luận văn thạc sĩ nghiên cứu tinh chế và phân tích đặc điểm cấu trúc của fucoidan từ rong nâu sargassum oligocystum

Cấu trúc hóa học của các fucoidan từ một số loài rong nâu .... Tuy nhiên, các nghiên cứu về cấu trúc và hoạt tính sinh học của fucoidan từ rong nâu nói chung và chi rong Sargassum nói ri

Lời cam đoan

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của bản thân dưới sự

hướng dẫn của TS Phạm Đức Thịnh và tham khảo thêm các tài liệu đáng tin

cậy, có nguồn gốc rõ ràng Các số liệu, kết quả trong luận văn là hoàn toàn trung thực và chưa được công bố trong bất kỳ công trình nào khác

Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về nội dung luận văn này

Nha Trang, ngày 12 tháng 12 năm 2019

Tác giả luận văn

Lê Đỗ Thùy Vi

Lời cảm ơn

Trong quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận văn, tôi đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ quý báu của các thầy cô giáo, các nhà khoa học thuộc nhiều lĩnh vực cùng đồng nghiệp và bạn bè

Đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc nhất tới TS Phạm Đức Thịnh đã gợi mở cho tôi các ý tưởng nghiên cứu, tận tình hướng

dẫn và tạo mọi điều kiện tốt nhất giúp tôi hoàn thành luận văn này

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam thông qua đề tài Hợp tác quốc tế mã số QTRU04.06/18-19 đã

hỗ trợ kinh phí thực hiện đề tài luận văn

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Lãnh đạo Học viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, Ban chủ nhiệm Khoa Hóa học và Phòng Đào tạo đã

tổ chức công tác giảng dạy, tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp tôi hoàn thiện luận văn và các thủ tục cần thiết

Tôi chân thành cảm ơn sự giúp đỡ và tạo điều kiện về mọi mặt của Lãnh

đạo Viện Nghiên cứu và Ứng dụng Công nghệ Nha Trang cũng như các anh chị em công tác tại phòng Hóa Phân tích đã tạo mọi điều kiện tốt nhất

để tôi làm thực nghiệm và luôn động viên, giúp đỡ để tôi hoàn thành đề tài

luận văn này

Tôi xin gửi lời cảm ơn tới ban giám hiệu trường Đại học Khánh Hòa, Khoa Khoa học Tự nhiên và Công nghệ đã tạo mọi điều kiện tốt nhất để tôi

hoàn thành luận văn

Cuối cùng, tôi xin gửi lời tri ân của mình tới gia đình, bạn bè, những người thân luôn động viên và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và hoàn thành luận văn

Nha Trang, ngày 12 tháng 12 năm 2019 Xin chân thành cảm ơn!

Lê Đỗ Thùy Vi

Danh mục các kí hiệu và chữ viết tắt

13

C-NMR

Carbon-13 NMR Spectroscopy Phổ CHTHN Carbon 13 DMSO Dimethylsulfoxide Dimethylsulfoxid

GPC

Gel permeation chromatography Sắc ký lọc gel

GlucA Glucuronic Axit Axit glucuronic

NMR Nuclear Magnetic Cộng hưởng từ hạt nhân

Resonance (CHTHN) TFA Trifluoroacetic axit Axit trifluoroacetic

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Thành phần hoá học (%) của một số loài rong biển 10

Bảng 1.2 Thành phần hóa học của một số fucoidan 21

Bảng 1.3 Sự phân bố trọng lƣợng phân tử của fucoidan 29

Bảng 1.4 Cấu trúc hóa học của các fucoidan từ một số loài rong nâu 39

Bảng 1.5 Hàm lƣợng, thành phần hóa học và KLPT trung bình của các mẫu fucoidan phân lập từ 6 loài rong nâu Việt Nam 48

Bảng 1.6 Hoạt tính gây độc tế bào của các mẫu fucoidan trên các dòng tế bào ung thƣ gan Hep-G2 và ung thƣ mô liên kết RD 50

Bảng 2.1 Các đỉnh phổ đặc trƣng của fucoidan trên phổ hồng ngoại 59

Bảng 3.1 Hiệu quả thu nhận fucoidan chiết trong các dung môi khác nhau 67 Bảng 3.2 Hàm lƣợng fucoidan thu nhận từ 08 loài rong nâu Việt Nam 69

Bảng 3.3.Hàm lƣợng thu nhận fucoidan tổng và các phân đoạn 76

Bảng 3.4 Thành phần hóa học fucoidan thu nhận từ rong S oligocystum 76

Bảng 3.5 Thành phần hóa học các phân đoạn chiết từ rong S oligocystum 79

loài rong E Kurome đƣợc mô tả vào năm 1991 23 Hình 1.4 Cấu trúc fucoidan phân đoạn F32 tách từ rong nâu Hizikia fusiforme

25 Hình 1.5 Cấu trúc của một phân đoạn fucoidan tách và phân lập từ rong nâu

Hình 2.2 Sơ đồ chiết theo bản quyền Nga (Paten WO 2005,014657) 56 Hình 2.3 Độ dịch chuyển hóa học trong phổ NMR của polysaccharide 60

Hình 3.1 Sắc ký đồ GPC của fucoidan từ rong nâu Sargassum oligocystum

70

Hình 3.2 Phân đoạn fucoidan đƣợc chiết từ rong S.oligocystum bằng sắc ký

trao đổi anion trên cột DEAE-cellulose 72

Hình 3.3 Sắc ký đồ HPLC của các mẫu đường đơn chuẩn 74

Hình 3.4 Sắc ký đồ HPLC mẫu fucoidan chiết tách từ rong S.oligocystum 74

Hình 3.5 Sắc ký đồ HPLC xác định thành phần đường đơn phân đoạn F4 75

Hình 3.6 Sắc ký đồ HPLC xác định thành phần đường đơn phân đoạn F5 75

Hình 3.7 Phổ hồng ngoại IR của phân đoạn F4(Sargassum oligocystum) 81

Hình 3.8 Phổ hồng ngoại IR của phân đoạn F5(Sargassum oligocystum) 82

Hình 3.9 Phổ 1H-NMR của phân đoạn F4 84

Hình 3.10 Phổ 1H-NMR của phân đoạn F5 84

Hình 3.11 Phổ 13C-NMR của phân đoạn F4 85

Hình 3.12 Phổ 13C-NMR của phân đoạn F4 85

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 4

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 6

1.1 TỔNG QUAN VỀ RONG NÂU 6

1.1.1 Giới thiệu về rong biển 6

1.1.2 Giới thiệu về rong nâu 10

1.1.2.1 Phân loại và phân bố rong nâu trên thế giới 11

1.1.2.2 Phân loại và phân bố rong nâu ở Việt Nam 12

1.1.3 Thành phần hóa học của rong Nâu 15

1.1.3.1 Polysaccharide 15

1.1.3.2 Một số hợp chất khác 18

1.2 TỔNG QUAN VỀ FUCOIDAN 19

1.2.1 Giới thiệu chung về fucoidan 19

1.2.2 Thành phần hóa học của fucoidan trong một số loài rong nâu 20

1.2.3 Cấu trúc hóa học của fucoidan 22

1.2.4 Tính chất hóa lý của fucoidan 28

1.2.5 Hoạt tính sinh học và ứng dụng của fucoidan 29

1.2.5.1 oạt t nh chống ng t máu và chống hu ết khối 29

1.2.5.2 oạt t nh chống virus 32

1.2.5.3 oạt t nh kháng u và iều hòa miễn dịch 33

1.2.5.4 oạt t nh chống ox hóa 34

1.2.5.5 Giảm lipid máu 35

1.2.5.6 Kháng viêm 35

1.2.5.7 Chống lại các bệnh về gan 36

1.2.5.8 oạt t nh kháng khuẩn 36

1.2.5.9 ác d ng giảm l ợng ng hu ết trong máu 37

1.2.5.1 Các ng d ng c a fucoidan 37

1.3 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRÊN THẾ GIỚI VÀ Ở VIỆT NAM LIÊN QUAN ĐẾN NỘI DUNG NGHIÊN CỨU CỦA LUẬN VĂN 38

1.3.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới 38

1.3.2 Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam 43

CHƯƠNG 2 NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 53 2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 53

