luận văn thạc sĩ tinh chế và phân tích các đặc tính của lectin từ rong biển betaphycus gelatinus

Nguồn lợi sinh vật biển bao gồm vi tảo, rong biển, động vật không xương sống, cá, vi khuẩn, nấm và virus đã cung cấp một số lượng lớn các phân tử hoạt tính sinh học tự nhiên đặc hiệu n

BỘ GIÁO DỤC

VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC

VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

-

Lê Thị Đoan Thục

TINH CHẾ VÀ PHÂN TÍCH CÁC ĐẶC TÍNH CỦA

LECTIN TỪ RONG BIỂN BETAPHYCUS GELATINUS

LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC

Nha Trang - 2019

BỘ GIÁO DỤC

VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC

VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

-

Lê Thị Đoan Thục

TINH CHẾ VÀ PHÂN TÍCH CÁC ĐẶC TÍNH CỦA

LECTIN TỪ RONG BIỂN BETAPHYCUS GELATINUS

Chuyên ngành: Hóa phân tích

Mã số: 8440118

LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC

TS Lê Đình Hùng

Nha Trang – 2019

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi dưới sự chỉ bảo của thầy hướng dẫn và sự giúp đỡ của tập thể cán bộ nghiên cứu Phòng Công nghệ sinh học biển - Viện nghiên cứu và ứng dụng công nghệ Nha Trang - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam Các số liệu và kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được công bố

Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm với những lời cam đoan trên

Nha Trang, ngày 25 tháng 09 năm 2019

Chữ ký học viên

Lê Thị Đoan Thục

LỜI CẢM ƠN

Trước hết, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Lê Đình Hùng (Trưởng phòng Công nghệ sinh học biển - Viện nghiên cứu và ứng dụng công nghệ Nha Trang), người đã tận tình dìu dắt và hướng dẫn tôi trong suốt quá trình hoàn thành luận văn

Tôi cũng xin chân thành cảm ơn Ths Đinh Thành Trung - Phòng Công nghệ sinh học biển - Viện Nghiên cứu và Ứng dụng Công nghệ Nha Trang, người đã giúp tôi hoàn thành tốt phần thực nghiệm của mình

Tôi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Học viện Khoa học và công nghệ, khoa Hóa học và Phòng Đào tạo đã tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi thực hiện luận văn và hoàn thành mọi thủ tục cần thiết

Xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Ban lãnh đạo Viện nghiên cứu và ứng dụng công nghệ Nha Trang đã giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi thực hiện luận văn

Tôi cũng xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo và cán bộ công tác tại Viện Nghiên cứu và Ứng dụng Công nghệ Nha Trang, Trường Đại học Nha Trang, Trường Đại học Khánh Hòa đã giảng dạy, hỗ trợ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian học tập

Xin chân thành cảm ơn gia đình, người thân và bạn bè đã nhiệt tình động viên, giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và hoàn thiện luận văn này

Và cuối cùng, tôi xin cảm ơn Sở Giáo dục và Đào tạo Khánh Hòa, trường THPT Lý Tự Trọng – Nha Trang đã tạo điều kiện để tôi có thể hoàn thành khóa học sau đại học tại Học viện Khoa học và Công nghệ

Xin chân thành cảm ơn!

Nha Trang, ngày 25 tháng 09 năm 2019

Học viên

Lê Thị Đoan Thục

MỤC LỤC

Trang Lời cam đoan

Lời cảm ơn

Mục lục 1

Danh mục các ký hiệu và chữ viết tắt 4

Danh mục các bảng 5

Danh mục các hình vẽ, đồ thị 6

MỞ ĐẦU 7

Chương 1: TỔNG QUAN 10

1.1 Tổng quan về lectin 10

1.1.1 Lịch sử nghiên cứu 10

1.1.2 Phân bố của lectin trong sinh giới 11

1.1.2.1 Sự phân bố lectin trong giới thực vật 11

1.1.2.2 Sự phân bố lectin trong giới động vật 12

1.1.2.3 Lectin có nguồn gốc vi sinh vật 12

1.2 Tình hình nghiên cứu lectin từ rong biển trên thế giới 13

1.2.1 Một số tính chất lý, hóa và sinh học của lectin từ rong biển 13

1.2.1.1 Tính tan và kết tủa 13

1.2.1.2 Đặc tính liên kết carbohydrate của lectin 13

1.2.1.3 Điểm đẳng điện và hàm lượng axit amin 15

1.2.1.4 Trọng lượng phân tử 15

1.2.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính của lectin 15

1.2.2.1 Ảnh hưởng của pH 15

1.2.2.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ 16

1.2.2.3 Ảnh hưởng của các ion kim loại 16

1.2.2.4 Hàm lượng carbohydrate 16

1.2.3 Cấu trúc của lectin từ rong đỏ 20

1.2.4 Hoạt tính sinh học của lectin từ rong biển 21

1.2.4.1 Kháng virus chống suy giảm miễn dịch ở người (HIV) 23

1.2.4.2 Kháng virus viêm gan C 23

1.2.4.3 Kháng virus herpes simplex 2 23

1.2.4.4 Kháng virus cúm 23

1.2.4.5 Kháng virus coronavirus 24

1.2.4.6 Kháng ung thư 24

1.2.4.7 Kháng vi khuẩn 24

1.3 Tình hình nghiên cứu lectin từ rong biển trong nước 25

1.4 Các phương pháp tinh chế lectin từ rong biển 25

Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28

2.1 Đối tượng, địa điểm và thời gian nghiên cứu 28

2.2 Nguyên vật liệu, hóa chất và thiết bị nghiên cứu 29

2.2.1 Nguyên vật liệu 29

2.2.2 Hóa chất 29

2.2.3 Thiết bị sử dụng trong nghiên cứu 29

2.3 Phương pháp nghiên cứu 30

2.3.1 Chuẩn bị huyền phù hồng cầu máu 2 % 30

2.3.2 Phân tích hoạt tính lectin bằng phương pháp ngưng kết hồng cầu 30 2.3.3 Xác định hàm lượng protein bằng phương pháp Lowry 31

2.3.4 Bố trí thí nghiệm tổng quát 32

2.3.5 Xác định các điều kiện tối ưu để chiết lectin từ rong Betaphycus gelatinus 34

2.3.5.1 Khảo sát tỷ lệ nguyên liệu: dung môi chiết 34

2.3.5.2 Khảo sát nồng độ dung môi chiết 35

2.3.5.3 Khảo sát thời gian chiết 36

2.3.6 Khảo sát nồng độ tác nhân tủa thích hợp để thu tủa protein-lectin 37 2.3.7 Tinh sạch lectin bằng phương pháp sắc ký trao đổi ion DEAF-Sepharose 37

