tối đa những ảnh hưởng không tốt đến biến đổi khí hậu mà do chính quá trình sản xuất nông nghiệp gây ra; các nhà khoa học trong lĩnh vực trồng trọt đã nghiên cứu và cho ra đời một số công nghệ vi sinh và công nghệ enzyme

Mặt khác, một số chủng vi sinh còn có vai trò đối kháng với các loài

vi sinh có hại (gây bệnh cho cây), ức chế hoặc tiêu diệt những loại vi sinh vật này giúp cây phát triển tốt hơn Có thể ví dụ một số loại vi sinh có lợi

đã được đưa vào công nghệ sản xuất phân bón như: Vi sinh vật cố định

đạm (Rhizobium, Bradyrhizobium), vi sinh vật cố định nitơ tự do (A

chroococcum, P tinctorius), vi sinh vật phân giải lân (Pseudomonas sp, Achromobacter sp, A polymixa), vi sinh vật kích thích sinh trưởng (E cloaceae, A radiobacter, A bejerinckii, E Aerogenes), vi sinh vật đối

kháng vi khuẩn, nấm bệnh (B subtilis, Pseudomonas sp, Bacillus sp) Ngoài ra còn có một số chủng vi sinh vật có lợi khác như: Bacillus

licheniformis, Bacillus subtilis, Lactobacillus acidophilus, Pseudomonas putida, Saccharomyces cerevisiace

Các vi sinh vật trong đất, đặc biệt là vi sinh vật vùng rễ có vai trò đặc biệt quan trọng với cây trồng, chúng tạo thành mối quan hệ hữu cơ, gắn bó trong một thể thống nhất Quá trình mặn hóa, phèn hóa hiện đang làm giảm

rõ rệt số lượng vi sinh vật trong đất, đặc biệt là các nhóm vi sinh vật có ích như cố định nitơ, phân giải hữu cơ, phân giải lân, sinh các chất kích thích sinh trưởng thực vật,…và gián tiếp gây giảm năng suất cây trồng, nhất là cây lúa Như vậy cần phải bổ sung lại những nhóm vi sinh vật có ích này

thông qua các loại phân bón vi sinh vật chức năng

Trong những năm vừa qua, mặc dù đã có một số nghiên cứu liên quan đến phân bón hữu cơ đựơc thực hiện bởi các đơn vị nghiên cứu trong và ngoài nước nhưng vẫn cón rất ít về số lượng Ngoài các nghiên cứu về hiệu lực, hiệu quả của phân bón hữu cơ, các đề tài, dự án nghiên cứu còn tập trung vào tìm kiếm, tuyển chọn các sản phẩm phân hữu cơ, đặc biệt là phân hữu cơ vi sinh để phục vụ sản xuất nông nghiệp Một số đề tài có giá trị phải kể đến như: “Nghiên cứu, sản xuất phân hữu cơ vi sinh đa chức năng đặc chủng cho cây cao su vùng Tây Bắc từ than bùn và phế phụ phẩm nông nghiệp” của Viện Thổ nhưỡng Nông hóa; “Đánh giá ảnh hưởng của một số loại phân hữu cơ đến năng suất và hàm lượng nitrat trong rau trên đất xám” của Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp miền Nam; “ Nghiên cứu phân vùng địa lý sinh thái hiệu lực phân bón Việt Nam” do Giáo sư Võ Tòng Xuân chủ trì Có thể thấy công tác nghiên cứu khoa học trong lĩnh vực phân bón nói chung và phân bón hữu cơ nói riêng chưa được quan tâm đầu

tư đúng mức Nhìn lại danh mục các nghiên cứu về phân bón thì phần lớn

là quá cũ hoặc chỉ thông qua các dự án hợp tác quốc tế Trong mười năm 2006-2016 chỉ có 03 đề tài nghiên cứu cấp Bộ có liên quan đến phân bón, trong đó có 2 đề tài về xử lý phế phụ phẩm và 01 đề tài vi sinh vật Đối với

đề tài cấp nhà nước, trong thời gian 10 năm kể trên chỉ có 02 đề tài nghiên cứu cấp nhà nước về lĩnh vực này

Bên cạnh đó, việc nghiên cứu chưa đi liền với thực tế phát triển ngành phân bón, chưa phục vụ hiệu quả cho công tác quản lý nhà nước Hiện tại vẫn còn thiếu rất nhiều nghiên cứu mang tính bài bản, hệ thống về mối liên

hệ giữa tính chất đất và nhu cầu phân bón đặc thù cho từng loại đất, vùng đất; về nhu cầu phân bón phù hợp, đặc thù với các loại đất khác nhau, trên

các loại cây trồng khác nhau và ở các giai đoạn sinh trưởng phát triển phân bón mới thì việc đánh giá tác động môi trường và tác động đến sức khỏe của con người thông qua chất lượng nông sản còn chưa được quan tâm đúng mức Chưa có nghiên cứu bài bản, hệ thống nào về hiệu suất sử dụng phân bón, thất thoát dinh dưỡng và các biện pháp khắc phục Việc chuyển giao các tiến bộ kỹ thuật mới thông qua hệ thống khuyến nông để khuyến khích, hướng dẫn người dân sử dụng phân bón hữu cơ còn hạn chế Tính đến thời điểm hiện tại, rất ít dự án khuyến nông về phân bón hữu cơ được triển khai

1.1.2 Tình hình sản xuất phân bón trong sản xuất nông nghiệp

Ở Việt Nam phân bón hữu cơ hiện nay được sản xuất trong nước theo hai phương thức là ủ truyền thống và sản xuất công nghiệp Phương thức ủ truyền thống được sử dụng chủ yếu ở quy mô nông hộ dựa trên nguồn nguyên liệu là chất thải hay các phế phụ phẩm cây trồng thu gom từ chăn nuôi và trồng trọt tại nông hộ Các phế phụ phẩm hữu cơ được trộn đều, đồng thời có thể bổ sung thêm các nguyên tố khoáng và chế phẩm vi sinh vật sau đó ủ thành đống với mục đích di trì nhiệt độ hình thành trong đống

ủ để thúc đẩy quá trình phân hủy chất hữu cơ, đẩy nhanh quá trình khoáng hóa và tiêu diệt các sinh vật gây bệnh cho người, vật nuôi, cây trồng Phương thức sản xuất công nghiệp áp dụng tại các cơ sở sản xuất phân bón được đầu tư cơ sở hạ tầng, dây chuyền máy thiết bị với quy mô công suất lớn nhỏ khác nhau (từ 20.000 đến 500.000 tấn)