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 55

2.2.1 Phương pháp chiết tách và phân đoạn fucoidan 55

2.2.1.1 Ph ơng pháp chiết tách fucoidan từ rong nâu 55

2.2.1.2 Ph ơng pháp phân oạn fucoidan 55

2.2.2 Phương pháp nghiên cứu cấu trúc của fucoidan 57

2.2.2.1 Ph ơng pháp xác ịnh hàm l ợng tổng carboh drate 57

2.2.2.2 Ph ơng pháp xác ịnh thành phần monosaccharide 57

2.2.2.3 Ph ơng pháp xác ịnh hàm l ợng sulfate 57

2.2.2.4 Ph ơng pháp xác ịnh hàm l ợng uronic axít 57

2.2.2.5 Sắc ký thẩm thấu gel (GPC) 57

2.2.2.6 Ph ơng pháp phổ hồng ngoại IR 58

2.2.2.7 Ph ơng pháp phổ cộng h ởng từ hạt nhân NMR 60

2.3 THỰC NGHIỆM 62

2.3.1 Chiết tách và phân đoạn tinh chế fucoidan từ rong nâu 62

2.3.2 Phân tích hàm lượng tổng carbohydrate 64

2.3.3 Phân tích thành phần monosaccharide 64

2.3.4 Phân tích hàm lượng sulfate 65

2.3.5 Phân tích hàm lượng uronic axít 65

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 66

3.1 CHIẾT TÁCH VÀ PHÂN LẬP FUCOIDAN TỪ RONG NÂU 66

3.2 TÁCH PHÂN ĐOẠN VÀ PHÂN TÍCH THÀNH PHẦN HÓA HỌC CÁC PHÂN ĐOẠN FUCOIDAN 70

3.3 PHÂN TÍCH ĐẶC TRƯNG CẤU TRÚC CỦA FUCOIDAN 80

3.3.1 Các đặc trưng cấu trúc thu được từ phổ hồng ngoại IR 80

3.3.2 Các đặc trưng cấu trúc thu được từ phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR 83

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 87

4.1 KẾT LUẬN 87

4.2 KIẾN NGHỊ 87

TÀI LIỆU THAM KHẢO 92

Fucoidan rong nâu là một polymer dị thể có cấu trúc rất phức tạp bởi tính đa dạng về thành phần đường đơn, khả năng phân nhánh cũng như các vị trí nhóm sulfate trên các gốc đường biến đổi không theo quy luật Thành phần của nó bao gồm nhiều loại đường, chủ yếu là fucose và một số các gốc đường khác như galactose, glucose, manose, xylose , bên cạnh đó trong một số trường hợp còn phát hiện thấy sự có mặt của các nhóm uronic axit và acetyl Ngoài ra, các nghiên cứu trước đây còn chỉ ra rằng sự biến đổi về cấu trúc của fucoidan phụ thuộc vào loài rong, mùa vụ thu hoạch, vùng địa lý thu mẫu cũng như các kỹ thuật chiết tách

Việt Nam có nguồn tài nguyên rong nâu rất đa dạng và phong phú với hơn 100 loài đã được phát hiện gồm nhiều chi rong khác nhau, trong đó riêng

chi Sargassum chiếm khoảng hơn 60 loài, ước tính đạt tới 10.000 tấn rong

khô/năm [5,6] Đây được coi là nguồn tiềm năng rất lớn cho các nghiên cứu

về fucoidan theo hướng phát triển thành các sản phẩm có giá trị cao ứng dụng trong lĩnh vực y dược Fucoidan đã được nghiên cứu ở Việt Nam trong hơn

một thập kỷ qua, các kết quả mà các nhà khoa học trong nước thu được là rất

có ý nghĩa, bước đầu đã đưa được sản phẩm fucoidan từ rong nâu Việt Nam vào phục vụ cuộc sống Tuy nhiên, các nghiên cứu về cấu trúc và hoạt tính

sinh học của fucoidan từ rong nâu nói chung và chi rong Sargassum nói riêng

ở Việt Nam vẫn còn rất ít, theo các tài liệu tham khảo cho thấy các nghiên

cứu về fucoidan từ loài rong Sargassum oligocystum ở Việt Nam vẫn chưa

đầy đủ, mới chỉ có các nghiên cứu sơ bộ về thành phần hóa học của mẫu fucoidan chiết thô.Trong khi đó, đây là một trong số các loài rong tương đối phổ biến và có trữ lượng tự nhiên lớn so với một số loài rong khác trong cùng

chi Sargassum, có khả năng khai thác để sử dụng làm nguyên liệu cho việc

sản xuất fucoidan vào mục đích làm thực phẩm chức năng hoặc làm thuốc Vì

vậy, thực hiện đề tài “Nghiên cứu tinh chế và phân tích đặc điểm cấu trúc

của fucoidan từ rong nâu Sargassum oligocystum” là cần thiết nhằm đóng

góp thêm các nghiên cứu về fucoidan từ rong nâu ở Việt Nam theo hướng phát triển các hoạt chất mới cũng như khả năng ứng dụng hiệu quả fucoidan trong lĩnh vực y dược

Mục tiêu của luận văn:

- Nghiên cứu tinh chế và phân đoạn fucoidan từ rong nâu Sargassum oligocystum Việt Nam

- Phân tích thành phần hóa học và các đặc trưng cấu trúc của fucoidan thu nhận được sau quá trình chiết tách

Để đạt được mục tiêu đề ra, nội dung nghiên cứu của luận văn bao

gồm:

- Thu thập rong nâu Sargassum oligocystum tại vùng biển Nha Trang

- Tách chiết và phân đoạn fucoidan từ rong nâu thu được

- Phân tích thành phần hóa học của fucoidan và các phân đoạn của chúng

- Xác định các đặc trưng cấu trúc của phân đoạn fucoidan có hàm lượng quan tâm

1 CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 TỔNG QUAN VỀ RONG NÂU

1.1.1 Giới thiệu về rong biển

Rong biển hay còn gọi là tảo, là những loài thực vật bậc thấp sinh sống

ở biển, sống tự dưỡng bằng cách quang hợp, hình thái dạng tản, thuộc nhóm tảo biển Chúng là loại thực phẩm lành mạnh, tốt cho sức khỏe và còn được

sử dụng như một loại thuốc thảo dược Rong biển sinh trưởng phát triển nhanh, có vòng đời sinh trưởng không quá một năm, tốc độ tăng trọng nhanh

và tạo ra sinh khối lớn Tổng số loài rong biển trên thế giới được phân loại chủ yếu thuộc 3 ngành chính:

Ngành rong lục (Chlorophyta): 900 loài

Ngành rong nâu (Phaeophyta): 1800 loài

Ngành rong đỏ (Rhodophyta): 4000 loài

Hiện nay đã có nhiều công trình nghiên cứu phát hiện loài mới bổ sung vào tổng số loài rong biển phân bố trên toàn thế giới Trong số 03 ngành rong trên, rong nâu là ngành rong có trữ lượng lớn nhất và phân bố đa dạng nhất với hơn 1800 loài đã được phân loại

Tại các vùng biển ở Việt Nam, tổng số loài rong biển ước tính khoảng 1.000 loài, trong đó có khoảng 639 loài có trữ lượng lớn với 151 loài thuộc

ngành rong lục (Chlorophyta), 143 loài thuộc ngành rong nâu (Phaeophyta),

269 loài thuộc ngành rong đỏ (Rhodophyta) và 76 loài thuộc ngành rong lam (Cyanophyta) [6] Trong tất cả các loài này, 310 loài phân bố ở vùng ven biển

các tỉnh phía Bắc và 484 loài hiện diện ở các tỉnh phía Nam, 156 loài phân bố

ở cả hai vùng [6,7]

Đại dương cung cấp cho trái đất khoảng 200 tỷ tấn rong biển hàng năm Các nhà khoa học cho rằng trên 90% cacbon trên trái đất được tổng hợp nhờ quang hợp, trong đó 20% có nguồn ngốc từ rong biển Việc sử dụng các sản phẩm từ rong biển đã trải qua thời kì lịch sử rất lâu dài Các dấu vết khảo cổ học cho thấy, người Nhật đã dùng rong biển từ hơn 10.000 năm trước Trong

nền văn hoá Trung Quốc cổ đại, rong biển được coi là đặc sản dùng trong các món ăn của triều đình và chỉ hoàng tộc hay khách của hoàng thân, quốc thích mới được thưởng thức Rong biển cũng được sử dụng trong nhiều lĩnh vực khác, chúng là nguồn nguyên liệu tự nhiên cho công nghiệp thực phẩm (Cải biển Ulva lactuca, bột rong biển, chất tạo gel E400, E401 Alginate–Agar E406, E407, Carrageenan ), mỹ phẩm (chất tạo kết cấu và hoạt hóa), công nghiệp (Phycocolloids, hydrocolloids tạo độ sánh, gel hoặc chất ổn định), thức ăn gia súc, nông nghiệp Qua các tài liệu tham khảo trong lịch sử và trong thời gian sử dụng lâu dài, không có nguy cơ gây hại sức khỏe nào được

đề cập đến Vì vậy, ngày nay rong biển được xếp vào loại thực phẩm chức năng ngày càng được sử dụng rộng rãi trên thế giới Hiện nay, Nhật Bản, Trung Quốc và Hàn Quốc là những quốc gia tiêu thụ lượng rong biển thực phẩm lớn nhất và nhu cầu sử dụng của họ là cơ sở của nghề nuôi trồng rong biển với sản lượng hằng năm trên toàn thế giới khoảng 6 triệu tấn rong tươi, trị giá lên đến 5 tỉ USD Các nước cung cấp rong biển làm thực phẩm chính là Trung Quốc, Nhật Bản, Hàn Quốc và Đài Loan Các nước cung cấp chính rong biển cho các ngành công nghiệp là Đan Mạch, Pháp, Na Uy, Tây Ban Nha, Mỹ và Nhật