2.3.8 Tinh sạch lectin bằng phương pháp sắc ký lọc gel Sephacryl S–200 38

2.3.9 Kiểm tra độ tinh sạch và xác định khối lượng phân tử lectin bằng phương pháp điện di SDS-PAGE 38

2.3.10 Phân tích các yếu tố ảnh hưởng đến đặc tính lý, hóa của lectin từ rong biển B gelatinus 41

2.3.10.1 Phương pháp phân tích ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính ngưng kết hồng cầu 41

2.3.10.2 Phương pháp phân tích ảnh hưởng của pH đến hoạt tính

ngưng kết hồng cầu 41

2.3.10.3 Phương pháp phân tích ảnh hưởng của cation hóa trị 2, EDTA đến hoạt tính ngưng kết hồng cầu 42

2.3.10.4 Phương pháp phân tích đặc tính liên kết carbohydrate của lectin 42

Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 45

3.1 Sàng lọc hoạt tính ngưng kết hồng cầu của dịch chiết từ rong đỏ Betaphycus gelatinus 45

3.2 Các điều kiện để chiết lectin từ rong Betaphycus gelatinus 45

3.2.1 Tỷ lệ dung môi chiết 45

3.2.2 Ảnh hưởng của nồng độ ethanol đến quá trình chiết 47

3.2.3 Ảnh hưởng của thời gian chiết 48

3.3 Tinh chế lectin 49

3.3.1 Khảo sát nồng độ ethanol để kết tủa lectin 49

3.3.2 Tinh sạch lectin bằng sắc ký trao đổi ion DEAE-Sepharose 50

3.3.3 Tinh sạch lectin bằng sắc ký lọc gel Sephacryl S – 200 51

3.3.4 Phân tích độ tinh sạch và xác định trọng lượng phân tử lectin bằng phương pháp điện di SDS-PAGE 52

3.3.5 Kết quả tổng hợp quá trình tinh sạch lectin từ rong Betaphycus gelatinus 53

3.4 Kết quả xác định đặc tính lý, hóa của lectin từ rong B gelatinus 54

3.4.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính NKHC của lectin 54

3.4.2 Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính NKHC của lectin 55

3.4.3 Ảnh hưởng của ion kim loại hóa trị hai đến hoạt tính NKHC của lectin 56

3.4.4 Khả năng liên kết carbohydrate của lectin 57

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 61

TÀI LIỆU THAM KHẢO 63 PHỤ LỤC

SDS-PAGE Kỹ thuật điện di trên gel

polyacrylamide khi có sự hiện diện của SDS

Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide gel electrophoresis

chứa muối natri clorua

Phosphate buffer saline

ethylenediamin

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Một số tính chất hóa sinh của lectin từ rong biển 16

Bảng 1.2 Cấu trúc của một số lectin từ rong biển 21

Bảng 1.3 Hoạt tính sinh học của lectin từ rong biển 22

Bảng 1.4 Các phương pháp tinh chế lectin 26

Bảng 2.1 Các thiết bị chính được sử dụng trong thí nghiệm 29

Bảng 2.2 Các loại đường monosaccarit và glycoprotein sử dụng để khảo sát đặc tính liên kết carbohydrate của lectin 42

Bảng 3.1 Sàng lọc hoạt tính ngưng kết hồng cầu của dịch chiết thô từ rong đỏ B gelatinus với các dạng hồng cầu khác nhau 45

Bảng 3.2 Kết quả tinh sạch lectin từ rong Betaphycus gelatinus từ 400 gam rong thô 53

Bảng 3.3 Ảnh hưởng của ion kim loại hóa trị hai đến hoạt tính NKHC của lectin từ rong Betaphycus gelatinus 57

Bảng 3.4 Nồng độ đường và glycoprotein nhỏ nhất có khả năng ức chế hoạt tính NKHC của lectin từ rong Betaphycus gelatinus 58

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ

Hình 2.1 Rong B gelatinus 28

Hình 2.2 Qui trình nghiên cứu tổng quát dự kiến 33

Hình 2.3 Bố trí thí nghiệm xác định tỉ lệ nguyên liệu/ dung môi chiết thích

hợp 34

Hình 2.4 Bố trí thí nghiệm khảo sát nồng độ dung môi chiết thích hợp 35

Hình 2.5 Bố trí thí nghiệm khảo sát thời gian chiết thích hợp 36

Hình 3.1 Ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi chiết đến HTTS và HTR của lectin46

Hình 3.2 Ảnh hưởng của nồng độ ethanol đến HTTS và HTR của lectin 47

Hình 3.3 Ảnh hưởng của thời gian chiết đến HTTS và HTR của lectin 48

Hình 3.4 Ảnh hưởng của nồng độ % ethanol đến HTTS, HTR và hiệu suất thu

hồi của lectin 49

Hình 3.5 Đồ thị biểu diễn sự tương quan giữa giá trị A 280 nm và hoạt tính

NKHC theo thứ tự các phân đoạn trong quá trình sắc ký trao đổi

ion DEAE – Sepharose 50

Hình 3.6 Đồ thị biểu diễn độ hấp thu (= 280nm) và hoạt tính NKHC của

các phân đoạn trong quá trình sắc ký lọc gel Sephacryl S-200 51

Hình 3.7 Điện di lectin từ rong đỏ B.gelatinus Dùng gel polyacrylamide 12,5

% (SDS –PAGE) Các dãi protein được nhuộm với Coomassie

Hình 3.10 Lectin từ rong đỏ B gelatinus liên kết với các gốc đường mannose

được thể hiện trong hình chữ nhật 60

MỞ ĐẦU

Lectin, agglutinin hoặc hemagglutinin là những protein hoặc glycoprotein

và có nguồn gốc không miễn dịch Lectin được phân bố rộng rãi trong tự nhiên từ vi khuẩn, virus, đến động vật, thực vật bậc cao và bậc thấp Không giống như kháng thể, lectin cho thấy sự đa dạng trong cấu trúc phân tử và đặc tính liên kết carbohydrate của chúng, những đặc tính này phụ thuộc vào nguồn gốc thu nhận lectin

Nguồn lợi sinh vật biển bao gồm vi tảo, rong biển, động vật không xương sống, cá, vi khuẩn, nấm và virus đã cung cấp một số lượng lớn các phân tử hoạt tính sinh học tự nhiên đặc hiệu như thuốc kháng vi khuẩn, kháng virus HIV, kháng virus cúm, kháng ung thư và thuốc chữa bệnh Alzheimer [1] Trong số đó, lectin là một trong số nhóm hợp chất nổi bật nhất với nhiều đặc tính quan trọng đang được quan tâm đặc biệt cho sử dụng trong y-sinh (kháng virus, chống viêm, chống khối u, kháng ung thư kết tràng, kháng virus viêm gan C, HIV ) và trong dược phẩm

Gần đây, một số lectin liên kết N-glycan dạng high-mannose từ rong biển

đã hứa hẹn trở thành thuốc kháng các dòng virus, vi khuẩn và ung thư tiềm

năng, như các lectin từ loài Eucheuma serra (ESA-2) [2], [3], Kappaphycus alvarezii (KAA-2) [4], [5], Kappaphycus striatum, Eucheuma denticulatum [6], [7] và Solieria filiformis (SFL) [8] Tất cả chúng đã cho thấy hoạt tính

mạnh kháng virus HIV, virus cúm, một số dòng tế bào ung thư như ung thư ruột kết Colo201, Colon26, ung thư cổ tử cung HeLa, ung thư vú MCF-7, ung thư tuyến và ung thư biểu mô và vi khuẩn vibrio, thông qua sự tương tác đặc hiệu giữa lectin với các chuỗi đường dạng high-mannose trên bề mặt tế bào ung thư hoặc trên lớp vỏ của virus [8], [9], [10], [11], [12] Vì vậy, lectin liên kết với N-glycan dạng high-mannose từ rong biển hứa hẹn thành mục tiêu quan tâm cho sử dụng trong y sinh

Việt Nam nằm trong vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới, có chiều dài bờ biển khoảng 3.260 km, có một hệ thực vật tảo đa dạng với khoảng 1.000 mẫu được đánh giá và 639 mẫu đã được xác định, bao gồm 269 mẫu rong đỏ, 143 mẫu rong nâu, 151 mẫu rong lục và 76 mẫu rong xanh-lam.Đó là nguồn sinh vật

biển phong phú để nghiên cứu và khai thác sử dụng lectin trong hóa sinh, y sinh hoặc trong thực phẩm chức năng để phòng ngừa bệnh trong tương lai.Tuy nhiên, các nghiên cứu về lectin từ rong biển ở nước ta chưa được công

bố nhiều, ngoại trừ một vài công bố về lectin rong biển của TS Lê Đình Hùng

và cộng sự [6], [7], [13], [14], [15], [16] Các kết quả nghiên cứu cho thấy rong biển Việt Nam sẽ là nguồn nguyên liệu hứa hẹn để nghiên cứu và sản xuất lectin phục vụ cho hóa sinh và y sinh hoặc làm dược liệu là rất cần thiết