Hiện nay, cả nước có 180 doanh nghiệp đã được cấp Giấy phép sản xuất phân bón hữu cơ, chiếm 24,5% so với tổng số Giấy phép sản xuất mà

Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn và Bộ Công thương đã cấp (735 Giấy phép) Tổng công suất của các cơ sở sản xuất phân bón hữu cơ là 2,5 triệu tấn/năm, chiếm 8,5% so với tổng công suất các cơ sở sản xuất phân bón trong nước (29,5 triệu tấn/năm) và bằng gần 1/10 so với công suất sản xuất phân bón vô cơ (26,7 triệu tấn/năm)

Giai đoạn 2015-2017, Việt Nam xuất khẩu phân bón hữu cơ đến 34 quốc gia khác nhau với khối lượng tăng mạnh trong hai năm 2016 và 2017

Cụ thể, khối lượng xuất khẩu năm 2017 xấp xỉ 76.000 tấn, tăng hơn 6 lần

so với năm 2015 (12.000 tấn) Về doanh nghiệp xuất khẩu: Năm 2015 mới chỉ có 2 doanh nghiệp xuất khẩu phân bón hữu cơ, năm 2016 là 12 doanh

nghiệp, đến năm 2017 đã có 19 doanh nghiệp tham gia xuất khẩu phân bón hữu cơ, chủ yếu là Công ty Cổ phần hữu hạn VEDAN Việt Nam (gần 68.000 tấn), Công ty TNHH MTV Quế Lâm Phương Bắc (xấp xỉ 3.900 tấn), Công ty cổ phần Sê Công (trên 2.000 tấn) còn lại là các doanh nghiệp khác xuất khẩu từ 7-504 tấn Về chủng loại: Năm 2015 có 17 sản phẩm phân bón hữu cơ được xuất khẩu, năm 2016 tăng lên 56 sản phẩm và năm

2017 đã có tổng cộng 75 sản phẩm phân bón hữu cơ được xuất khẩu ra nước ngoài Trong số đó, chủ yếu là phân bón hữu cơ (42 sản phẩm với khối lượng xấp xỉ 60.000 tấn), phân bón hữu cơ khoáng (20 sản phẩm với khối lượng trên 9.500 tấn), phân bón hữu cơ vi sinh (11 sản phẩm với khối lượng xấp xỉ 6.500 tấn) và một lượng ít phân bón khoáng hữu cơ

Khối lượng phân bón hữu cơ nhập khẩu trong 3 năm gần đây đều đã tăng đáng kể Cụ thể, khối lượng nhập khẩu năm 2017 là khoảng 220.000 tấn, tăng gấp đôi so với năm 2016 (xấp xỉ 102.000 tấn) Trong số đó, phải

kể đến phân bón vi sinh vật, khối lượng nhập hẩu năm 2017 (617 tấn) tăng gần 5 lần so với năm 2015 (126 tấn) và tăng gần 2 lần so với 2016 (319 tấn) Khối lượng nhập khẩu phân bón hữu cơ sinh học năm 2017 (xấp xỉ 117.000 tấn) tăng gần 8 lần so với năm 2016 (xấp xỉ 15.000 tấn) Đặc biệt, năm 2017 Việt Nam đã bắt đầu nhập khẩu phân bón hữu cơ cải tạo đất với khối lượng 105 tấn (Báo cáo: Thực trạng và giáp pháp phát triển phân bón hữu cơ, 2018)

Thời gian qua, các nhà khoa học trong cả nước đã nghiên cứu và sản xuất thành công rất nhiều loại phân hữu cơ vi sinh nhằm cải tạo đất và chăm sóc cây trồng Kết quả thử nghiệm tại các vùng sản xuất cho thấy, các sản phẩm phân bón hữu cơ vi sinh này có tác dụng tích cực đến việc nâng cao năng suất, chất lượng nông sản, đồng thời có tác dụng tăng độ phì nhiêu đất và bảo vệ môi trường sinh thái Một số loại phân hữu cơ vi sinh điển hình như: HUĐAVIL; HN 2000; Omix; Vi sinh tổng hợp Biomic –C; Phân hữu cơ vi sinh vật chức năng, VTN1; VTN2 và VTN3 v v

Phân bón hữu cơ vi sinh đã được nghiên cứu từ lâu, song do yếu tố chủ quan và khách quan khác nhau nên mức độ ứng dụng cho đến nay vẫn còn nhiều hạn chế Đặc biệt, các loại phân chuyên dụng cho từng loại cây còn rất ít, hơn nữa các loại phân vi sinh này mới chỉ được sản xuất từ một số loại vi sinh vật và nguyên liệu nhất định (cố định nitơ cộng sinh- Nitragin,

Rhizoda cố định nitơ hội sinh, tự do- Azogin, Rhizolu phân giải lân ), hiệu quả sử dụng của các loại phân bón này ở các địa phương khác nhau là không giống nhau Nguyên nhân của hiện tượng này là do sự phong phú, đa dạng của hệ vi sinh vật đất và tác động qua lại nhiều chiều của các vi sinh vật với nhau, của vi sinh vật với cây trồng và điều kiện môi trường Ở Việt Nam, Viện Thổ nhưỡng Nông hóa – Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam là cơ quan đầu mối về quỹ gen vi sinh vật nông nghiệp, hiện đang lưu giữ và bảo quản trên 600 chủng vi sinh vật các loại phục vụ cho sản xuất phân bón vi sinh, các chế phẩm bảo vệ thực vật và xử lý môi trường

Hiện nay, ở nước ta có nhiều cơ sở sản xuất nhiều loại phân hỗn hợp từ than bùn Trên thị trường có các loại phân hỗn hợp với các tên thương phẩm sau đây: Biomix (Củ Chi), Biomix (Kiên Giang), Biomix (Plâyku), Biofer (Bình Dương), Komix (Thiên Sinh), Komix RS (La Ngà), Compomix (Bình Điền II), phân hữu cơ sinh học và hữu cơ vi sinh Quế Lâm, phân lân hữu cơ sinh học sông Gianh và nhiều loại phân lân hữu cơ sinh học ở nhiều tỉnh phía Bắc