*Thành phần hóa học có trong rong biển

Rong biển có thành phần hóa học đa dạng, các hợp chất có trong rong biển đều là những hợp chất có giá trị dinh dưỡng và dược dụng cao Hàm lượng của các chất có trong rong biển phụ thuộc vào loài rong, điều kiện sống, sinh trưởng và phát triển của rong Theo kết quả phân tích ở các loài rong đã được nghiên cứu, thành phần trong rong biển gồm có : nước chiếm 80 – 90 %, protein chiếm khoảng 5 – 20,5% trọng lượng khô, 17 loại axít amin, trong đó có mặt tất cả các amino axit thiết yếu, hàm lượng lipid trong rong chiếm từ 0,2 – 0,6%, các loại sắc tố : sắc tố màu nâu (fucoxanhthin), các sắc

tố xanthophyll khác là violaxanthin, antheraxanthin, neoxanthin, diainoxanthin và diatoxanhthin, chất khoáng, các nguyên tố đa lượng ( K, Na,

Mg, S, P,…) và đặc biệt là các nguyên tố vi lượng ( Sr, Fe, Cu, Zn, Mn, Mo,…) Thành phần hóa học quan trọng của rong nâu là các glucid, chúng

được chia thành 2 nhóm : monosaccharide và polysaccharide Nhóm monosaccharide gồm các đường đơn như : mannitol, fucose, galactose, manose, xylose,….trong đó quan trọng nhất là mannitol Mannitol thuộc nhóm đường kép của rong nâu, được phát hiện đầu tiên vào năm 1884 và nghiên cứu sâu hơn vào năm 1913 Các nghiên cứu cho thấy hàm lượng mannitol của rong biển ở vùng biển phía Nam cao hơn phía Bắc Hàm lượng mannitol trong rong biển thường cao vào các tháng mùa hè và có xu hướng tăng dần theo thời gian sinh trưởng của rong Mannitol được sử dụng nhiều trong dược phẩm, trong công nghiệp để làm nguyên liệu tổng hợp một số hợp chất hữu cơ, làm thuốc nổ, diêm và trong công nghiệp thực phẩm đặc biệt là trong công nghiệp bánh kẹo để sản xuất các loại bánh gato có độ ngọt cao nhưng đảm bảo độ mềm và xốp của bánh [8,9,10] Nhóm polysaccharides gồm có : fucoidan, laminaran, alginate, agar và carrageenan Fucoidan là hợp chất được đặc biệt quan tâm nghiên cứu nhờ các tính chất sinh học đa dạng và đặc thù của nó như khả năng tăng cường miễn dịch, chống đông tụ máu, chống viêm nhiễm, kháng virus, điều trị rối loạn đường huyết và hỗ trợ trong điều trị ung thư Laminaran đóng vai trò như chất dự trữ trong rong nâu Laminaran là chất tạo hệ miễn dịch ở động vật có vú, laminaran sulfate hóa đã được chứng minh là có đặc tính giống heparin Laminaran có hoạt tính chống đông tụ máu và chống ung thư Agar và alginate được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp thực phẩm : được sử dụng làm chất ổn định trong bánh kẹo, kem, nước ngọt hay làm chất làm đông đặc và tạo gel trong sản xuất thịt đông lạnh; trong công nghệ sinh học được dùng làm môi trường nuôi cấy, trong y học dùng làm vải băng bó vết thương truyền thống, lấy dấu răng, pha thuốc, pha huyết thanh, trong một số công thức chống chảy máu dạ dày, trong việc cấy ghép tế bào, tác động vào các tế bào sản xuất insulin để điều trị bệnh tiểu đường loại 1 Vỏ nang bằng alginate không bị dịch tiêu hóa phân hủy và chỉ tan trong ruột Màng được tạo thành từ alginate và gelatin kết hợp với một số chất như tinh dầu tràm, rau má, nghệ, dầu mù u có tác dụng trong điều trị vết thương như vết bỏng, làm giảm sự nhiễm khuẩn, làm nhanh lành vết thương; trong công nghiệp giấy : alginate được trộn lẫn với bột giấy rồi xử lý sẽ cho

bề mặt giấy nhẵn, mịn không xù xì; trong công nghiệp dệt và tơ nhân tạo:

alginate cho nhũ tương mịn và bền nên được dùng trong kỹ nghệ sơn, xà phòng, cao su, phim ảnh, vải lợp nhuộm vecni và sơn để tăng độ bền của màu Màu vẽ có alginate dễ tan đều trong nước Carrageenan là một ionic polysaccharide, mạch thẳng được sulfate hóa, chúng mang đầy đủ tính chất đặc trưng của polysaccharide Carrageenan là polysaccharide có khả năng tạo gel và làm đặc dung dịch, chúng tồn tại trong một số loài rong đỏ thuộc họ Rhodophyceae Hiện nay, carrageenan thường được chiết từ một số loài rong như Gigartina, Chondrus, Iridea, Eucheuma Carrageenan tách chiết từ các loài rong khác nhau có thành phần hóa học, đặc điểm cấu trúc cũng như khả năng tạo gel khác nhau Tính chất và khả năng tạo gel của carrageenan phụ thuộc vào độ lặp lại của các mắt xích, vị trí và số lượng nhóm sulfate và đặc biệt là sự có mặt của vòng 3,6 anhyđro D – galactose Cầu 3,6 anhyđro D – galactose cho phép tạo nên cấu trúc xoắn, là điều kiện chủ yếu để tạo gel của carrageenan

Ngoài ra, rong biển còn được sử dụng để làm thức ăn cho nuôi tôm, thức ăn gia súc, được dùng trong công nghiệp dệt, nhuộm, mực in, sơn, hàn điện, lọc và hấp thụ các hợp chất, công nghiệp giấy, trong kỹ thuật nuôi cấy

vi sinh Rong biển cũng là nguồn nguyên liệu cho công nghiệp nước giải khát, đồ hộp, socola, mỹ phẩm cao cấp Rong biển cũng được sử dụng chữa trị ung thư theo các bài thuốc gia truyền dưới dạng dùng kết hợp với các thuốc khác Polyphenol trong rong nâu cũng được dùng làm trà chống lão hóa Năm 2007, tại Mỹ đã có quy trình sản xuất biodiesel từ rong biển Thực

tế còn cho thấy rong biển có tiềm năng sử dụng trong xử lý nước thải Một

số loài rong biển có khả năng hấp thụ các ion kim loại nặng như : Zn và Cd

từ nước bị ô nhiễm Do khả năng hấp thụ cao mà một số vi lượng có trong rong khá cao nên rong được dùng làm thức ăn bổ sung để phòng bệnh thiếu một số chất như sắt, iod, [1,11,12,13,14]

Bảng 1.1 Thành phần hoá học (%) của một số loài rong biển

Ascophylm nodosum

Laminariad igitata

Alariaes culenta

Palmaria palmata

Porpha

sp

Porphyra yezoensis

Nd : Không phát hiện thấy

1.1.2 Giới thiệu về rong nâu

Rong nâu là nhóm rong có kích thước lớn (macroalgae), chủ yếu gồm 4

chi Sargassum, chi Turbinaria, chi Dictyota, chi Padina, sản lượng tự nhiên cao nhất so với các nhóm rong biển khác Đặc biệt chi rong Sargassum, chúng

hình thành các thảm rong biển rộng từ vài hecta cho đến cả vài chục hecta, các chi còn lại mật độ vừa phải, chúng mọc trên các bãi triều và rạn ngầm có nền đáy đá hoặc san hô Chúng phân bố rộng, chiếm ưu thế ở các bãi triều ven biển ở vùng biển nhiệt đới và cận nhiệt đới Rong nâu nơi sâu phát triển muộn hơn nơi cạn; sinh lượng cao vào tháng 3 và kéo dài đến tháng 6 Đặc biệt, những vùng có nền đáy cứng, nước trong, sóng mạnh, những bãi triều có độ dốc 5-25% rong phát triển tốt nhất [1,6,7,10,11,12]

1.1.2.1 Phân loại và phân bố rong nâu trên thế giới

Việc phân loại tùy thuộc vào thành phần cấu tạo, đặc điểm hình thái, đặc điểm sinh sản, giải phẫu, sinh lý sinh hoá, phôi sinh học người ta chia rong thành một số ngành riêng biệt Con số các ngành rong hiện nay vẫn chưa thống nhất tùy theo các tác giả khác nhau