Rong đỏ Betaphycus gelatinus (rong hồng vân) là loại rong khá phổ biển

có dọc bờ biển miền Trung, là nguyên liệu để chiết xuất carrageenan dùng làm thực phẩm Tuy nhiên cho đến nay chưa có bất kỳ công bố nào về lectin

từ loài rong này trên thế giới cũng như trong nước Dựa trên các kết quả sàng lọc đặc tính liên kết carbohydrate của dịch chiết từ loài rong này cho thấy,

rong đỏ B gelatinus hứa hẹn là nguồn lectin liên kết high-mannose mới để sử

dụng trong hóa sinh và y học

Với những lí do trên, tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Tinh chế và phân

tích các đặc tính của lectin từ rong biển Betaphycus gelatinus”

Mục tiêu của đề tài:

Dựa trên kết quả phân tích các đặc tính và hoạt tính ngưng kết hồng cầu

của lectin từ rong biển B gelatinus hướng đến khai thác và sử dụng làm dược

liệu phòng trị bệnh

Nội dung nghiên cứu:

+ Tinh chế lectin từ rong đỏ B gelatinusbằng phương pháp kết tủa kết hợp các phương pháp sắc ký trao đổi ion và sắc ký lọc gel

+ Phân tích tính chất của lectin từ rong đỏ B gelatinus, bao gồm:

* Phân tích hoạt tính ngưng kết hồng cầu của lectin với hồng cầu tự nhiên và hồng cầu được xử lý enzyme

* Phân tích đặc tính liên kết của lectin với các monosaccharide và các glycoprotein

* Xác định độ tinh sạch và khối lượng phân tử của lectin bằng phương pháp điện di SDS-PAGE

* Phân tích độ bền nhiệt, ảnh hưởng của pH, cation hóa trị 2 và EDTA

đến hoạt tính ngưng kết hồng cầu của lectin từ rong đỏ Betaphycus gelatinus

Mô tả đầu tiên về hemagglutinin xuất phát từ Peter Hermann Stillmark khi thực hiện luận án tiến sĩ vào năm 1888 tại trường đại học Dorpat (hiện nay là

ĐH Tartu, Estonia), một trong những trường đại học lâu đời nhất ở Nga Chất

hemagglutinin được Stillmark chiết từ hạt của cây thầu dầu Ricinus communis

và được đặt tên là ricin Sau đó H Hellin, cũng ở Đại Học Tartu cho thấy sự hiện diện của một hemagglutinin độc, gọi là abrin ở mẫu chiết của cây đậu

Abrus precatorius Một thời gian sau, Paul Erlich (Frankfurt) đã sử dụng ricin

và abrin làm mô hình kháng nguyên cho các nghiên cứu miễn dịch (tất cả đều đặc hiệu với galactose), từ đó xây dựng một số nguyên lý cơ bản về miễn dịch học vào những năm 1890

Những kết quả ban đầu của Stillmark cũng đã nói lên một phần tính đặc hiệu của hiện tượng ngưng kết của ricin đối với hồng cầu của các động vật khác nhau Sự quan sát này được củng cố và mở rộng thêm vào năm 1900, khi Karl Landsteiner ở đại học Vienna, khám phá ra các nhóm máu người A, B và

O Gần một thập kỷ sau, ông công bố hoạt tính ngưng kết của các dịch chiết

từ các hạt khác nhau thì khác nhau khi thử nghiệm trên hồng cầu của các động vật khác nhau Vì tính đặc hiệu này, Landsteiner kết luận rằng hoạt tính của chất ngưng kết có nguồn gốc thực vật này “về cơ bản giống như kháng nguyên” Vì vậy ông đã sử dụng những protein này để minh họa cho khái niệm tính đặc hiệu trong chương mở đầu của cuốn sách kinh điển “Tính đặc hiệu của các phản ứng huyết thanh”

Khả năng phân biệt hồng cầu của các nhóm máu khác nhau của các agglutinin thực vật đã được đề xuất cho chúng một cái tên là lectin, từ tiếng Latin “legere”, có nghĩa là chọn lọc Thuật ngữ này được tổng quát hóa để

bao gồm tất cả các agglutinin đặc hiệu với các phân tử đường, bất kể chúng có nguồn gốc từ đâu hoặc đặc hiệu với các nhóm máu như thế nào

Lectin là các protein hoặc glycoprotein có khả năng liên kết thuận nghịch với carbohydrate nhưng không làm thay đổi cấu trúc cộng hóa trị của carbohydrate [17] Liên kết giữa lectin với carbohydrate bao gồm các liên kết như liên kết hydro, tương tác kỵ nước và Van der Waal [18] Lectin có khả năng ngưng kết các dạng hồng cầu người và động vật khác nhau [19] Vì vậy, đặc tính ngưng kết hồng cầu của lectin là yếu tố cơ bản để phân biệt lectin với các protein khác Trong tự nhiên, lectin có mặt trong nhiều loại các sinh vật như động vật, thực vật bậc cao, tảo, nấm, động vật nguyên sinh, nấm men, nấm, san hô, động vật không xương sống và động vật có xương sống [20] Do

có khả năng liên kết đặc hiệu với các cấu trúc carbohydrate khác nhau trên bề mặt tế bào ung thư hoặc trên lớp vỏ vi khuẩn và virus, lectin không chỉ được dùng cũng như thuốc thử trong nhiều lĩnh vực nghiên cứu, mà còn đang hứa hẹn sử dụng trong các liệu pháp chữa bệnh ung thư và kháng virus [21]

1.1.2 Sự phân bố của lectin trong sinh giới

1.1.2.1 Sự phân bố lectin trong giới thực vật

Lectin được phân bố rất rộng rãi ở thực vật bậc cao và được định khu khá rộng trong các cơ quan như thân, lá và hạt Tác giả Allen và Brillantine (1969), đã tiến hành điều tra ở 2.663 loài thực vật và kết quả cho thấy có 800 loài chứa lectin, trong đó các cây họ Đậu (Fabaceae) chiếm trên 600 loài [22] Ngoài các cây họ Đậu có số lượng loài lớn nhất có chứa lectin, một số thực vật khác như họ Lan (Orchidaceae), họ Trinh nữ (Mimosaceae), họ Thủy tiên (Amaryllidaceae) và họ Hòa thảo (Poceae) cũng có chứa lectin [23]

Ở Việt Nam, một số tác giả đã tiến hành điều tra sơ bộ các loại đậu đang được trồng phổ biến, kết quả cho thấy có tới 60% các loài có chứa lectin [24] Lectin từ họ Dâu tằm (Moraceae), Mít và một số loài khác như Chay

(Artocarpus tonkinensis), Sakê chi Artocarpus (Artocarpus incia) đều chứa

lectin có hoạt tính NKHC rất cao [25]

Không chỉ ở thực vật bậc cao, các nghiên cứu cũng cho thấy sự có mặt của lectin ở nhiều loài của thực vật bậc thấp như ở một số loài Nấm (Fungi), Địa y (Lichenes) và Rong (Algae) Báo cáo đầu tiên về lectin từ rong biển là

của Boyd và cộng sự vào năm 1966 tại vùng biển Puerto Rico của Mỹ [26], từ đó đến nay đã có hàng loạt các báo cáo về sự có mặt của lectin trong rong biển ở nhiều quốc gia khác nhau như: Anh, Nhật, Brazil, Hàn Quốc, Việt Nam…[27]