1.1.3 Tình hình nghiên cứu, ứng dụng phân bón hữu cơ vi sinh trên thế giới

Tại tỉnh Quảng Đông, Trung Quốc tình hình sử dụng phế phụ phẩm nông nghiệp ủ thành phân bón hữu cơ trong sản xuất nông nghiệp tăng dần Khoảng 77% nông dân sử dụng 60% sản phẩm phụ của cây trồng vụ trước cho các cây trồng vụ sau, 18% hộ nông dân sử dụng 90% sản phẩm phụ cho cây trồng vụ sau Trong rơm rạ chứa khoảng 0,6% N, 0,1% P, 0,1% S, 1,5% K, 5% Si và 40% C Rơm rạ là nguồn sẵn có với số lượng dao động

từ 2-10 tấn/ha nên đó là nguồn cung cấp dinh dưỡng cho cây Gần như tất

cả K và 1/3 N, P, S nằm trong rơm rạ Do vậy, rơm rạ chính là nguồn cung cấp chất dinh dưỡng rất tốt cho cây (Bell và Edwards, 1989)[1] Viện Lân và Kali của Canada (1995) xác nhận 80% tổng số kali cây lấy đi nằm trong xác, bã cây Nếu các xác bã thực vật này được hoàn lại cho đất đã canh tác thì chúng sẽ cung cấp một lượng kali đáng kể cho các cây trồng vụ sau Các vùng trồng mía lớn trên thế giới (Ấn Độ, Trung Quốc, Cuba, ) cũng có cách thức trả lại ngọn lá mía cho đất để làm dinh dưỡng cho vụ sau thông qua kỹ thuật ủ tạo phân hữu cơ Van Dillewijn (1952) phân tích thấy bộ phận ngọn và lá mía chiếm 62% N, 50% P2O5 và 55% K2O trong tổng số

của bộ phận thu hoạch Như vậy có nghĩa 4 nếu trả lại ngọn lá mía bón lại cho vụ sau thì cung cấp một lượng dinh dưỡng tương đối lớn cho cây (Van Dillewijn, 1952)[1] Các nghiên cứu, áp dụng công nghệ EM đạt được kết quả một cách rộng rãi trong lĩnh vực xử lý môi trường, chế biến thức ăn chăn nuôi, chế biến phân bón vi sinh cho cây trồng Qua các báo cáo khoa học tại các Hội nghị Quốc tế về công nghệ EM cho thấy công nghệ

EM có thể gia tăng cân bằng sinh quyển, tính đa dạng của đất nông nghiệp, tăng chất lượng đất, khả năng sinh trưởng, chất lượng sản phẩm nông nghiệp Vì thế, các nước trên thế giới đón nhận EM là một giải pháp để đảm bảo cho một nền nông nghiệp phát triển bền vững và bảo vệ môi trường Nhiều nhà máy, xưởng sản xuất EM đã được xây dựng ở nhiều nước trên thế giới và đã sản xuất được hàng ngàn tấn EM mỗi năm như: Trung Quốc, Thái Lan (hơn 1000 tấn/năm), Myanmar, Nhật Bản, Brazil (khoảng 1.200 tấn/năm), Srilanca, Nepal, Indonesia (khoảng 50 - 60 tấn/năm) (Erangelista và Urriza, 1999)[3] Trong nền nông nghiệp cổ truyền của các nước trên thế giới cũng như ở Việt Nam và các nước Asian, phân hữu cơ không chỉ cung cấp dinh dưỡng cho cây trồng với hàm lượng vốn

có của nó mà còn đóng vai trò quan trọng trong việc cải thiện các đặc tính

lý hoá học của đất thông qua vai trò của vật chất hữu cơ Do đó hiện nay phân hoá học được coi là yếu tố quan trọng để đẩy năng suất cây trồng nên

xu hướng sử dụng phân hoá học vẫn ngày càng tăng Nhưng phân hữu cơ nói chung và phân hữu cơ vi sinh nói riêng vẫn đóng vai trò quan trọng trong sản xuất nông nghiệp bền vững và bảo vệ môi trường ở các nước nhiệt đới cũng như là ở các nước phát triển Hiện nay do nhu cầu của thị trường mà ngành chăn nuôi ở nước ta đã có những thay đổi, nguồn phân hữu cơ sử dụng trong nông nghiệp đang có chiều hướng giảm dần do lượng chất độn chuồng giảm Trong khi đó nguồn phế phụ phẩm từ nông nghiệp như rơm rạ, thân lá ngô, sắn, tế guột thường bị đốt ngay tại chỗ sau khi thu hoạch, gây ảnh hưởng tới môi trường và làm thất thoát một lượng đáng

kể các chất dinh dưỡng từ phụ phẩm nông nghiệp Tác giả Tabagari và các cộng tác viên (1987) dẫn theo Đinh Thị Ngọ (Đinh Thị Ngọ, 1996)[4], nghiên cứu dùng than bùn để tủ gốc cho chè trên đất Podzolic cho thấy: cây chè được tủ bằng than bùn có sinh khối phần trên mặt đất cao nhất, sau đó đến tủ gốc bằng màng mỏng 5 PE màu đen, công thức đối chứng không tủ cho sinh khối thấp nhất Trọng lượng bộ rễ đặc biệt là rễ hút tăng 63% ở công thức tủ bằng than bùn, tăng 27% ở công thức tủ bằng màng mỏng PE

màu đen (so với đối chứng), lượng rễ hút phân bố nhiều ở tầng đất 0 – 10cm (công thức tủ bằng than bùn chiếm 46%, công thức tủ bằng màng mỏng PE màu đen chiếm tới 64%, công thức không tủ chỉ có 7%) Nghiên cứu dài hạn về ảnh hưởng của việc sử dụng nguồn phụ phẩm nông nghiệp (đã xử lý thành phân bón hữu cơ) trên đất phiến thạch sét tại Brazil sau 17 năm đã chỉ ra rằng, trong công thức luân canh với sử dụng tối đa nguồn hữu cơ từ thân lá ngô và cây họ đậu đã làm tăng hàm lượng các bon trong tầng đất mặt (0-17,5 cm) 24% và đạm tổng số tăng 15% và hàm lượng kali