Một trong những tác giả có các công trình nghiên cứu quan trọng về bộ rong nâu này là J Agardh Năm 1820, ông đã lập ra một hệ thống phân loại về chi rong Mơ và đã mô tả 62 loài Ông chia chi này thành 7 nhóm và sắp xếp vào một bộ Fucoideae Năm 1824, ông bổ sung thêm số lượng lên 67 loài Sau đó một số tác giả khác như Greville, Gaudichaud, Montagne… có mô tả thêm loài nhưng vẫn sắp xếp vào hệ thống J Agardh Năm 1889, ông đã bổ sung thêm vào hệ thống phân loại với nhiều chi, nhóm… trong đó có 180 loài

Hệ thống phân loại của J Agardh đưa ra năm 1889 đã được nhiều tác giả đồng tình và sử dụng Quan trọng nhất là Grunow (1915-1916), đã triển khai

và sử dụng hệ thống phân loại của J Agardh, mô tả 230 loài với nhiều thứ và dạng trên cơ sở thu mẫu ở nhiều nước trên thế giới Một số tác giả khác đã góp phần vào việc nghiên cứu họ này như ở Nhật Bản đã mô tả 41 loài, 45 loài ở vùng biển Ấn Độ

Đến năm 1931-1936, Setchell nghiên cứu rong biển ở Hồng Kông, Trung Quốc đã đặc biệt chú ý đến họ Sargassaceae, ông đã mô tả thêm 32 loài Từ đó đến nay, nhiều tác giả ở Trung Quốc, Nhật Bản, Đài Loan, Philippin, Úc, Ấn Độ, Mỹ… đã có nhiều nghiên cứu bổ sung, đã có nhiều hội

nghị quốc tế về rong biển kinh tế, trong đó các loài rong nâu mới cũng được

bổ sung, nâng tổng số loài được biết hiện nay trên thế giới khoảng 1500 loài Như vậy đến thời điểm này rong nâu được phân chia thành 9 bộ, 265 chi

và hơn 1500 loài trong đó số lượng thành phần loài một số chi rong nâu trên thế giới như:

Chi Sargassum C.Agardh, 1820 thuộc họ Sargassaseae, bộ Fucales có

khoảng 873 tên loài trong cơ sở dữ liệu www.algaebase.org, nhưng trong đó

562 loài được chấp nhận sự phân loại Chi Turbinaria J.V.Lamouroux, 1825

thuộc họ Sargassaseae, bộ Fucales có khoảng 53 tên loài trong cơ sở dữ liệu www.algaebase.org, nhưng trong đó 28 loài được chấp nhận sự phân loại

Chi Dictyota J.V.Lamouroux, 1809 thuộc họ Dictyotaceae, bộ

Dictyotales có khoảng 316 tên loài trong cơ sở dữ liệu www.algaebase.org, nhưng trong đó 76 loài được chấp nhận sự phân loại

Chi Padina Adanson, 1763 thuộc họ Dictyotaceae, bộ Dictyotales Hiện nay số lượng loài chi Padina có khoảng 62 tên loài trong cơ sở dữ liệu

www.algaebase.org, nhưng trong đó 39 loài được chấp nhận sự phân loại (Tsutsui Isao et al, 2005)

Rong nâu (Phaeophyta) phân bố nhiều nhất ở Nhật Bản, tiếp theo là

Canada, Việt Nam, Hàn Quốc, Alaska, Ai-len, Mỹ, Pháp, Ấn Độ, kế tiếp là Chi Lê, Argentina, Brazil, Hawaii, Malaysia, Mexico, Myanmar, Bồ Đào Nha Trong đó bộ Fucales, đối tượng phổ biến và kinh tế nhất của rong nâu

đại diện là họ Sargassaceae với hai giống Sargassum và Turbinaria phân bố chủ yếu ở vùng cận nhiệt đới Sản lượng rong nâu lớn nhất thế giới tập trung tại Trung Quốc với trên 667.000 tấn khô, tập trung vào 3 chi Laminaria, Udaria, Ascophyllum Hàn Quốc khoảng 96.000 tấn với 3 chi Udaria, Hizakia, Laminaria Nhật Bản khoảng 51.000 tấn Laminaria, Udaria, Cladosiphon, Na Uy khoảng 40.000 tấn, Chile khoảng 27.000 tấn

1.1.2.2 Phân loại và phân bố rong nâu ở Việt Nam

Đối với rong nâu Việt Nam, các tác giả trong nước và nước ngoài đã nghiên cứu tương đối đầy đủ về mặt phân loại Việc phân loại được thực hiện

theo phương pháp hình thái so sánh, trong đó các tiêu chí phân loại là đặc điểm của cơ quan sinh sản vì đây là cơ quan ít biến đổi theo các điều kiện sinh thái, được sử dụng phổ biến ở Việt Nam và trên thế giới Theo một số tác giả con số thành phần loài hiện có thể dự báo khoảng 800 loài So với các nước trong khu vực thì thành phần loài của rong biển Việt Nam đa dạng phong phú giữa tự nhiên và nuôi trồng, có nhiều tiềm năng, góp phần lớn về sản lượng khai thác nguồn lợi rong biển khu vực Đông Nam Á Hiện nay, một số chi

rong nâu được thống kê bao gồm: Chi Dictyota 14 loài, chi Padina 5 loài, chi Turbinaria 5 loài, chi Sargassum 68 loài trong đó ở Khánh Hòa hiện nay khảo sát có 39 loài [5,6,7,8,9,10]

Năm 2013, theo công bố của Nguyễn Văn Tú, Lê Như Hậu và cộng sự đã

có tổng số 827 loài được công bố, trong đó chi rong nâu Chlorophyta (180

loài) So với các nước Philippin, Đài Loan, Thái Lan hay Malaysia, rong biển Việt Nam rất đa dạng về số lượng loài

Nguồn lợi rong nâu được tập trung phân bố trên 4 khu vực ven biển Khánh Hòa theo trình tự từ Bắc đến Nam (Hình 1.1)

+ Khu vực 1: Vịnh Vân Phong (Hòn Bịp, Hòn Ó, Hòn Dút, Cù Meo, Rạn Trào, Rạn Tướng, Mũi Dù, Mũi Đá Son, Sủng Rong, Lạch Cổ Cò, Sủng Ké )

+ Khu vực 2: ven biển xã Ninh Thuỷ, xã Ninh Phước, xã Ninh Vân, Đầm Nha Phu (Bãi Đá lát, Mỹ Giang, Hòn khô, Bãi Đá nọc, Bãi Cây Tra, Bãi

Cỏ, Bãi Cây Bàn, Bãi Vũng Tàu, Hòn Thị, Đảo Khỉ và vài bãi cạn ngầm Bãi

Cỏ - Thị xã Ninh Hòa

+ Khu vực 3: Vịnh Nha Trang (Mũi Kê Gà, Bãi tiên Đường Đệ, Hòn Chồng, khu vực Hòn Đỏ, Hòn Rùa, Đảo Hòn Tre - Mũi Nam Bãi Trủ, Bãi Rạn, Bãi Ngéo, Hòn Một, Hòn Mun, Bãi rạn ngầm Lớn, Mũi Cá sấu Trí Nguyên, Sông Lô, Mũi Cầu

+ Khu vực 4: Đảo Bình Ba, xã Cam Lập ( dọc theo bờ Đông bán đảo Cam Lập, từ mũi Sốp đến mũi Cà Tiên) – Thành phố Cam Ranh

Qua quá trình khảo sát thực địa các khu vực ven biển Khánh Hòa, đã xác định số lƣợng thành phần loài riêng một số chi rong nâu có tần suất xuất hiện

tại 4 khu vực: chi Dictyota 9 loài, chi Padina 3 loài, chi Turbinaria 4 loài, chi Sargassum 21 loài

Hình 1.1.Bản đồ vị trí khu vực điều tra phân bố một số chi rong nâu tỉnh

Khánh Hòa

1.1.3 Thành phần hóa học của rong Nâu

1.1.3.1 Polysaccharide

Polysaccharide là thành phần chính và có nhiều ứng dụng quan trọng nhất trong rong nâu, bao gồm fucoidan, alginate, laminaran và dẫn xuất của

chúng Một số thành phần khác như porphyran, axít alginic và ascophyllan

đã được tìm thấy ở một số loài rong nâu [15,16,17] Ascophyllan đã được

tách chiết từ rong nâu Ascophyllum nodosum ức chế sự phát triển và tiêu

diệt tế bào ung thư

*Fucoidan là một anion polysaccharide sulfate hóa dị thể nằm trong thành tế bào của rong nâu, hợp chất này được Kylin mô tả đầu tiên vào năm

1913 từ loài rong nâu Laminaria digitata Thành phần cấu tạo rất phức tạp,

trong đó fucose chiếm từ 18,6% đến 60%, sulfate chiếm từ 17,7% đến 32,9%, ngoài ra còn có mặt các thành phần đường khác như galactose, glucose, mannose, xylose, rhamnose , và uronic axit Từ kết quả các số liệu trong bảng 1.1, ta thấy fucoidan chỉ có trong thành phần của ngành rong nâu mà không có trong thành phần của hai ngành rong đỏ và rong lục [16]