Mặc dù còn rất nhiều loài thực vật chưa được nghiên cứu nhưng các dẫn liệu khoa học trên đây cũng đã chứng tỏ rằng lectin là protein khá phổ biến trong giới thực vật [28]

1.1.2.2 Sự phân bố lectin trong giới động vật

Lectin có nguồn gốc từ động vật cũng được phát hiện khá sớm Lectin trong giới động vật được phát hiện đầu tiên từ một loài sam biển Châu Mỹ

(Limulus polyphemus) Sau đó, một số loài động vật thuộc lớp Giáp xác và

các loài động vật thuộc ngành Ruột khoang cũng đã được tiến hành điều tra

Ở Việt Nam, khi khảo sát 30 loài thuộc ngành Ruột khoang ở vùng biển Nha Trang - Khánh Hòa xuất hiện 10 loài có chứa lectin [28]

Trong khi đó ở một số loài động vật có xương sống, lectin cũng đã được khảo sát như lớp Cá (Osteichthye), lớp Lưỡng cư (Amphibia), lớp Bò sát (Reptila), lớp Chim (Aves) và lớp Thú (Mammalia) Ngoài ra, còn có một

số dạng lectin khác từ huyết tương cá chình (Anguilla rastiata) hay trứng cá vược (Perca piuviatitis)… Một kết quả nghiên cứu khá thú vị là ở mô người

như mô cơ và các cơ quan của cơ thể người như tim, phổi và các tế bào của hệ miễn dịch cũng chứa lectin Như vậy, có khá nhiều loài động vật có chứa lectin Đó cũng là bằng chứng về tính phổ biến của lectin trong sinh giới [29]

1.1.2.3 Lectin có nguồn gốc vi sinh vật

Lectin đầu tiên từ vi sinh vật được phát hiện vào năm 1942, khi Hirst

và cộng sự đã tìm thấy virus có chứa chất làm ngưng kết tế bào hồng cầu gà [28] Sau này, một số công trình khoa học của Bruoly (1948), Stone (1949) và Bruet (1951) cũng đã phát hiện thấy lectin ở một số loài virus khác [30]

Trên đối tượng là vi khuẩn E coli, Ofek và cộng sự đã cho biết: trên bề

mặt của tế bào vi khuẩn này có chứa chất có khả năng gây ngưng kết tế bào Hoạt tính này mất đi khi có mặt một số loại đường như galactoza và dẫn xuất

amin của nó [31]

1.2 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU LECTIN TỪ RONG BIỂN TRÊN THẾ GIỚI

Trong vài thập niên qua, đã có nhiều công bố về kết quả sàng lọc lectin từ rong biển ở các khu vực khác nhau trên thế giới như ở Anh [3], [32], [33], [34], Nhật bản [35], Tây Ban Nha [36], Hoa Kỳ [37], [38], Brazil [39], [40], [41], Pakistan [42], Trung Quốc [43], Việt Nam [13], [15], Ấn độ [44], Nam cực [45] và hơn 800 mẫu rong biển đã được sàng lọc hoạt tính ngưng kết hồng cầu, trong số đó khoảng 60 % mẫu được thông báo có chứa lectin, tuy nhiên số lượng lectin được tinh chế vẫn còn ít so với lectin từ thực vật bậc cao Các nghiên cứu về đặc tính cho thấy rằng lectin từ rong biển khác với lectin từ thực vật bậc cao trong các tính chất hóa-lý và hóa sinh Hầu hết lectin từ rong biển có một số đặc tính chung như tồn tại ở dạng monomer, có khối lượng phân tử nhỏ hơn lectin từ các nguồn khác, bền nhiệt và hoạt tính không bị ảnh hưởng bởi các kim loại hóa trị 2, có ái lực cao với các glycoprotein nhưng không với các monosaccharide [46], [47] Do có khối lượng phân tử thấp, vì vậy khi sử dụng lectin từ rong biển trong y học ít tạo ra kháng nguyên so với lectin từ các nguồn khác [48]

1.2.1 Một số tính chất lý, hóa và sinh học của lectin từ rong biển

1.2.1.1 Tính tan và kết tủa

Cũng giống như lectin từ thực vật bậc cao hay động vật, lectin từ rong biển hòa tan được trong nước nhưng chúng dễ tan hơn trong các dung dịch muối loãng Lectin có bản chất là protein nên chúng dễ bị kết tủa bởi một số tác nhân hóa học như ethanol, acetone và một số muối trung tính ở nồng độ cao

1.2.1.2 Đặc tính liên kết cacbohydrat của lectin

Phụ thuộc vào nguồn gốc rong biển, hoạt tính ức chế sự ngưng kết hồng cầu của lectin thì đa dạng (Bảng 1.1) Hoạt tính ngưng kết hồng cầu của lectin từ rong biển thường bị ức chế mạnh bởi các glycoprotein và glycopeptide khác nhau Do đó, dựa trên đặc tính liên kết của chúng với glycoprotein, các lectin từ rong biển được chia làm 3 loại là loại đặc hiệu N-glycan dạng phức, đặc hiệu N-glycan dạng high-mannose hoặc đặc hiệu cả 2

dạng Tuy nhiên, cũng có một vài lectin từ rong biển có đặc tính liên kết với các đường đơn monosaccharide và các dẫn xuất của chúng

a/ Lectin liên kết với N-glycan dạng phức

Một số lectin thể hiện tính đặc tính đối với các chuỗi đường thuộc loại N-glycosidic [49], trong khi một số ít là đặc hiệu với O-glycan [13] Hoạt tính

ngưng kết hồng cầucủa các lectin từ rong E duperreyi [50], Ptilota filicina [51], Pterocladiella capillacea [52], G ornata [53] và G cornia [54] đã bị ức

chế mạnh bởi porcine stomach mucin (PSM) PSM làmột glycoprotein dạng O-glycan có các gốcN-acetyl galactosamine (GalNAc) ở vị trí cuối cùng của

chuỗi carbohydrate[51] Lectin từ rong Hypnea japonica có đặc tính liên kết

với N-glycans dạng phức như transferrin, fetuin và α1-acid glycoprotein hoặc O-glycan (fetuin và mucin), nhưng không liên kết với N-glycan dạng high-

mannose [2], [55] Tương tự, các lectin từ rong Hypnea valentiae, H boergesenii, H nidulans và Gracilaria salicornia thì đặc hiệu cho O-glycan

và hoạt tính ngưng kết hồng cầu của chúng bị ức chế mạnh bởi asialofetuin mang cả N-glycan phức tạp và O-glycan cũng như bovine stomach mucin và dẫn xuất của chúng [13] (Bảng 1.1)

b/ Lectin liên kết với N-glycan dạng high-mannose

Một số lectin từ các loài rong đỏ, carrageenophyte, như Eucheuma serra [2], Kappaphycus alvarezii [13], Kappaphycus striatum [6], Eucheuma denticulatum [7] và Soliera filiformis [8] có đặc tính liên kết nghiêm ngặt các

các N-glycan dạng high-mannose nhưng không liên kết với monosaccharide (Bảng 1.1)

c/ Lectin liên kết với cả hai N-glycan dạng high-mannose và dạng phức

Lectin từ Carpopeltis flabellata [49], [56] và S robusta [35]có thể liên

kết với cả N-glycan dạng high-mannose và N-glycan dạng phức (Bảng 1.1)

d/ Lectin liên kết với đường đơn monosaccharide

Hầu hết các lectin từ rong biển đều có ái lực cao hướng đến các glycoprotein Tuy nhiên, cũng có một số lectin có ái lực với các

monosaccharide và các dẫn xuất của chúng Lectin từ C flabellata bị ức chế bởi rhamnose [49] Các lectin từ P serrata, PSL [51], P filicina PFL [57] và