dễ tiêu cũng tăng 5% so với đối chứng với công thức đối chứng độc canh hai vụ ngô (Diekow, 2005)[5] Ảnh hưởng của vùi phụ phẩm nông nghiệp (chưa qua xử lý cũng như đã xử lý thành phân bón hữu cơ) đến năng suất cây trồng ở vùng bán khô hạn của Ấn Độ chỉ ra rằng sinh khối tăng 25,3 %

và năng suất hạt tăng 9,2 % so với công thức đối chứng Ngoài ra sử dụng phế phụ phẩm còn có thể tiết kiệm được 50% lượng phân hoá học, giảm chi phí cho người dân trong sản suất (Heman và Singh, 1992)[6] Nhật Bản cũng khuyên nông dân trồng chè của mình nên tận dụng nguồn phế phụ phẩm nông nghiệp làm phân bón hữu cơ cho cây chè để tăng hàm lượng mùn trong đất (Taton, 2005)[7] Nguồn Carbon hữu cơ trong đất có thể được cải thiện trong suốt quá trình bón phân hữu cơ Từ năm 1992 - 1997, Quỹ Kellogg, W K tài trợ thử nghiệm bón phân hữu cơ được bổ sung thêm một

số loài vi sinh vật có ích thuộc 2 chi: Bacillus, Pseudomonas có khả năng

phân giải lân, kali tại 2 vùng trồng chè trọng điểm của Srilanca và nhận thấy năng suất chè tăng 9 – 14% so với đối chứng có bón phân hữu cơ và tăng 17% so với đối chứng không sử dụng 2 loại phân bón này (Kellogg, 1997)[8] Kết quả thí nghiệm của Christian Bruns và Christian Schüler năm

2000 cũng cho thấy nếu phân hữu cơ (làm từ phân người, gia súc và cây

xanh) có bổ sung thêm Bacillus subtilus, Lactobaccillus rhammossus,

Bacillus polymyxa bón cho chè thì chất hòa tan trong chè tăng từ 47,31%

(chỉ bón phân hữu cơ) lên 51,01% (bón phân hữu cơ vi sinh) (Christian Bruns và Christian Schüler, 2000)[9] Đã có nhiều biện pháp xử lý rác thải nông nghiệp như đốt, chôn lấp, ủ phân phân hữu cơ vi sinh Ở Australia, Pháp, Indonesia, Malaysia, Miến Điện, Philippine, Tây Ban Nha và Thái Lan, phụ phẩm nông nghiệp thường được đem đốt Các nước Mỹ, Đức, Italia xử lý bằng cách chôn vùi chiếm 60-80% Bên cạnh việc sử dụng nguồn rác thải nông nghiệp để làm nhiên liệu, trong nuôi trồng thủy sản,

công nghiệp sản xuất đồ gốm, công nghiệp sản xuất silic Đa số lượng rác thải còn lại được đốt bỏ không sử dụng

1.2 NHÓM VI SINH VẬT CÓ ÍCH PHỤC VỤ SẢN XUẤT PHÂN BÓN

VI SINH

1.2.1 Vi sinh vật cố định đạm

Cố định đạm hay cố định nitơ là một quá trình mà nitơ (N2) trong khí quyển được chuyển đổi thành amoni (NH4+). Nitơ trong khí quyển hoặc phân tử khí nitơ (N2) tương đối trơ, tức là nó không dễ dàng phản ứng với các hóa chất khác để tạo ra hợp chất mới Quá trình cố định phân giải các phân tử nitơ dạng hai nguyên tử (N2) thành các nguyên tử

Cố định đạm trong tự nhiên và tổng hợp, là quá trình cần thiết cho tất

cả các hình thái của sự sống bởi vì nitơ là cần thiết để sinh tổng hợp các yếu tố cấu tạo cơ bản của thực vật, động vật và các hình thái sự sống khác;

ví dụ, nucleotide trong DNA và RNA và các axit amin trong protein Do

đó, cố định đạm cần thiết trong nông nghiệp và sản xuất phân bón Đây cũng

là một quá trình quan trọng trong sản xuất thuốc nổ (ví dụ như thuốc súng, thuốc nổ TNT, v.v) Cố định đạm tự nhiên trong không khí là nhờ tia sét

Cố định đạm cũng gồm những dạng chuyển đổi sinh học khác của nitơ, chẳng hạn như chuyển đổi sang nitơ điôxit (NO2) Vi sinh vật có thể cố định được nitơ là những sinh vật nhân sơ (cả vi khuẩn và vi khuẩn cổ) gọi chung là các vi khuẩn cố định đạm (diazotroph) Một số thực vật bậc cao,

và một số động vật (mối), đã có những hình thức cộng sinh với các vi khuẩn (diazotroph) này

Nhiều nghiên cứu cho thấy các nhóm vi sinh vật trong đất có khả năng hòa tan lân khó tan và phóng thích lân dễ tan cho cây trồng do chúng có khả năng tổng hợp và phóng thích các acid hữu cơ và trực tiếp hòa tan lân khó tan thành lân dạng dễ hấp thu Khi sử dụng các loài vi sinh vật nầy sản xuất phân sinh học bón cho cây trồng đã giúp tăng năng suất một cách rất

có ý nghĩa

1.2.2 Vi sinh vật phân giải lân

Photpho là nguyên tố quan trọng thứ 2 trong 3 nguyên tố dinh dưỡng đa lượng chính của cây trồng (N, P,K), là thành phần của axit nucleic, phytin, photpholipit Photpho có tác động trực tiếp đến quá trình tích lũy đường, protein, lipid, vitamin… của cây trồng Đặt biệt photpho là thành phần không thể thiếu của ATP, ADP, AMP (phân tử trao đổi năng lượng), kiểm soát, điều khiển quá trình trao đổi năng lượng của cây (hô hấp, quan hợp ) Photpho có tác dụng thúc đẩy phát triển và tăng khả năng chống chịu của cây trồng Thiếu photpho, sự hình thành tế bào mới bị chậm lại, cây còi cọc