*Alginate là anionic polysaccharide, là co-polymer mạch thẳng được tạo thành từ liên kết (1→4) glycosid của axít β-D-mannuronic (M) và axít α-

L-guluronic axit (G) Natri alginate tách từ rong nâu Sargassum fulvellum có

khả năng ức chế sự phát triển của khối u Axít β-D-mannuronic (M) và axít L-guluronic axit (G) có cấu hình khác nhau: axít mannuronic có cấu hình 4C1 còn axít guluronic là 1C4 Chính sự khác nhau của mạch cấu trúc này nên hai uronic thể hiện các tính chất hóa học, sinh học khác nhau [17] Trong phân tử alginate, tỷ lệ, trình tự và sự phân bố của hai monomer thay đổi rất rộng tùy theo nguồn gốc của alginate Sự sắp xếp ngẫu nhiên của 2 monomer M và G trong mạch alginate theo 3 dạng cấu trúc block: Block homopolymeric guluronic (Poly-G) gồm các gốc axít guluronic nối tiếp nhau (GGGG); Block homopolymeric mannuronic (Poly-M) gồm các gốc axít mannuronic nối tiếp nhau (MMMM) ; Block heteropolymeric ngẫu nhiên (Poly-MG) hai gốc axít guluronic và axít mannuronic luân phiên nối tiếp nhau (MGMGMGMG)[18]

α-Độ dài trung bình của các khối, trình tự của chúng trong mạch phân tử thay đổi tùy theo nguồn gốc của alginate Do cấu trúc của các gốc G và M khác nhau nên hình dạng của các khối cũng khác nhau: Poly – M có cấu tạo ít gấp khúc và tạo nên sự mềm mại của mạch phân tử, trong khi poly - G gấp khúc mạnh hơn và có độ bền chặt hơn Cấu trúc hóa học của alginate có tính chất quyết định đến các tính chất vật lý, hóa học và sinh học của nó [18]

Tùy theo thành phần hóa học và khối lượng phân tử mà alginate có ảnh hưởng khác nhau đến hệ sinh học Hoạt tính sinh học của alginate cho thấy

sự tăng trưởng quá nhanh các thực bào và nguyên bào sợi, tương tự như một phản ứng viêm với dị vật Các thí nghiệm cho thấy mức độ cảm ứng các yếu

tố gây ra hoại tử khối u và interleukin 1 phụ thuộc hàm lượng axit mannuronic trong mẫu alginate Kết quả này giải thích các phân đoạn giàu mannuronat không tham gia vào việc tạo gel sẽ thoát ra ngoài các viên nang

và khởi động một phần phản ứng miễn dịch này có thể có liên quan một phần với các liên kết (1 → 4) glycoside, vì các polyuronat hormopolymer diequartorial khác như axít D– glucuronic cũng thể hiện tính chất này Khả năng miễn dịch của các polymannuronat đến nay đã được chứng minh trong các thử nghiệm lâm sàng để ngăn ngừa các bệnh nhiễm khuẩn, để làm tăng khả năng miễn dịch không đặc hiệu

Ngoài ra, alginate có tính tẩy xạ, khi cơ thể bị nhiễm chất phóng xạ strontium bằng con đường tiêu hóa, có thể dùng natri alginate để đưa chất phóng xạ này ra khỏi cơ thể Alginate tạo kết tủa bền với strontium do đó ngăn ngừa được sự hấp thu strontium vào trong máu và phức hợp này sẽ được thải theo phân ra ngoài Việc dùng alginate làm chất tẩy xạ không ảnh hưởng đến quá trình trao đổi ion Ca2+

và khả năng phát triển bình thường của cơ thể Ngoài ra một số nghiên cứu cũng cho thấy alginate còn có khả năng chống oxy hóa, tác dụng chống đông tụ máu, phòng xơ vữa động mạch ở trẻ em [18]

Alginate còn có rất nhiều ứng dụng khác trong cuộc sống Các ứng dụng của alginate đều dựa trên ba đặc điểm đó là khả năng tạo dung dịch có

độ nhớt cao; khả năng tạo gel khi thêm muối canxi vào dung dịch natri

alginate trong nước; khả năng tạo màng natri hay canxi alginate và sợi canxi alginate Ngày nay các alginate đang được sử dụng rộng rãi trong thực phẩm, các ngành công nghiệp dệt may và các lĩnh vực bao gồm cả giấy mạ, dược phẩm và hàn…Ví dụ kỹ nghệ thức ăn, người ta dùng rất nhiều alginate để làm kem, socola, bánh, món tráng miệng Trong công nghiệp, alginate được sử dụng rất nhiều trong kỹ nghệ giấy, dệt, vải hồ, kỹ nghệ cao su Nhu cầu alginate dùng trong in vải sợi chiếm khoảng 50% tổng lượng alginate sản xuất trên toàn thế giới Trong công nghệ dược phẩm, alginate thường dùng làm chất nhũ hóa và chất gây thấm trong các dạng thuốc có cấu trúc nhũ tương và hỗn dịch, dùng trong tá dược bao của viên nén hay tham gia vào thành phần của vỏ nang Alginate có thể được sử dụng để kết hợp để làm màng bao của viên tan trong ruột, điều này rất có lợi cho việc bào chế các thuốc ảnh hưởng đến đường tiêu hóa Alginate dùng để sản xuất lớp màng chống chất phóng

xạ, nó thường dùng để chỉ thị độ ô nhiễm phóng xạ của vùng biển Màng được tạo thành từ gelatin và alginate được ứng dụng trong điều trị tổn thương bỏng Màng này có tác dụng ngăn cản sự xâm nhiễm, giảm viêm đẩy mạnh quá trình lành hóa vết thương, đặc biệt có hiệu quả ở dạng bỏng khô [18]

*Laminaran là một polysaccharide tạo thành từ glucose, có tên thường

gọi là laminarin, tên gọi theo danh pháp quốc tế là : 1,3 – β – D – glucan Laminaran là một polysaccharide dự trữ của rong nâu, hàm lượng từ 1 – 15% trọng lượng rong khô tùy thuộc vào từng loại rong, vị trí địa lý và môi trường sinh sống của từng loại rong Thường vào mùa hè hàm lượng laminaran giảm

vì phải tiêu hao cho quá trình sinh trưởng và phát triển của cây rong Laminaran được hình thành từ các gốc D-glucan kết hợp với nhau bằng các liên kết β-(1→3) và một ít liên kết β-(1→6), gốc đường cuối mạch của một số phân tử có thể có các gốc mannitol hay vẫn là glucose Các gốc laminaran từ các loài rong khác nhau thì khác nhau rõ rệt về tỉ lệ của các liên kết β-(1→3)

và liên kết β-(1→6) cũng như cách thức nối của các liên kết này trong chuỗi glucan[15,18] Laminaran là thực phẩm chức năng có giá trị dược lý được FDA chấp thuận trong việc chống đông máu, làm giảm hàm lượng cholesterol trong máu và kích thích miễn dịch bẩm sinh Khả năng chống tia bức xạ của chất chiết từ rong biển thiên nhiên này đem lại niềm hy vọng cho những

người đang dùng tia phóng xạ chữa trị các khối u gây ung thư trong cơ thể

Ngoài ra, laminaran còn có tác dụng tăng sức đề kháng với nhiễm trùng và

thúc đẩy sự lành của vết thương Laminaran với những đặc tính của một alpha

– amylase gây ra kích hoạt các enzyme có mặt trong quá trình tăng trưởng ở

thực vật và sự kích thích của hoạt động phân giải protein của các tế bào được

xử lý Hiện nay, laminaran được nghiên cứu để sử dụng như là một chất thúc

đẩy hạt giống nảy mầm và tăng tốc độ tăng trưởng cây trồng [15,18]

1.1.3.2 Một số hợp chất khác

*Hợp chất phenolic : Hợp chất phenolic là các hợp chất chuyển hóa

thứ cấp của thành phần hóa học rong nâu, là hợp chất chứa các nhóm - OH

gắn trực tiếp vào nhân bezen, bao gồm các hợp chất flavonoid, lignnin, tannin

và phlorotannin Các hợp chất này có nhiều hoạt tính khác nhau

*Hợp chất Carotenoid : Carotenoid là các hợp chất màu tự nhiên

được tìm thấy ở nhiều loài thực vật và động vật Trong thành phần hóa học

của rong nâu có chứa các hợp chất catatonic bao gồm lutein, zeaxanthin và

fucoxanthin Rong nâu được coi là giàu có hợp chất chuyển hóa thứ cấp đặc

biệt như carotenoid có nhiều hoạt tính sinh học như hoạt tính chống oxi hóa,

chống ung thư, chống viêm và chống virus Các hợp chất a-carotene,

b-carotene, chlorophyll a và phaeophytin a đều có những hoạt tính sinh học vô

cùng quý giá [17]