V obtusiloba [58] bị ức chế mạnh bởi đường galactose và các dẫn xuất của

chúng (Bảng 1)

1.2.1.3 Điểm đẳng điện và hàm lượng axit amin

Lectin từ rong biển có điểm đẳng điện thấp (pIs), thường nằm trong phạm vi từ 4 đến 6 (Bảng 1.1) Lectin từ rong biển chiếm tỉ lệ cao của axit amin dạng axit (axit aspartic và axit glutamic) và tỉ lệ thấp axit amin dạng bazơ (arginine, histidine và lysine) [46], [51], [59]

1.2.1.4 Trọng lượng phân tử

Lectin từ rong biển thường có khối lượng phân tử thấp và tồn tại ở dạng

monomer như các lectin từ C flabellata, S robusta [ 46], B seaforthii, B triquetrum [60], E serra [61], P capillacea [52], H musciformis [62], G ornata [53], G cornia [54], Griffithsia sp.[63], [64], [65], K alvarezii [14], T crinitus [66], G confluens [45], K striatum [6], E denticulatum [7] và S filiformis [8].Tuy nhiên, một lectin có cấu trúc dimer như lectin từ rong P palmata[67] và V obtusiloba [58]; dạng trimer như lectin từ rongPtilota filicina[57], P serrata [51], P plumosa và P gunneri [68]; hoặc cấu trúc tetramer như lectin từ rong G verrucosa [69]

Dựa trên các tính chất hóa lý và hóa sinh, Rogers và Hori [47] đã phân loại lectin thành ba loại:

(a) lectin có khối lượng phân tử thấp đặc hiệu cho glycoprotein và không đòi hỏi cation hóa trị hai cho hoạt tính sinh học

(b) lectin đặc hiệu monosacharide vớikhối lượng phân tử trung bìnhvà không đòi hỏi cation hóa trị hai cho hoạt tính sinh học

(c) lectin đặc hiệu monosacharide (MW ˃ 64.000) đòi hỏi cation hóa trị hai cho hoạt tính sinh học (Bảng 1.1)

1.2.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính của lectin

1.2.2.1 Ảnh hưởng của pH

Hoạt tính ngưng kết hồng cầu của các lectin từ rong biển như lectin từ

E serra, K alvarezii [70], A tenera [71], C purpureum[72] và G verrucosa [69], K striatum, E denticulatum [6], [7] ổn định trong phạm vi pH rộng từ 3

đến 10 Bên cạnh đó, một số lectin có độ ổn định pH trong phạm vi hẹp từ 6

đến 8, như các lectin từ P serrata [51], Gracilaria bursa-pastoris [49] và T crinitus [66] và mất hoạt tính khi pH nằm ngoài phạm vi trên

1.2.2.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ

Hoạt tính ngưng kết hồng cầu của một số lectin từ rong biển, như lectin

từ P Capillacea [52], G ornata [53], K alvarezii [14], G fishingi [73], K striatum, E denticulatum [6], [7] và E serra [74]bền ở nhiệt độ 50 °C và mất

hoạt tính khi nhiệt độ vượt quá 50 °C

Tuy nhiên, một số ít lectin có độ bền nhiệt cao, ở 100 oC vẫn không mất

hoạt tính trong khoảng thời gian 30 phút như các lectin từ rong B seaforthii,

B triquetrum [60], G verrucosa [75], [76], H japonica [55], P serrata [51]

và G confluens [45]

1.2.2.3 Ảnh hưởng của cation hóa trị hai

Hầu hết hoạt tính ngưng kết hồng cầu của lectin từ rong biển không phụ thuộc vào cation hóa trị hai Tuy nhiên, một số lectin từ rong biển như lectin

từ rong Plumaria Elegans, P serrata [77], P filicina [57], E Duperreyi [50]

và V obtusiloba [58] cần kim loại hóa trị hai cho hoạt tính sinh học, như Ca2+,

Bảng 1.1 Một số tính chất hóa sinh của lectin từ rong biển [78]

Tên tảo/rong biển Tên

lectin

Đặc tính liên kết Đường/Glycoprotein

Tính chất của lectin

Tảo lục lam

Microcystis

aeruginosa

MAL N-acetyl-D-galactosamine Monomer, MW 57 kDa, pI

6.4, giàu Asx & Arg, hàm lượng carbohydrate 7.8 %

oligomannosides như

Dimer đồng nhất, 113 gốc axit amin, MW 13 kDa, bền

Rong lục

Bryopsis hypnoides BHL N-acetyl galactosamine,

N-acetyl glucosamine, bovine submaxillary mucin

MW 27 kDa, pI từ 5–6, bền

α-methyl-D-mannose, L-fucose acetyl-D-galactosamine, N-acetyl-D-glucosamine

N-Monomer, MW 17 kDa, pI 7.3, hoạt tính ngưng kết hồng cầu không phụ thuộc vào cation hóa trị hai, bền nhiệt lên đến 70 o C trong 30 phút

Dimer đồng nhất, MW 44.7 kDa, hàm lượng

carbohydrate 11.05%

bovine thyroglobulin

MW 23 kDa, bền pH từ 6–8, bền nhiệt đến 70o C trong 30 phút, hoạt tính ngưng kết hồng cầu phụ thuộc cation hóa trị 2, hàm lượng carbohydrate 1,2%

Rong đỏ

hàm lượng carbohydrate 2,9%

Bryothamnion

seaforthii

BSL Feutin, avidin, mucin Monomeric, MW 4.5 kDa,

hoạt tính ngưng kết hồng cầu không phụ thuộc cation hóa trị 2, bền nhiệt đến 90o C

trong 30 phút

gốc axit amin, hoạt tính ngưng kết hồng cầu không phụ thuộc cation hóa trị 2, bền nhiệt đến 90o C trong 30 phút

(mouse), thyroglobulin, high-mannose (HM)-type N-glycans

Monomeric, MW 29 kDa,

2.5–10.5, pI 4.95, bền nhiệt đến 60 o C trong 1 giờ

(mouse), thyroglobulin, high-mannose (HM)-type N-glycans

Monomeric, MW 29 kDa,

2.5–10.5, bền nhiệt đến 60o C trong 1 giờ

mucin

Monomeric, MW 60 kDa, pI 4.3, hoạt tính ngưng kết hồng cầu không phụ thuộc cation hóa trị 2, bền nhiệt đến 40 o C trong 20 phút, hàm lượng carbohydrate 52.5%

lactotransferrin, asialofetuin, bovine &

glycoconjugates chứa acetylneuraminic acid

N-MW 29.7 kDa, hoạt tính ngưng kết hồng cầu không phụ thuộc cation hóa trị 2

bởi các đường đơn

Tetramer, MW 41 kDa, nhóm nhỏ MW 12 kDa & MW 10.5 kDa, bền pH 4–12, pI 4.8, hoạt tính ngưng kết hồng cầu không phụ thuộc cation hóa trị 2, bền nhiệt đến 40o C trong 30 phút

Griffithsia sp GRFT Glucose, mannose,

N-acetylglucosamine

Dimeric, MW 12.7 kDa, 121 gốc axit amin

Hypnea

cervicornis

HCL N-acetyl-D-galactosamine,

bovine submaxillary mucin, desialylated ovine submaxillary mucin, porcine stomach mucin, asialofetuin

MW 9.1 kDa

(transferrin, fetuin, α-acid glycoprotein), O-glycans (feutin & mucin),

asialofeutin, asialomucin, glycopeptides prepared from asialofeutin, core (α1-6) fucosylated glycans

Đồng phân lectins MW 9.1 kDa

(hypnin-1 & hypnin-2)

bovine submaxillary mucin, desialylated

ovine submaxillary Mucin

thyroglobulin, asialo bovine thyroglobulin, yeast mannan

Monomeric, MW 28 kDa, hoạt tính ngưng kết hồng cầu không phụ thuộc cation hóa trị 2, bền nhiệt đến 50o C trong 30 phút, bền pH từ 3–