ít phân cành, đẻ nhánh, lá có màu xanh lục bẩn, không sáng Thiếu photpho, năng suất cây trồng bị giảm sut nghiêm trọng, ngay cả khi được cung cấp đủ nitơ Sự xuất hiện, tồn tại và chuyển hóa của photpho trong tự nhiên diễn ra theo một quy trình khép kín gọi là vòng tuần hoàn của photpho thông qua 4 quá trình (khoáng hóa, cố định sinh học, cố định hóa học và phân giải) Theo như các nghiên cứu cây trồng chỉ có thể hấp thu 5 - 25% lượng lân được bón, số còn lại bị đất giữ lại dưới dạng hấp phụ hoặc

cố định, trong đó hấp phụ thông qua trao đổi ion sẽ trở thành dạng tan, còn

cố định thì không thể chuyển đổi thông qua ion trao đổi VSV phân giải lân, VSV chuyển hóa lân (Phosphate Solubilizing Microorganisms – PSM)

là các VSV có khả năng chuyển hóa hợp chất photpho khó tan thành dạng

dễ tiêu cho cây trồng sử dụng Các VSV phân giải hợp chất photpho khó

tan được biết đến nay là các loài: Pseudomonas, Micrococus, Bacillus,

Flavobacterium, Penicillium, Sclerotium, Aspergillus Các VSV này không

chỉ phân giải photphat canxi mà cả photphat nhôm, sắt, mangan và các dạng khác kể cả quặng

1.2.3 Vi sinh vật phân giải xenlulo

Thủy phân xenlulo bởi enzyme từ vi sinh vật là bước quan trọng trong chu trình carbon Mặc dù có một lượng rất lớn xenlulo nhưng chỉ một phần trăm rất nhỏ vi sinh vật có khả năng phân giải vì sự cứng cáp của thành tế bào Có ít nhất năm cơ chế riêng biệt được sử dụng ở những loài vi sinh vật khác nhau nhằm phân giải xenlulo với sự có mặt của enzyme cellulase Không chỉ đóng góp vai trò trong chu trình carbon tự nhiên, vi sinh vật phân giải xenlulo còn có tiềm năng lớn trong việc phân hủy xenlulo trong nước ô nhiễm (Hubbe và cs 2012; Hubbe và cs 2013)[10,11] và chuyển hóa

xenlulo thành nhiên liệu sinh học thay thế nhiên liệu hóa thạch (Falter và cs 2015; Wang và cs 2011)[12,13]

Đã có nhiều nghiên cứu được tiến hành để phân lập dòng vi sinh vật sản sinh enzyme phân giải xenlulo và khả năng phân giải xenlulo của chúng Các vi sinh vật phân giải xenlulo chủ yếu được phân lập từ hệ tiêu hóa động vật ăn cỏ như bò, cừu, dê (Oyeleke và Okusanmi, 2008)[14], và côn trùng như bọ cánh cứng, mối (Huang và cs 2012; Hu và cs 2014)[15,16] Ngoài ra chúng còn được tìm ra trong phân ủ, phân hữu cơ, bùn từ nước thải (Bayer và cs 2004)[17] Nhóm vi khuẩn phân giải xenlulo bao gồm

Ruminococcus albus, Methanobrevibacter ruminatium, Siphonobacter aquaeclarae, Cellulosimicrobium funkei, Paracoccus sulfuroxidans, Ochrobactrum cytisi, Ochorobactrum haematophilum, Kaistia adipata, Desvosia riboflavia, Labrys neptuniae, Ensifer adhaerens, Shinella zoogloeoides, Citrobacter freundii, và Pseudomonas nitroreducens Các

loài này phần lớn thuộc nhóm vi sinh vật kị khí, chúng được phân lập chủ yếu

từ ruột của những loài động vật sử dụng gỗ làm nguồn thức ăn (Huang và cs

2012; Milala và cs 2005; Schwarz 2001)[18,19] Trong đất người ta cũng phân

lập được các dòng vi khuẩn Gram (+) hiếu khí như Brevibacllus,

Paenibacillus, Bacillus, và Geobacillus Đối với các dòng ưa ấm, pH và nhiệt

độ tối thích cho enzyme carbonmethyl cellulase của chúng hoạt động là 5,5 và

55 oC, còn đối với các dòng ưa nhiệt là pH 5,0 và nhiệt độ 75oC (Rastogi và

cs, 2009)[20]

Xạ khuẩn (Actinomycetes) là vi khuẩn Gram (+) có dạng sợi như nấm

Chúng là vi sinh vật hiếu khí có mặt khắp nơi trong tự nhiên Xạ khuẩn rất giàu G+C chiếm 57-75 % (Lo và cs, 2002)[21] chúng chiếm ưu thế trong đất phèn khô (Jeffrey, 2008)[22] Xạ khuẩn còn được biết đến nhiều bởi các sản phẩm chuyển hóa bậc hai, nổi bật là các loại kháng sinh như streptomycin, gentamicin, rifamycin và erythomycin Ngoài ra, xạ khuẩn còn có vai trò quan trọng trong công nghiệp dược phẩm cũng như trong nông nghiệp Streptomyces là giống chủ đạo trong xạ khuẩn, đây cũng là vi sinh vật sản sinh cellulase được quan tâm nghiên cứu Một số loài đáng chú ý thuộc

giống này như Streptomyces reticuli, Streptomyces drozdowiczii,

Streptomyces lividans (Kluepfel và cs, 1986; Schrempf và Walter, 1995)[

Thermoactimnomyces được tìm thấy trong trầm tích đại dương,

Streptosporangium trong quặng apatit cũng là những loài có khà năng phân

hủy xenlulo (Chang và cs, 2009; Veiga và cs,1983)[23,24]

Nấm là sinh vật có cơ chế sinh hóa độc đáo trong phân giải cơ chất tạo những sản phẩm bậc hai đặc biệt, đây là nhóm được nghiên cứu nhiều nhất trong lĩnh vực phân hủy xenlulo Các cellulase từ nấm thường có hoạt lực cao và dường như không có các dạng vật lý phức tạp như enzyme này từ vi

khuẩn Acremonium spp., Chaetomium spp., Trichoderma reesei,

chrysosporium, Fusarium solani, Talaromyces emersonii, Trichoderma koningii, Fusarium oxysporium, Aspergillus niger, Aspergillus terreus and Rhizopus oryzae có vai trò quan trọng trong quy trình phân hủy xenlulo ở

nhiều môi trường khác nhau (Yang và cs, 2011; Shahriarinour và cs,

(2011)[25,26]