*Hợp chất Terpenoid: Một số terpenoid được tách từ rong nâu

Sargassum fallax, sargaquinone, axít sargaquinoic, axít sargahydroquinoic,

axít fallachromonoic, fallahydroquinone, fallaquinone, sargachromenol Các

hợp chất này có họat tính chống oxi hóa và ngăn ngừa ung thư Các hợp chất

atomarianone A , và atomarianone B đã được tách từ Taonia atomania có

hoạt tính gây độc tế bào ung thư [17]

Hợp chất diterpenoid tách từ rong nâu Cystoseira mediterranea như

taondiol , isoepitaondiol , stypodiol , stypoldione và sargaol , các hợp chất này

có hoạt tính chống oxi hóa và chống ung thư Hợp chất 2β,3α-epitaondiol,

flabellinol đã được tách từ rong nâu Styporodium flabelliforme có hoạt tính

gây một số tế bào ung thư [17]

Ngoài các hợp chất được nêu trên đây, một số nhà khoa học còn tiến hành nghiên cứu cấu trúc và hoạt tính sinh học của protein được nghiên cứu tách chiết từ một số loài rong nâu Các aminoaxit đã được nghiên cứu nhiều gồm : Deoxylapachol a 1,4 - Naphthoquinone và dẫn xuất đã được tách từ

rong nâu Landsburgia quercifolia hay Sargachromanol E tách từ rong Sargassum siliquastrum, các hợp chất này có khả năng gây độc tế bào ung thư Hợp chất ergosterol tách từ rong nâu Lyengaria stellata, Fucosterol tách

từ rong nâu Pelvetia siliquosa, Cystoseira foeniculacea và Sargassum

angustifolium Các hợp chất axít α-linolenic, axít γ-linolenic và axít

docosahexaenoic ngăn chặn sự phát triển của tế bào ung thư [18]

1.2 TỔNG QUAN VỀ FUCOIDAN

1.2.1 Giới thiệu chung về fucoidan

Fucoidan là một anion polysaccharide sulfate hóa nằm trong thành tế bào của rong nâu, hợp chất này được phân lập và mô tả lần đầu tiên bởi Kylin vào năm 1913 [16], khi đó nó được đặt tên là “fucoidin” theo tên gọi của gốc đường fucose là thành phần chính cấu tạo nên polysaccharide này Nhưng theo danh pháp carbohydrate nghiêm ngặt, thuật ngữ này là không chính xác, vì các polysaccharide được tạo nên bởi fucose và sulfate được đặt tên là sulfate fucan Các polysaccharide như vậy trên thực tế chỉ có mặt trong ngành Da gai, cụ thể là cầu gai và hải sâm Ngược lại, thành phần và cấu trúc của các polysaccharide rong nâu phức tạp hơn nhiều Ngoài hai thành phần chính là fucose và sulfate, trong phân tử của fucoidan còn có thể chứa thêm các đường đơn khác như: galactose, xylose, manose, glucuronic axít , đồng thời có thể bị acetyl hóa một phần Cấu trúc hóa học chi tiết của các polyme sinh học phức tạp này trong nhiều trường hợp còn chưa được biết đến Chính vì vậy, tên gọi phổ thông “fucoidan” là thích hợp nhất nhằm dùng cho tất cả các polysaccharide sulfate hóa của rong nâu, nó không liên quan đến thành phần của chúng, nhưng hiển nhiên không được sử dụng cho fucan sulfate hóa có nguồn gốc động vật Nhờ sự đa dạng về thành phần và

cấu trúc mà fucoidan sở hữu nhiều hoạt tính sinh học thú vị như: kháng đông

tụ máu, kháng huyết khối, kháng virut, chống kết dính tế bào, chống tạo mạch (antiangiogenic), kháng viêm, kháng u, kháng bổ thể (anticomplementary), điều biến hệ miễn dịch, v.v Nhờ vậy, fucoidan đã trở thành đối tượng thu hút được nhiều sự quan tâm nghiên cứu của các nhà khoa học trên thế giới với tiềm năng ứng dụng rất lớn trong các lĩnh vực như thực phẩm chức năng, thực phẩm bổ dưỡng và dược liệu Cùng với đó số các công trình nghiên cứu về fucoidan đã tăng vọt trong khoảng hơn 20 năm trở lại đây

1.2.2 Thành phần hóa học của fucoidan trong một số loài rong nâu

Hàm lượng của fucoidan phụ thuộc vào loài rong, địa điểm và thời gian thu hoạch rong Năm 1997, Park và cộng sự đã công bố rằng hàm lượng fucoidan từ 1-20% trọng lượng rong khô và phụ thuộc vào loài rong [19]

Năm 1994, Koo đã báo cáo rằng các loài rong L religiosa, U pinnatifida, H fusiforme và S fulvellum có chứa hàm lượng fucoidan tinh khiết lần lượt là

2.7%, 6.7%, 2.5% và 1.6% [20]

Fucoidan là một polysaccharide sulfate dị thể, nên có thành phần hết sức phức tạp Lần đầu tiên thành phần của fucoidan trong dịch chiết nước được xác định là một polysaccharide có chứa L-fucose và D-xylose, trong khi

đó D-galactose và uronic axit được xem như là tạp chất [21]

Tuy nhiên, Percival và Ross đã báo cáo rằng fucoidan trong dịch chiết

nước nóng của các loài rong Fucus vesiculosus, Fucus spiralis and Himanthalia lorea có chứa 38% ester sulfate, 56,7% fucose, 4% galactose,

1.5% xylose, 3% uronic axit và 8% khoáng [22] Các loài rong khác nhau thì

tỉ lệ fucose/galactose cũng khác nhau [23] Dillon và cộng sự đã phân lập

fucoidan từ loài rong A nodosum có tỉ lệ fucose: galactose là 8:1 [24], trong khi fucoidan chiết từ rong Macrocystis pyrifera có tỉ lệ fucose:galactose =

18:1 [22] Ngoài ra, các thành phần đường khác (như xylose) cũng được xác

nhận là thành phần của fucoidan [22] Thành phần của fucoidan từ rong F vesiculosus là 44.1% fucose, 26.3% sulfate, 31.1% tro và một lượng nhỏ

amino-glucose [22,23] Do vậy, thành phần của fucoidan có thể biến đổi theo các loài rong (bảng 1.2) và phương pháp chiết khác nhau [20,21,24]

Bảng 1.2 Thành phần hóa học của một số fucoidan

F vesiculosus Fucose/sulfate (1/1.20)

F evanescens fucose/sulfate/acetate (1/1.23/0.36)

F distichus fucose/sulfate/acetate (1/1.21/0.08)

F serratus L fucose/sulfate/acetate (1/1/0.1)

Lessonia vadosa fucose/sulfate (1/1.12)

Macrocytis pyrifera fucose/galactose (18/1), sulfate

Pelvetia wrightii fucose/galactose (10/1), sulfate

Undariapinnatifida fucose/galactose (1/1.1), sulfate (10.4 %) (Mekabu)

Ascophyllum nodosum

Fucose/xylose/GlcA (4.9/1/1.1), sulfate (12%)

Himanthalia lorea

Fucose/xylose/GlcA (2.2/1.0/2.2), sulfate (13%)

và Bifurcaria bifurcate

Padina pavonia Fucose/xylose/mannose/glucose/galactose

(1.5/1.5/1.2/1.2/1), sulfate (17.6 %)

Laminaria angustata fucose/galactose/sulfate (9/1/9)

Ecklonia kurome Fucose/galactose/mannose/xylose

1.2.3 Cấu trúc hóa học của fucoidan

Việc phân tích cấu trúc của các polysaccharide nói chung và fucoidan nói riêng là một trong những thách thức lớn trong hóa học các chất hữu cơ

có gốc đường Cấu trúc của fucoidan được chiết xuất từ rong biển vô cùng phức tạp và không đồng nhất với những thay đổi trong trật tự liên kết, sự phân nhánh, vị trí nhóm sulfate và các loại đường khác nhau trong polysaccharide, phụ thuộc vào nguồn gốc của chúng [12,25,26,27,28] Chính vì vậy việc phân tích cấu trúc của chúng vẫn còn là vấn đề nan giải, ngay cả khi sử dụng các kỹ thuật quang phổ NMR phân giải cao mới nhất Đã có nhiều công trình nghiên cứu nhằm xác định cấu trúc tinh vi của fucoidan đã được công bố, nhưng mới chỉ có một vài kết quả nghiên cứu phát hiện được tính quy luật trong cấu trúc của fucoidan

rong nâu thường gặp Fucus vesiculosus là một polysaccharide có bộ khung chính là α -L-fucose(12), vị trí nhánh là α -L-fucose(13) và các nhóm sulfate ở vị trí 4 của gốc đường L-fucospynanose Mô hình cấu trúc này của fucoidan đã tồn tại 43 năm [29] Đến năm 1993, cấu trúc fucoidan của rong