10

high-mannose type glycans, porcine and bovine thyroglobulins, dẫn xuất asialo của chúng và yeast mannan

trong 30 phút, bền pH từ 7–

10

p-nitrophenyl-N-acetyl-α-and-β-D-galactosaminide, porcine stomach mucin, bovine submaxillary gland mucin, asialo bovine mucin

Trimer đồng nhất, MW 56.9 kDa, hoạt tính ngưng kết hồng cầu phụ thuộc cation hóa trị 2, bền nhiệt đến 50o C trong 30 phút

their derivatives with nitrophenyl-α-D- galactoside

p-Trimer đồng nhất, MW 52.5 kDa

o-nitrophenyl-N-acetyl-α-D-galactoside, nitrophenyl-N-acetyl- β-D- galactoside, lactose, porcine stomach mucin, asialo bovine mucin và asialofetuin

p-Trimer đồng nhất, MW 55.4 kDa

Solieria filiformis SFL Mannan, avidin,

ovalbumin, egg white

MW 29 kDa

Tichocarpus

crinitus

TCL Porcine stomach mucin

(type VII), feutin

Monomeric, MW 41 kDa, pI 4.93, hoạt tính ngưng kết hồng cầu không phụ thuộc cation hóa trị 2, hàm lượng carbohydrate 6.9%

1.2.3 Cấu trúc của lectin từ rong đỏ

Trong số các cấu trúc của lectin từ rong biển, cấu trúc của lectin từ rong đỏ

Griffithsia sp đã được nghiên cứu chi tiết, đó là một homodimer đồng nhất,

trong đó mỗi monome chứa 121 axit amin [79], [80], [81] Cấu trúc tinh thể

của lectin từ Griffithsia sp và tương tác đặc hiệu của nó với các gốc đường

của glycan như mannose, N-acetylglucosamine, 1 → 6α-mannobiose và maltose đã được xác định thông qua phương pháp đo nhiễu xạ tia X [79], [80], [81] Gần đây, cấu trúc bậc một của một số lectin từ rong đỏcũng đã

được xác định, như cấu trúc của lectin EDA-2 từ E denticulatum [7], ESA-2 từE serra [2], KAA-2 và KSA-2 từ K alvarezeii [5], KSA-2 từ K striatum [16]và SfL-1 và SfL-2 từ S filiformis [8] Cấu trúc của những lectin này bao

gồm 2 thùng β (β-barrel), mỗi thùng β chứa 10 dải β (β-strand) (Bảng 1.2)

Bảng 1.2 Cấu trúc của một số lectin từ rong biển

Tên mẫu rong Tên lectin Dạng cấu

trúc

Tài liệu tham khảo

[8]

1.2.4 Hoạt tính sinh học của lectin từ rong biển

Đặc tính liên kết carbohydrate của lectin là cơ sở cho các hoạt tính sinh học đa dạng của chúng như kháng virus, kháng ung thư, chống viêm … và khả năng chẩn đoán và điều trị chọn lọc các bệnh này (Bảng 1.3)

Bảng 1.3 Hoạt tính sinh học của lectin từ rong biển

Tên mẫu rong Hoạt tính sinh học Tài liệu tham khảo

Bryothamnion seaforthii Kháng ung thư

Làm lành vết thương

[84]

[85]

Kháng ung thư Kháng khuẩn Phân bào

[3]

[12]

[87]

[61]

Kháng virus HSV-2 Kháng virus HPV Kháng virus viêm gan C Kháng virus SARS coronavirus

[63], [88], [89], [90] [91]

[92]

[93]

[94]

Hypnea cervicornis Kháng đau và kháng viêm

Pterocladiella capillacea Kháng đau và kháng viêm [99], [100]

Solieria filiformis Kháng đau và kháng viêm

Kháng khuẩn Kháng ung thư

[100], [101]

[102]

[8]

S robusta Phân bào [35]

1.2.4.1 Kháng virus chống suy giảm miễn dịch ở người (HIV)

Virus gây suy giảm miễn dịch (HIV) đã gây ra một tác động lớn cho sức khỏe con người toàn cầu và hiện tại không có vắc-xin để sử dụng Lectin

GRFT từ rong đỏ Griffithsia sp., đã có ái lực cao đối với N-glycan dạng

high-mannose trên bề mặt của lớp vỏ virus và đã chứng minh có hoạt tính mạnh kháng virus HIV với các giá trị ức chế trong phạm vi picomole [63] hoặc

lectin từ rong E serra (ESA-2) và K alvarezii (KAA-2) cũng đã cho thấy

hoạt tính mạnh kháng virus HIV ở giá trị IC50 từ 7,3 đến12,9 nM [4], [5] Các kết quả chỉ ra rằng lectin từ rong biển hứa hẹn trở thành thuốc kháng virus trong tương lai

1.2.4.2 Kháng virus viêm gan C

Lectin GRFT từ rong đỏ Griffithsia sp đã tương tác với các

oligosaccarit dạng high-mannose có trên lớp vỏ virus và có thể ngăn ngừa nhiễm HCV đến tế bào gan và giảm thiểu nhiễm HCV [92]

1.2.4.3 Kháng virus herpes simplex 2

Lectin GRFT từ rong đỏ Griffithsia sp là một loại thuốc diệt vi khuẩn

phổ rộng đầy hứa hẹnvì nó ngăn chặn nhiễm virus herpes simplex virus 2 (HSV-2) và ức chế virus u nhú ở người (HPV) [91] Cơ chế hoạt động của GRFT chống lại HSV-2 liên quan đến ức chế đầu vào [90] cùng với việc ngăn ngừa lây lan từ tế bào đến tế bào [91]

1.2.4.4 Kháng virus cúm

Các glycoprotein trên lớp vỏ virus được glycosyl hóa ở mức độ khác nhau và đóng vai trò trong sự gắn lớp vỏ bọc virus cúm glycoprotein (haemagglutinin) lên tế bào vật chủ [103] Những vi-rút cúm này gây ra đại

dịch toàn cầu hàng năm Các lectin liên kết high-mannose từ rong đỏ K alvarezii thể hiện hoạt tính kháng virus cúm cao và có tác dụng ức chế các

chủng cúm với EC50 ở mức độ nano [4] Do đặc tính liên kết với N-glycan

dạng high-mannose, lectin ESA-2từ E Serra cũng đã ức chế nhiễm virus cúm

ở giá trị EC50 là 12,4 nM[3]

1.2.4.5 Kháng virus coronavirus

Lectin GRFT từ rong đỏ Griffithsia sp hoạt động như một chất ức chế

mạnh mẽ sự lây nhiễm virus SARS - CoV [94] Do tính đặc hiệu với mannose của lectin GRFT, nó đóng vai trò là ứng cử viên kháng virus coronavirus [104]

1.2.4.6 Kháng ung thư

Trong số tất cả các khối u ác tính, u xương là được tiên đoán với tỷ lệ sống sót thấp của bệnh nhân được điều trị [105] Cấu trúc carbohydrate thay đổi giữa các tế bào bình thườngvà các dòng tế bào ung thư khác nhau[106] Tương tác đặc hiệu giữa chuỗi mannose trên bề mặt tế bào ung thư với lectin

ESA từ rong đỏ E serra dẫn đến sự liên kết đặc hiệu giữa lectin với tế bào

ung thư và gây tế bào tự chết [9] Lectin ESA gây chết tế bào ung thư ruột kết

ở người (Colo201) và ung thư cổ tử cung ở người (tế bào HeLa) [9] Liên kết

của lectin từ E serra với các tế bào sarcoma cũng gây ra tế bào tự chết với

hoạt tính chống tăng sinh cao hơntrong các tế bào ung thư biểu mô [12]