1.2.4 Vi sinh vật sinh hocmon sinh trưởng thực vật

Một số nghiên cứu cho thấy có sự tổng hợp ACC deaminase (1- aminocyclopropane-l-carboxylate deaminase) từ các vi khuẩn kích thích

sinh truởng thực vật ở vùng rễ như: Methylobacterium sp., Alcaligenes spp

Bacillus pumilus, Enterbacer cloacae, burkholderia cepacia, Pseudomonas putida, Pseudomonas spp.và Variovoraxparadoxus Cơ chế này đuợc lý

giải là do ACC có khả năng làm giảm ethylen trong rễ mà ethelen này ức chế sự sinh trưởng của rễ) do đó kích thích rễ phát triển Phytohormone tác động kích thích lên sinh trưởng thực vật Phytohormone phổ biến nhất là auxin indole-3-acetic acid (IAA), đã có nhiều nghiên cứu về sự sản xuất

auxin này ở các loài vi khuẩn như: Azospirillum brasilense, Aeromonas

veronii, Agrobacterium sp., Alcaligenes piechaudii, Bradyrhizobium spp., Comamonas acidovorans, Enterobacter sp., và Rhizobium leguminosarưm

Một số quan sát cho thấy rằng vi khuẩn Methylobacterium sống cộng sinh

trên thực vật mà không gây bệnh cho cây chủ, nguợc lại chúng còn có khả năng hỗ trợ cây chủ phát triển rất tốt Năm 2004, Omer và cộng sụ đã khảo sát sự hiện diện của IAA trong môi truờng chứa dịch nuôi cấy vi khuẩn

biến dưỡng methyl Qua đó, phát hiện thấy có 3 trong 16 chủng phân lập có phản ứng duơng tính với với thuốc thử Salkowski Điều này đuợc chứng minh rõ hơn bằng phương pháp sắc lý lỏng cao áp (HPLC) kết hợp với phân tích phổ NMR (nuclear Mangnetic Radiation: cộng hưởng từ hạt nhân) Ba chủng tạo ra IAA có hàm luợng phytohormone từ 6 - 13,3 mg/1 nếu bổ sung L-tryptophan (L-TRP) Khi không bổ sung L-TRP thì nồng độ IAA tạo ra chỉ từ 1.1-2,4 mg/1 Các kết quả này đã gây đuợc sụ chú ý lớn 1.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU, ĐỊNH DANH VI SINH VẬT

Định danh vi sinh vật cần phải khảo sát các đặc điểm hình thái và các đặc điểm sinh lí, sinh hóa của vi sinh vật Đồng thời, phương pháp sinh học phân tử giải trình tự đoạn gen đặc trưng của vi sinh vật cũng được tiến hành

để cho kết quả nhanh chóng và chính xác

Phương pháp truyền thống: Việc phân loại vi khuẩn được thực hiện đầu tiên vào năm 1987, khi Ferdinad Cohn phân nhóm vi khuẩn dựa vào hình dạng tế bào Mặc dù phưomg pháp phân loại dựa vào hình thái sớm cho thấy không có hiệu quả trong phân loại, nhưng hình thái và đặc điểm cấu trúc hiển vi vẫn có vai trò quan trọng trong định danh vi sinh vật, đặc biệt

là trong việc định danh các chủng mới Phương pháp truyền thống để định danh vi sinh vật thường dựa vào các chỉ tiêu phân loại như: đặc điểm hình thái, sinh lý, đặc điểm biến dưỡng năng lượng Trong đó các thử nghiệm để xác định các đặc điểm sinh lý, sinh hóa là các chỉ tiêu quan trọng nhất Thông thường để định danh các loài vi khuẩn mục tiêu theo phương thức truyền thống, người ta thường dựa vào các khóa phân loại, trong đó khóa phân loại Prokaryote đầy đủ nhất, được sử dụng rộng rãi là khóa phân loại Bergey (Bergey ’s Manual of Systematic Bacteriology)[27] Riêng đối với nấm men việc định danh theo phương thức truyền thống rất phức tạp Từ trước đến nay có rất nhiều khóa phân loại nấm men của nhiều tác giả khác nhau Hansen là người đưa ra khóa phân loại nấm men đầu tiên Trong khóa phân loại này, Hansen chia nấm men thành 8 giống Sau Hansen, Klocker (1907), Guilliermond (1920) cũng đã tiến hành chỉnh sữa khóa phân loại của Hansen, nhưng chưa được hoàn thiện Đến năm 1952, J Lodder và Kreger-van rij đã tổng kết lại một cách khá hoàn thiện vấn đề

phân loại nấm men và xuất bản một tài liệu rất có giá trị (J Lodder and N.J.W.Kreger-Van Rij, 1952), được xuất bản lần thứ hai năm 1957 Năm

1970, J Lodder bổ sung sửa chữa lại và in tái bản lần thứ nhất năm 1970, lần thứ hai 1971 Đây là tài liệu phân loại nấm men rất có giá trị và và là khóa phân loại thông dụng nhất hiện nay trên thế giới Hệ thống phân loại này dựa trên kiểu phân chia tế bào, hình thái bào tử nang và đã xác định

349 loài nấm men thuộc 39 chi khác nhau

Phương pháp hiện đại: Ngày nay, sự phát triển của các kỹ thuật sinh học hiện đại đã đưa việc phân loại, định danh vi sinh vật lên một bước phát triển mới Phương pháp hiện đại trong định danh vi sinh vật dựa trên vật liệu di truyền có thể cho kết quả chính xác trong một thời gian ngắn Tuy nhiên, phương pháp phân loại hiện đại này đòi hỏi phải có trang thiết bị hiện đại và hóa chất đắt tiền Năm 1967, Zucker Kank và Pauling đã cho rằng các phân tử sinh học có thể là “tài liệu của lịch sử tiến hóa”, là “thước