F.vesiculosus đã được nghiên cứu lại bởi Patankar và công sự, kết quả cho

thấy có sự khác nhau ở bản chất liên kết glycoside của fucoidan này với

mạch chính là α -L-fucose(13) thay vì α - L-fucose(12), nhóm sulfate được tìm thấy chủ yếu ở vị trí C4, phù hợp với mô hình đã công bố trước Sự khác nhau về cấu trúc fucoidan so với công bố của Percival và Ross được Pantakar giải thích như sau: đầu tiên là kỹ thuật chiết tách khác nhau, fucoidan được Percival và Ross chiết trong dung môi nước nóng, thay vì được chiết trong dung môi axít như Pantakar; thứ hai là sự khác nhau về phương pháp methyl hóa và cuối cùng là sự khác nhau về phương pháp phân tích cấu trúc Percival và Ross phân tích cấu trúc fucoidan dựa trên các tính chất về sắc ký và hóa học của sản phẩm methyl hóa, trong khi đó các sản phẩm methyl hóa được Patankar phân tích bằng phương pháp GC-EI/MS

Cấu trúc fucoidan từ loài rong Ecklonia kurome đã được công bố năm

1991 bởi Nishino và Nagumo Phổ NMR của polysaccharide là quá phức tạp

để cho phép giải thích cấu trúc một cách trực tiếp, có thể do tính dị thể của cấu trúc Cấu trúc của fucoidan này chủ yếu là α -L-fucose(1→3) với các nhóm sulfate ở C-4, không loại trừ sự có mặt của các nhóm sulfate khác hoặc các nhánh ở vị trí 2 [30]

Hình 1.3 Cấu trúc của fucoidan có sunfat ở vị trí 4 và liên kết 3-O-linked từ

loài rong E Kurome được mô tả vào năm 1991 Fucoidan từ Sargassum binderi là →3)fuc(2-OSO3-)(1→3)fuc(1→ [31] Một phân đoạn fucoidan F32 tách từ rong nâu Hizikia fusiforme chứa

thành phần chính fucose, galactose, mannose, xylose và GlcA, sulfate chiếm 21.8%, khối lượng trung bình là 92.7 kDa Cấu trúc của fucoidan phân doạn F32 bao gồm →2)-α-D-Man(1→ và →4)-β-D-GlcA(1→ luân phiên nhau, một lượng ít →4)-β-D-Gal(1→ đã được trộn lẫn Nhóm sulfate ở vị trí C-6

của →2,3)Man(1→, 4 và 6 của →2)Man(1→, 3 của →6)Gal(1→,

C-2, C-3 hoặc C-4 của fucose

Hình 1.4 Cấu trúc fucoidan phân đoạn F32 tách từ rong nâu Hizikia fusiforme

Năm 2001, Chevolt và cộng sự đã phân lập đƣợc fucoidan từ rong nâu

Ascorphylum nodosum [27,32, 33,34], cấu trúc fucoidan oligosaccharide (bậc

polyme hóa từ 8-14) của loài rong này đƣợc cấu thành bởi các liên kết luân phiên α- (13) và α- (14) Cấu trúc fucoidan từ A.nodosum cũng đã đƣợc

Daniel và cộng sự nghiên cứu khi sử dụng các enzym đặc hiệu làm xúc tác sinh học để thủy phân tạo fucoidan oligosaccharide, kết quả cho thấy sự có mặt của lƣợng lớn các liên kết glycoside của gốc α -L-fucose(13) và α -L-fucose(14) [34]

[3)-α-L-Fucp (2SO3

)-(14)-α-L-Fucp (2,3SO3

)-

-1]nHình 1.5 Cấu trúc của một phân đoạn fucoidan tách và phân lập từ rong nâu

A.nodusum Năm 1999, cấu trúc fucoidan của 3 loài rong Cladosiphon Okamuranus (Chordariales) [35], Chorda filum (Laminariales) và Ascophyllum nodosum

(Fucales) [32,36] đã đƣợc công bố Cấu trúc fucoidan của rong

Cladosiphonokamuranus và Chorda filum đƣợc tạo thành bởi các gốc

α-L-fucose(13) lặp lại đều đặn, với một số nhóm sulfate ở vị trí C-2 sulfateation) hoặc vị trí C-4 (4- O-sulfateation) Sự xuất hiện của các nhóm O-acetyl và các mạch nhánh trong phân tử fucoidan càng làm tăng thêm tính

(2-O-dị thể về cấu trúc của chúng

R R Hình 1.6 Cấu trúc của một phân đoạn fucoidan tách và phân lập từ rong nâu

Cladosiphon okamuranus

R1 : SO3-, H hoặc COCH3 R2 : SO3- hoặc H

Hình 1.7 Cấu trúc của một phân đoạn fucoidan tách và phân lập từ rong nâu

Chorda filum

Năm 2002, cấu trúc fucoidan trọng lượng phân tử cao được phân lập từ

rong Fucus evanescens đã được nghiên cứu bởi Bilan và cộng sự, kết quả họ

đã phát hiện thấy có sự tương đồng giữa cấu trúc fucoidan này với cấu trúc

fucoidan của rong A.nodosum [37] Sau đó vào các năm 2004 và 2006, nhóm tác giả này tiếp tục công bố thêm hai cấu trúc fucoidan từ rong Fucus distichus L và Fucus serratus được tạo thành bởi các gốc 1→3)α-L-Fucp và 1→4)α-L-Fucp liên kết lặp lại một cách tuần tự, nhóm sulfate chủ yếu ở vị trí

C-2 và C-2,4 [28,38]

[→3)- α -L-Fucp-(2,4 SO3-)-(1→4)- α -L-Fucp-(2SO3-)-(1→]n

→3)- α -L-Fucp(2R1,4R2)-(1→4)- α -L-Fucp(2SO3

)-(1→

-Trong đó:

R1 = SO3-, R2 = H chiếm 50%

R1 = H, R2 = α -L-fucp-(1→4)- α -L-fucp(2SO3

)-(1→3) α -L-fucp(2SO3

)-(1→ chiếm 50%

-Hình 1.8 Cấu trúc fucoidan từ Fucus serratus

Như vậy, mặc dù có mối liên hệ rõ ràng giữa các loài rong và cấu trúc fucoidan, nhưng chưa đủ bằng chứng để thiết lập bất cứ mối tương quan hệ thống nhất giữa cấu trúc fucoidan với các Bộ rong (algal order) Hầu hết các công bố về cấu trúc của fucoidan được phân lập từ các loài rong ở vùng ôn đới, thành phần hóa học của các loại fucoidan này nhìn chung tương đối đơn giản với chỉ một gốc đường fucose và sulfate Tuy nhiên, fucoidan của các loài rong ở vùng nhiệt đới thì thành phần hóa học của chúng phức tạp hơn nhiều vì trong phân tử của chúng thường tồn tại đồng thời nhiều gốc đường khác nhau, điều đó gây ra rất nhiều khó khăn cho việc phân tích cấu trúc của những loại fucoidan này Đó cũng là lý do tại sao không có nhiều công bố về cấu trúc của fucoidan rong biển ở vùng nhiệt đới, cho dù hoạt tính sinh học của chúng vô cùng thú vị

1.2.4 Tính chất hóa lý của fucoidan

Fucoidan là một anion polysaccharide sulfate, có độ nhớt thấp và tính hút ẩm cao [22,23], fucoidan tan tốt trong nước và trong dung môi axít Nhìn chung, fucoidan có trọng lượng phân tử không cao Trọng lượng phân tử của

fucoidan chiết từ loài rong A.nodosum là từ 417-1.323 kDa, trong khi đó với loài rong F vesiculosus là 529-887 kDa, nhưng Patankar và cộng sự (1993)

lại cho rằng trọng lượng phân tử của fucoidan từ loài rong này là 100 kDa Rupérez và cộng sự (2002) đã chiết hai phân đoạn fucoidan với trọng lượng phân tử khác nhau là 1.600 kDa và 43 kDa Thêm vào đó, galactofucoidan

một loại fucoidan được phân lập từ loài rong Saccharina longicruris có trọng

lượng phân tử là 765 kDa và 1.529 kDa biến đổi tùy thuộc vào thời điểm thu hoạch rong Nhìn chung trọng lượng phân tử của fucoidan thay đổi tùy thuộc vào loài rong (bảng 1.3), phương pháp chiết và điều kiện môi trường

Bảng 1.3 Sự phân bố trọng lượng phân tử của fucoidan

1.2.5 Hoạt tính sinh học và ứng dụng của fucoidan

1.2.5.1 oạt t nh chống ng t máu và chống hu ết khối

Fucoidan có phổ hoạt tính sinh học rộng và đa dạng, nhưng hoạt tính chống đông tụ máu của chúng được nghiên cứu sớm nhất Nishino và cộng

sự, đã thử nghiệm hoạt tính chống đông máu của fucoidan được phân lập từ

chín loài rong nâu Trong số các fucoidan thử nghiệm, fucoidan từ E kurome

thể hiện hoạt tính cao nhất đối với APTT (38 đơn vị/mg) và TT (35 đơn

vị/mg), với fucoidan từ H.fusiforme hoạt tính APTT (activated partial thromboplastin time) và TT (thromboplastin time) tương ứng là 25 đơn vị/mg

và 22 đơn vị/mg Hoạt tính chống huyết khối của phân đoạn F4 của fucoidan

từ L.angustata var longissima là 200 đơn vị/mg, so với heparin (140 đơn

vị/mg) [1,15]