Lectin từ rong S filiformis đặc hiệu đối với oligosacaride dạng high-mannose

đã ức chế sự phát triển của tế bào ung thư vú MCF-7 với giá trị IC50 = 125 µg/ml [8]

dạng high-mannose trên bề mặt của vi khuẩn gram âm [102]

Các biện pháp phòng ngừa bệnh là cần thiết để đối phó với sự lây lan của các loại virus trên toàn thế giới như HIV, HSV, HCV và SARS-CoV Do đặc tính liên kết nghiêm ngặt của lectin từ rong biển với glycoprotein trên lớp

vỏ virus như HIV, HSV, HCV và SARS-CoV hoặc trên bề mặt các tế bào ung thư, lectin từ rong biển hứa hẹn để phát triển thành các thuốc kháng virus, kháng ung thư và kháng vi khuẩn trong tương lai

1.3 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU LECTIN TỪ RONG BIỂN TRONG NƯỚC

Việt Nam nằm trong vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới với chiều dài bờ biển khoảng 3.260 km, ở đó có một sự đa dạng của sinh vật biển [108] Các mẫu sinh vật này sẽ là nguồn tiềm năng của các hợp chất hoạt tính sinh học bao gồm lectin Tuy nhiên cho đến nay các công bố về lectin từ sinh vật biển ở nước ta vẫn còn hạn chế, ngoại trừ một vài công bố của Viện nghiên cứu và ứng dụng công nghệ Nha Trang dựa trên kết quả sàng lọc hemagglutinin từ rong biển Việt Nam và động vật thân mềm biển [13], [35], [109], tinh chế và

mô tả đặc tính của lectin từ rong đỏ K alvarezii, K striatum, E denticulatum,

G salicornia, H eucheumatoides và từ bọt biển Stylissa flexibilis [6], [7], [14], [110], [111], [112], các dòng cDNA mã hóa lectin từ rong K striatum và

E denticulatum [7], [16], [113] và sự thay đổi theo mùa trong hàm lượng lectin từ các rong đỏ đang nuôi trồng K alvarezii và K striatus [70], [114]

Vì vậy, rong biển Việt Nam đang là nguồn tiềm năng để khai thác các hợp chất hoạt tính sinh học bao gồm lectin để sử dụng trong các lĩnh vực y sinh, hóa sinh và nuôi trồng thủy sản là cần thiết

1.4 CÁC PHƯƠNG PHÁP TINH CHẾ LECTIN TỪ RONG BIỂ

Lectin từ rong biển có thể được tinh chế bằng nhiều bước kỹ thuật sắc ký khác nhau như sắc ký trao đổi ion, sắc ký lọc gel hoặc sắc ký ái lực (Bảng

1.4)

Bảng 1.4 Các phương pháp tinh chế lectin

Rong biển Phương pháp tinh chế Khối lượng phân tử

E cottonii Sắc ký lọc gel Superdex

và sắc ký trao đổi ion DEAE-Toyopearl

Monomer 29 kDa [74]

E serra Sắc ký lọc gel Superdex

và sắc ký trao đổi ion DEAE-Toyopearl

Monomer 29 kDa [61]

E.denticulatum Sắc ký lọc gel Superdex

và sắc ký trao đổi ion DEAE-Toyopearl

Monomer 28 kDa [7]

Gracilaria

cornea

Sắc ký kỵ Sepharose CL-4B và sắc

cervicornis sắc ký pha đảo HPLC

H japonica Sắc ký lọc gel Toyopearl

và sắc ký pha đảo HPLC

Monomer, 8.5–9.5 kDa

K alvarezii Sắc ký lọc gel Superdex

và sắc ký trao đổi ion DEAE-Toyopearl

Monomer, 28 kD [14]

K striatum Sắc ký lọc gel Superdex

và sắc ký trao đổi ion DEAE-Toyopearl

Phenyl-Monomer, 41 kD [66]

Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 ĐỐI TƯỢNG, ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN NGHIÊN CỨU

Đối tượng khảo sát: Rong đỏ Betaphycus gelatinus thu ở vùng biển Ninh

Thuận

Hình 2.1 Rong Betaphycus gelatinus

Tên tiếng Việt: Rong hồng vân

Tên La Tinh: Fucus gelatinus Esper 1800

Sphaerococcus gelatinus (Esper) C.Agardh 1822

Betaphycus gelatinus (Esper) Doty ex P.C.Silva 1996 Rong B.gelatinus được định danh theo khóa phân loại như sau:

Giới Plantae

Ngành Rhodophyta

Lớp Florideophyceae

Bộ Rong Giga Gigartinales

Họ Rong kỳ lân Solieriaceae

Chi Betaphycus

Loài Betaphycus gelatinus

Đối tượng nghiên cứu:Lectin từ rong đỏ B.gelatinus

Địa điểm nghiên cứu:Viện nghiên cứu và Ứng dụng công nghệ Nha

Trang, Tp Nha Trang, tỉnh Khánh Hòa

Thời gian nghiên cứu:Từ tháng 06/2018 đến tháng 6/2019

2.2 NGUYÊN VẬT LIỆU, HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU

2.2.1 Nguyên vật liệu

* Mẫu rong đỏ B gelatinus thu tại vùng biển Ninh Thuận tháng 3/2018

Saukhi thu, rong đượcrửa sạch bằng nước ngọt để loại bỏ tạp chất và bảo quản ở - 20oC cho đến khi sử dụng

Hồng cầu của máu thỏ, cừu, ngựa và gà do Viện Vaccine và sinh phẩm, Nha Trang, tỉnh Khánh Hòa cung cấp Hồng cầu các nhóm máu A, B, O ở người do Bệnh viện đa khoa tỉnh Khánh Hòa cung cấp

2.2.2 Hóa chất

Các loại đường và glycoprotein: D-glucose, D-mannose, D-galactose, fucose, D-xylose, D-glucosamine, D-gluconic acid, p-nitrophenyl-D-galactoside, p-nitrophenyl-D-glucoside, p-nitrophenyl-D-mannoside, transferrin, fetuin, porcine thyroglobulin và procine stomach mucin; Yeast mannan mua từ hãng Merck (Đức) Sephacryl S - 200 mua của hãng Pharmacia, Uppsala, Thụy Điển

L-2.2.3 Thiết bị sử dụng trong nghiên cứu

Một số thiết bị sử dụng trong nghiên cứu gồm:

Bảng 2.1 Các thiết bị chính được sử dụng trong thí nghiệm

9 Máy ly tâm eppendorf Mikro 200 Hettich - Đức

11 Máy đo quang phổ UV-Vis Spectro

UV/-2505/24

Labomed – Mỹ

13 Thiết bị thu phân đoạn tự động Frac – 920 GE Healthcare –

Mỹ

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.3.1 Chuẩn bị huyền phù hồng cầu máu 2 %

Mỗi mẫu máu được rửa từ 3 đến 5 lần với 50 thể tích dung dịch NaCl 0,15

M Sau khi rửa, huyền phù hồng cầu máu 2 % (v/v) được chuẩn bị bằng cách thêm dung dịch đệm photphat 0,02 M có chứa NaCl 0,15 M, pH = 7,2 và được dùng như hồng cầu tự nhiên [13]

Hồng cầu máu xử lý trypsin được chuẩn bị như sau:1/10 thể tích của dung dịch trypsin 0,5 % (w/v) được thêm vào huyền phù máu tự nhiên 2% (v/v), trộn đều và được ủ ở 37 oC trong 60 phút Sau khi ủ, hồng cầu máu được rửa từ 3 đến 5 lần với dung dịch muối và hòa lại bằng dung dịch đệm photphat 0,02 M có chứa NaCl 0,15 M, pH = 7,2, ta thu được huyền phù hồng cầu máu 2 % đã xử lý enzyme [13]