đo tiến hóa” Phân tử rRNA 16S ở prokaryote và 18S ở eukaryote (riêng nấm men thì trình tự đoạn D1/D2 26s rRNA và vùng ITS 5.8S rRNA được

sử dụng phổ biến để xây dựng cây phát sinh chủng loài) là một công cụ hữu ích trong phân loại và định danh vi sinh vật Ngoài đặc điểm là hiện diện trong tất cả các sinh vật, có chức năng không đổi, phân tử rRNA 16S còn

có ưu điểm là có nhiều bản sao trong tế bào, có tính bảo tồn cao nhưng vẫn

có những vùng trình tự khác biệt giữa các loài và trình tự đặc trưng từng nhóm vi sinh vật; đặc biệt là thích hợp với mục tiêu phân loại nhờ có kích thước vừa phải (khoảng 1500 ribonucleotide), thuận tiện cho việc giải trình

tự Phương pháp hiện đại dùng đế định danh vi sinh vật bên cạnh việc dựa vào trình tự rRNA, các trình tự rDNA (trình tự mã hóa cho rRNA) cũng thường được sử dụng, vì DNA là vật liệu dễ thu nhận và có tính bền cao hơn RNA Một số phương pháp phân loại dựa vào vật liệu di truyền đang được sử dụng hiện nay: dùng mẫu dò kết hợp vói phương pháp lai in-situ phát huỳnh quang (Fluorescence ỉn-sừu Hybridazation - FISH) Mẫu dò là một trình tự acid nucleic, thường là một đoạn mạch đơn của acid nucleic (DNA) được gắn với một nhân tố nhận biết là phóng xạ hay chất phát huỳnh quang, dùng đế nhận biết trình tự nucleotide đặc trưng (trình tự nhận diện) của một chủng vi sinh vật đã biết trước Phân tích dữ liệu các trình tự

ssu rRNA (Small Subunit rRNA) đã biết sẽ cho phép xác định các trình tự nhận diện chuyên biệt cho từng giới Một số trình tự nhận diện cho một nhóm chuyên biệt chuyên biệt trong giới, thậm chí một giống, một loài cũng đã được xác định Trong tương lai, nhiều trình tự tương tự được xác định và sẽ rất hữu dụng trong việc nhận diện, định danh một vi sinh vật mới Các trình tự nhận diện chuyên biệt cho vi khuẩn có thể được tổng hợp, đánh dấu bằng chất phát huỳnh quang và dùng để phát hiện chuyên biệt các giới này Các mẫu dò này được gọi là “mẫu dò phát sinh chủng loại” (phylogenic prode) Bằng việc xử lý mẫu chứa vi sinh vật bằng một tác nhân thích hợp làm tăng tính thấm của màng, cho phép mẫu dò vào bên trong tế bào, thực hiện phương pháp lai phân tử (lai in-situ, tức là lai trực tiếp trên tế bào mẫu), và quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang, người ta

có thể xác định trực tiếp chủng thuần thuộc giới nào hay quần xã vi sinh vật hiện diện trong một mẫu tự nhiên gồm những giới nào Kỹ thuật lai và phát hiện này được gọi là phương pháp lai in-situ huỳnh quang (FISH)

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU

2.1 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU

- Mẫu đất thu thập tại các ruộng lúa, ruộng mía ở tỉnh Thanh Hóa, Nghệ

An, Hà Tĩnh

- Các môi trường sử dụng phân lập và nuôi cấy vi sinh vật

- Các cặp mồi 27F (GAG AGT TTG ATC CTG GCT CAG) và 1495R (CTA CGG CTA CCT TGT TAC GA)

2.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

2.2.1 Phân lập và lưu giữ các chủng vi sinh vật từ mẫu đất

- Phân lập, lưu giữ các chủng vi sinh vật có ích từ mẫu đất thu thập tại các tỉnh Thanh Hóa, Nghệ An, Hà tĩnh

2.2.2 Tuyển chọn và đánh giá các hoạt tính sinh học của các chủng vi sinh vật có ích

- Xác định định tính hoạt tính CMC- aza (Williams, 1983) đối với chủng vi sinh vật có khả năng phân giải xenlulo

- Xác định khả năng cố định nitơ của vi sinh vật: Định lượng khả năng

cố định Nitơ bằng phương pháp Kjeldahl (theo Ridvan Kizilkaya, 2009)

- Xác định định tính khả năng phân hủy phốtpho vô cơ (theo TCVN 8565:2010), lựa chọn sơ bộ dựa trên độ lớn và độ trong của vòng phân hủy

- Xác định khả năng tạo IAA thổ của các chủng vi sinh vật theo phương pháp đo màu được tạo thành với thuốc thử Van Urk Salkowski trong phương pháp của Salkowski

2.2.3 Định danh chủng vi sinh vật phân giải xenlulo

- Sử dụng sinh học phân tử để định danh chủng vi sinh phân giải xenlulo dựa trên kết quả giải trình tự của gen 16S rRNA đặc trưng cho loài 2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.3.1 Phương pháp phân lập và lưu trữ các chủng vi sinh vật

Pha loãng mẫu và cấy trên môi trường đĩa thạch:

Bước 1: Cân 10 g mẫu (phân compost, rác thải, đất…) cho vào cối sứ

nghiền nhỏ, sau đó cho vào bình tam giác chứa 90 ml nước muối sinh lý đã được khử trùng

Bước 2: Lắc trên máy lắc trong thời gian 30 phút, sau đó để lắng Ta có

dung dịch mẫu pha loãng 10-1 lần

Bước 3: Dùng pipetman hút 1ml dịch huyền phù ở độ pha loãng10-1

đưa vào ống nghiệm chứa 9 ml nước cất vô trùng Trộn đều ta có dịch pha loãng 10-2 lần

Bước 4: Dùng pipetman hút 0,1 ml (100 µl) dịch huyền phù ở độ pha

loãng10-2 đưa vào ống epppendorf chứa 0,9 ml nước cất vô trùng Trộn đều ta có dịch pha loãng 10-3 lần

Tiếp tục làm như trên, ta có một loạt độ pha loãng dịch mẫu khác nhau như ý

Bước 5: Lấy 0,1 ml dịch ở các nồng độ từ 10-4 đến 10-6 nhỏ và dàn

đều trên đĩa petri chứa môi trường GauzeI và Hans Để trong tủ ấm ở nhiệt

độ 28oC, 37oC hoặc cao hơn (nếu muốn phân lập VSV chịu nhiệt) trong 24h-48h sao cho có thể thấy rõ các khuẩn lạc riêng biệt

Bước 6: Các khuẩn lạc có hình dạng, màu sắc khác nhau được tách riêng,

làm thuần và giữ trong ống nghiệm để sử dụng cho các thí nghiệm sau

Các môi trường nuôi cấy trong nghiên cứu:

Môi trường NA: Meat extract 1g; Yeast extract 5g; pepton 5g; NaCl 5g Môi trường Ashby: Glucoze 20g ; K2HPO4 0,2g ; MgSO4.7H2O 0,2g ; NaCl 0,2g ; K2SO4 0,1g ; CaCO3 5g; Thạch 20g ; Nước cất 1000ml ; pH 7 - 7,2

Môi trường King B: Yeast extract 5g; pepton 20g; glyxerin 5 ml; K2HPO4

(12,5%) 12 ml; MgS04.7H20 (6,25%) 25 ml; nước cất 1000 ml pH 7

Môi trường Pikovskaia: Glucoza 10g; yeast extract 0,5g; K2HPO4

o,5g; MgSO4 0,3g; Ca3(PO4)2 5g; dung dịch vi lượng 2ml; nước cất 1000ml pH 7

Môi trường AT: CaCO3 20g; Glucoza 20g; K2HPO4 0,8g; 4.7H2O 0,5g; KH2PO4 0,2g; FeCl3.6H2O 0,1g; Na2MoO4.2H2O 0,05g; nước cất 1000ml pH 7

MgSO-Môi trường Hans: K2HPO4: 0,5g; KH2PO4: 0,5g; (NH4)2SO4: 1g; MgSO4.7H2O: 0,1g; CaCl2: 0,1g; NaCl: 6g; Cao nấm men: 0,1g; CMC: 0,1g; Thạch: 12g; H2O: 1.000ml; pH=7

Môi trường Gauze I: để phân lập và nhân sinh khối xạ khuẩn phân

giải xenlulo K2HPO4: 0,5g; KH2PO4: 0,5g; MgSO4.7H2O: 0,5g; NaCl: 0,5g; KNO3: 1g; FeSO4.7H2O: 0,01g; Tinh bột tan: 20g; thạch: 12g; H2O: 1000ml; pH=7

Môi trường gluco peptone agar (GPA): 1000ml; NaCl: 5g; Pepton:

10g; pH= 7,5

Môi trường PDA: Glucoza: 20.0 g; Khoai tây: 200.0 g; Thạch: 15 g

nước cất 1000 ml; pH=7

Dung dịch nước muối sinh lý: NaCl: 0,85g; nước cất: 100ml

2.3.2 Phương pháp xác định định tính hoạt tính CMC- aza (Williams, 1983)

Sinh khối các chủng vi sinh vật sau khi nuôi cấy 48h được li tâm lắng gạn bỏ phần cặn lắng và nhỏ 1ml vào các lỗ thạch đã được chuẩn bị sẵn trên các đĩa Petri chứa môi trường CMC đặc (CMC: 1g; Thạch: 12g; H2O: 1.000 ml) Lưu giữ đĩa thạch trong tủ ấm 24 h, sau đó lấy ra và tráng bề mặt thạch bằng dung dịch lugol

Hoạt tính sinh học được xác định bằng kích thước vòng phân giải, vòng tròn trong suốt bao quanh lỗ thạch ((hiệu số giữa đường kính vòng tròn trong suốt (D) và đường kính lỗ thạch (d)

2.3.3 Phương pháp đánh giá hoạt tính cố định nitơ của vi sinh vật

Phương pháp so màu với thuốc thử Nessler theo Lê Văn Khoa (1996) Phương pháp xác định khả năng cố định nitơ của vi sinh vật: Định lượng khả năng cố định N bằng phương pháp Kjeldahl (theo Ridvan

Kizilkaya, 2009), sau khi nuôi cấy vi khuẩn Azotobacter trên môitrường Ashby dịch thể trong 72 giờ

Phương pháp nghiên cứu đặc điểm nuôi cấy và hình thái theo Nguyễn Lân Dũng (1998)

2.3.4 Phương pháp tuyển chọn vi sinh vật phân giải phốt pho

Lấy 10 g mẫu cho vào cối sứ nghiền nhỏ và đưa vào bình tam giác có chứa 90 ml nước cất vô trùng (độ pha loãng 10-1) lắc bằng máy lắc ở tốc

độ 100 vòng/phút trong 15 phút Hút 0,5 ml dịch cho vào ống nghiệm có chứa 4,5 ml nước cất vô trùng ta được nồng độ pha loãng 10-2 Tiếp tục làm như vậy cho tới khi thu được độ pha loãng thích hợp Lấy pipet vô trùng hút 0,1 ml dịch huyền phù từ các ống nghiệm có độ pha loãng thích hợp cho vào đĩa Petri có chứa môi trường Pikowskia Gạt đều và ủ ở 30oC trong vài ngày cho tới khi xuất hiện khuẩn lạc Với mỗi độ pha loãng cấy ra 3 đĩa Sau khi xuất hiện khuẩn lạc trên các đĩa, đếm số khuẩn lạc vi sinh vật

có vòng bao quanh Đây chính là các vi sinh vật có khả năng phân giải các hợp chất phốt pho vô cơ khó tan Đồng thời đếm tổng số VSV có trên các môi trường tổng số để tính tần số bắt gặp vi sinh vật có khả năng phân giải các hợp chất phốt pho vô cơ khó tan Các khuẩn lạc này chưa đảm bảo thuần khiết về mặt di truyền và giữ mức độ ổn định hoạt tính cho nên cần phải giữ chúng trong các ống nghiệm giữ giống để làm sạch.Để làm sạch dùng que cấy vô trùng lấy một vòng que cấy sinh khối của giống cần làm sạch cho vào ống nghiệm chưa 4,5 ml nước cất vô trùng Trộn đều và pha loãng tiếp cho đến khi đạt được độ pha loãng thích hợp Hút 0,1 ml dịch huyền phù từ các độ pha loãng thích hợp nhỏ vào đĩa pettri có chứa môi trường Pikowskia gạt đều và ủ cho đến khi xuất hiện khuẩn lạc Giữ các khuẩn lạc riêng rẽ có vòng trong bao quanh trong ống nghiệm giữ giống và tiếp tục làm sạch cho đến khi thu được giống thuần khiết Cấy truyền những khuẩn lạc có vòng phân hủy sang ống nghiệm thạch nghiêng để giữ giống

Đánh giá hoạt tính phân giải phốt phát của vi sinh vật (theo TCVN

8565:2010), Lựa chọn sơ bộ dựa trên độ lớn và độ trong của vòng phân hủy Cấy các chủng đã phân lập được trên môi trường dịch thể có thành phần giống như thành phần môi trường phân lập không có thạch Mỗi chủng