2.3.2 Phân tích hoạt tính lectin bằng phương pháp ngưng kết hồng cầu [13]

Hồng cầu được sử dụng trong các thí nghiệm xác định hoạt tính NKHC của lectin là hồng cầu thỏ, cừu và gà 2 %, hồng cầu máu người A, B và O đã được xử lý enzyme trypsin

- Tiếp tục cho 25µl hồng cầu máu 2 % đã xử lý bằng trypsin vào tất cả các giếng

- Lắc nhẹ, giữ ở nhiệt độ phòng, sau 2 giờ đọc kết quả

Cách đọc kết quả:

- Kết quả âm tính: tất cả hồng cầu lắng xuống đáy giếng thành chấm nhỏ

- Kết quả dương tính: hồng cầu trong giếng bị ngưng kết hơn 50 %

Đơn vị hoạt tính

- 1 đơn vị hoạt tính lectin hay 1 đơn vị hoạt tính NKHC trên 1 ml (HU/ml) chính là giá trị nghịch đảo của độ pha loãng lớn nhất mà dịch chiết lectin còn

có khả năng làm ngưng kết hơn 50 % lượng hồng cầu cho vào phản ứng

Hoạt tính lectin:được xác định theo 2 chỉ số:

- Hoạt tính tổng (U tổng ): là tổng số đơn vị hoạt tính có trong một thể tích nhất

định Đơn vị: HU

Utổng = V 2nTrong đó: V:tổng thể tích (ml)

n:số lần pha loãng

- Hoạt tính riêng (U riêng ):là số đơn vị hoạt tính lectin có trong 1mg protein

Đơn vị: HU/mg

Trong đó: Utổng:tổng số đơn vị hoạt tính

Proteintổng:tổng hàm lượng protein

2.3.3 Xác định hàm lượng protein

Xác định hàm lượng protein bằng phương pháp của Lowry và cộng sự [116], dùng albumin huyết thanh bò (BSA – Bovine serium albumin) làm chất chuẩn

- Dựa vào đồ thị protein chuẩn (BSA) có thể xác định được hàm lượng protein

ở nồng độ vài chục µg

* Hóa chất

- Dung dịch A:4g NaOH (0,1M) và 20g Na2CO3 (2 %) pha trong 1000ml nước cất

- Dung dịch B:0,5g CuSO4.5H2O (0,5 %) pha trong dung dịch Natri Xitrat (1

%) hoặc trong dung dịch Natri- Kali Tactrat 1%

- Dung dịch C:hỗn hợp của 2 dung dịch A và B theo tỉ lệ 49:1 (v/v), pha trước khi sử dụng

Ghi chú: Thuốc thử Folin, pha loãng 2 lần với nước cất trước khi sử dụng

Dung dịch gốc:Albumin huyết thanh bò (BSA) 1 mg/ml

* Các bước tiến hành

- Cân 10 mg BSA hòa tan trong 10ml nước cất, thu được dung dịch gốc có nồng độ 1 mg/ml

- Sau đó, pha loãng dung dịch gốc bằng nước cất thành các nồng độ 20, 40,

60, 80, 100 và 120 µg/ml để tiến hành xây dựng đường chuẩn

- Lấy chính xác 0,5 ml dịch chứa protein với các nồng độ khác nhau cho vào ống nghiệm, thêm vào đó 2,5 ml dung dịch C, lắc đều để yên trong 20 phút

- Sau đó, thêm vào hỗn hợp trong ống nghiệm 0,25 ml thuốc thử Folin đã pha loãng 2 lần, lắc đều và để yên trong 60 phút

- Đem so màu của hỗn hợp trên máy so màu quang điện ở bước sóng 750nm Thực hiện thí nghiệm với mẫu kép, lấy giá trị trung bình, xây dựng đường hồi quy Kết quả được xử lý theo phương pháp thống kê thông thường

Kết quả hàm lượng protein được tính toán từ đường chuẩn BSA đã xây dựng (Bảng 1, hình 1, phụ lục A)

Sau khi đã xây dựng đường chuẩn:

Mẫu thí nghiệm cũng được chuẩn bị tương tự như đã nêu trên Sau đó, đem so màu ở bước sóng 750 nm, đối chiếu với đồ thị chuẩn BSA để tính hàm lượng protein trong các mẫu

Làm thí nghiệm với mẫu kép và lấy giá trị trung bình

2.3.4 Bố trí thí nghiệm tổng quát

Hình 2.2 Qui trình nghiên cứu tổng quát

Rong B.gelatinus

Xử lý

Chiết

Lọc, ly tâm thu dịch chịchie61t Kết tủa dịch chiết

Ly tâm, thu tủa

Hòa tan tủa, thẩm tách

Ly tâm, thu dịch trong

Sắc ký trao đổi ion

Thu các phân đoạn có lectin cô đặc

Sắc ký lọc gel Sephacryl S - 200

Điện di SDS - PAGE

Lectin

Bã

Dịch

Khảo sát điều kiện chiết:

- Dung môi chiết

- Tỷ lệ nguyên liệu:dung môi chiết (w/v)

- Thời gian chiết (giờ)

2.3.5 Xác định các điều kiện tối ưu để chiết lectin từ rong B gelatinus

2.3.5.1 Khảo sát tỷ lệ nguyên liệu:dung môi chiết

Tiến hành chiết lectin từ rong B gelatinus bằng dung dịch ethanol 20 %

với các tỷ lệ nguyên liệu:dung môi (w/v): 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, ở nhiệt độ 4 oC và thời gian chiết là 6 giờ Sau đó, ly tâm với tốc độ 6000 vòng/phút trong 15 phút, thu dịch chiết thô (DCT) Xác định hàm lượng protein, hoạt tính tổng số (HTTS) và hoạt tính riêng (HTR) của từng DCT So sánh, chọn ra tỷ lệ nguyên liệu:dung môi chiết (w/v) thích hợp nhất

Hình 2.3 Bố trí thí nghiệm xác định tỉ lệ nguyên liệu:dung môi chiết thích hợp

Rong BG

Rửa sạch

Thời gian: 6h Nhiệt độ: 4 o C

2.3.5.2 Khảo sát nồng độ dung môi chiết

Tiến hành chiết lectin từ rong Betaphycus gelatinusvới hệ dung môi ethanol các nồng độ khác nhau 0 %; 10 %; 20 %; 30 %; 40 %, với tỷ lệ nguyên liệu: dung môi (w/v) thích hợp, nhiệt độ chiết 4 oC và thời gian chiết 6 giờ Sau đó, ly tâm với tốc độ 6000 vòng/phút trong 15 phút, thu DCT

Xác định hàm lượng protein, HTTS và HTR của từng DCT So sánh, chọn ra nồng độ dung môi chiết thích hợp

Hình 2.4 Bố trí thí nghiệm khảo sát nồng độ dung môi chiết thích hợp

2.3.5.3 Khảo sát thời gian chiết

Tiến hành chiết lectin từ rong Betaphycus gelatinusvới các khoảng thời

gian khác nhau: 2, 4, 6, 8 (giờ), với hệ dung môi, tỷ lệ nguyên liệu: dung môi (w/v) thích hợp đã được xác định và nhiệt độ chiết 4 oC Sau đó, ly tâm với tốc độ 6000 vòng/phút trong 15 phút, thu DC

Xác định hàm lượng protein, HTTS và HTR của từng DC So sánh, chọn ra thời gian chiết thích hợp

Hình 2.5 Bố trí thí nghiệm khảo sát thời gian chiết thích hợp