Các nghiên cứu về hoạt tính chống đông tụ máu của fucoidan từ một số

loài rong (E.kurome, H.fusiforme, vv…) đã chỉ ra rằng hàm lượng sulfate có

ảnh hưởng lớn đến hoạt tính chống đông tụ máu, hàm lượng sulfate càng cao thì hoạt tính chống đông tụ càng lớn Fucoidan sulfate hóa toàn phần bằng biến đổi hóa học fucoidan tự nhiên cũng làm tăng hoạt tính này Nishino và cộng sự, đã điều chế ba loại fucan sulfate hóa toàn phần (fucans oversulfated)

có hàm lượng sulfate khác nhau (tỷ lệ sulfate/đường: 1,38-1,98) bằng sulfate hóa hóa học của một sulfate fucan (tỷ lệ sulfate/ đường 1,28 ) phân lập từ

rong E kurome Các kết quả cho thấy fucan sulfate hóa toàn phần thể hiện

hoạt tính chống đông tụ máu tăng đáng kể so với fucoidan tự nhiên Qiu và cộng sự công bố rằng fucoidan sulfate hóa toàn phần cho thấy hoạt tính chống đông tụ máu cao gấp bốn lần so với fucoidan tự nhiên [39] Vị trí của các nhóm sulfate trên các gốc đường cũng rất quan trọng với hoạt tính chống đông tụ của fucoidan Các nghiên cứu đã cho thấy rằng fucoidan sulfate hóa nếu ở vị trí C-2 hoặc C-3 thể hiện hoạt tính chống đông tụ, trong khi đó nhóm sulfate ở vị trí C-4 không thể hiện hoạt tính này [39,40,41]

Duarte cùng với các cộng sự của ông đã công bố rằng các đặc tính chống đông tụ máu của fucoidan chủ yếu được xác định dựa trên các chuỗi sulfate fucose, đặc biệt các đơn vị fucosyl disulfated Silva và cộng sự đã

công bố rằng hoạt tính chống đông tụ máu của fucoidan từ Padina gymnospora được quyết định bởi 3-O-sulfat tại C-3 của đơn vị đường 4-α-L-

fucose-1→ [42] Để có được hoạt tính chống đông tụ máu fucoidan cần một mạch đường đủ dài và một dạng cấu trúc linh động để liên kết với thrombin

Fucoidan tự nhiên từ Lessonia vadosa (Phaeophyta) có khối lượng phân tử

(320.000 Da MW) cho thấy hoạt tính chống đông tụ máu tốt hơn các fucoidan đề polymer hóa có khối lượng phân tử (32.000 MW) [43] Các thử

nghiệm với fucoidan trọng lượng phân tử thấp (LMWF) thu được từ A nodosum bằng thủy phân xít, có cấu trúc lặp lại chủ yếu là [→3)-α-L-

Fuc(2SO3-)-(1→4)-α-L-Fuc(2,3diSO3-)-(1]n và có trọng lượng phân tử (Mw)

là 3.090 Da, chỉ ra rằng cấu trúc phân nhánh không thực sự ảnh hưởng đến hoạt tính chống đông tụ máu [15,39]

Một số nghiên cứu khác cho thấy thành phần đường (fucose, galactose, v.v) của fucoidan có ảnh hưởng đến hoạt tính chống đông tụ máu [44,45] Các kết quả của Pereira và cộng sự chỉ ra rằng nhóm 2-sulfate của α-L-galactan liên kết 3, là tác nhân ức chế thrombin mạnh qua trung gian antithrombin hoặc heparin cofactor II chứ không phải là gốc α-L-fucan Axit uronic không có ảnh hưởng trực tiếp lên hoạt tính chống đông tụ máu, nhưng

nó gián tiếp làm tăng hoạt tính chống đông tụ máu thông qua việc làm cho chuỗi đường trở nên linh động hơn [46,12]

Mourao đã tổng kết các hoạt tính chống đông tụ máu và chống huyết khối của fucan sulfate Các fucan sulfate của rong biển và động vật không xương sống biển có hoạt tính chống đông tụ máu mạnh gián tiếp bởi antithrombin và heparin cofactor II Những nghiên cứu này khẳng định rõ ràng rằng hoạt tính chống đông tụ máu của α-L-fucans sulfate và α-L-galactans sulfate mạch thẳng không chỉ phụ thuộc vào mật độ và mô hình sulfate hóa mà còn bị ảnh hưởng bởi thành phần các monosaccharide [47]

Hoạt tính chống huyết khối của fucoidan cũng đã được thử nghiệm in vivo theo mô hình nghẽn tĩnh mạch và động mạch ở động vật thực nghiệm Galactofucan sulfate được phân lập từ rong nâu Spatoglossum schroederi cho thấy không có hoạt tính chống đông tụ máu trên một số thử nghiệm in vitro

Tuy nhiên, nó lại thể hiện hoạt tính chống huyết khối mạnh khi thực hiện thí nghiệm về sự nghẽn tĩnh mạch trên mô hình động vật, điều này có thể được giải thích do ảnh hưởng của yếu tố thời gian đến hoạt tính chống huyết khối của fucoidan Tác dụng này đạt tối đa 8 giờ sau khi theo dõi thí nghiệm và nhanh hơn so với heparin Hoạt tính này không được phát hiện với các phân

tử fucoidan khử sulfate Hơn nữa, galactofucan sulfate còn có tác dụng kích thích sự tổng hợp heparan sulfate, một tác nhân chống huyết khối bằng các tế bào nội mô mạnh hơn heparin 2 lần Tác dụng này cũng không xảy ra với các polysaccharide bị khử nhóm sulfate [47]

Như vậy có thể thấy rằng fucoidan có tiềm năng rất lớn để sử dụng làm thuốc chống đông tụ máu, thuốc chống huyết khối hoặc thực phẩm chức năng

và dược liệu mà hầu như không có tác dụng phụ

1.2.5.2 oạt t nh chống virus

Trong những năm gần đây, người ta đã chứng minh rằng polysaccharide sulfate trong đó bao gồm fucoidan thể hiện các hoạt tính kháng virus được thử nghiệm cả trên động vật thực nghiệm (in vivo) và trong ống nghiệm (in vitro), yếu tố gây độc tế bào thấp của chúng so với các thuốc kháng virus khác đang được quan tâm xem xét sử dụng trong y học lâm sàng

Fucoidan từ Laminaria japonica có chức năng kháng RNA và DNA của virus

Hiệu quả chống virus của fucoidan trên bệnh nhiễm trùng do poliovirus III, adenovirus III, ECHO6 virus, virus coxsackie B3 virus và virus coxsackie A16 rất đáng kể Fucoidan có thể ức chế sự phát triển của hiệu ứng bệnh lý tế bào (CPE) và bảo vệ các tế bào được cấy ghép khỏi sự nhiễm trùng gây ra bởi các virus ở trên Herpes là một bệnh nhiễm trùng gây ra bởi virus herpes

simplex (HSV) Fucoidan được tách chiết từ các loài rong Adenocytis utriculari, Undaria pinnatifida(Mekabu), Stoechospermum marginatum, Undaria pinnatifida, Cystoseira indica và Undaria pinnatifida cho thấy hoạt

tính kháng virus HSV-1 và HSV-2 mà không gây độc cho tế bào Vero Hơn nữa, các fucoidan còn cho thấy hoạt tính ức chế chống lại sự tái tạo nhiều loại virus màng bao gây ra hội chứng suy giảm miễn dịch của người và cytomegalovirus [48,49,50,51]

Dohura và cộng sự, công bố rằng sử dụng fucoidan từ rong nâu có hoạt tính antiprion và kìm hãm sự khởi phát bệnh khi bị nhiễm trùng prion đường ruột Fucoidan của rong biển có tác dụng làm giảm những cơn đau của những con chuột bị nhiễm trùng đường ruột (scrapie) khi cho uống trong 6 ngày sau khi nhiễm bệnh Ăn chế độ ăn hàng ngày được bổ sung fucoidan có thể phòng ngừa chống lại các bệnh prion do ăn phải thức ăn nhiễm prion, mặc dù sự đánh giá sâu hơn về dược lý của nó vẫn còn tiếp tục được thực hiện [48,52]

1.2.5.3 oạt t nh kháng u và iều hòa miễn dịch

Hoạt tính kháng u của nhiều polysaccharide đã được công bố trong

những năm gần đây Fucoidan từ Eisenia bicyclics và L japonica có tác dụng chống u báng 180 Fucoidan của L japonica có thể ức chế tế bào gan

QGY7703 đến phase Log, theo đó kiềm chế sự tăng trưởng của khối u [53] Fucoidan đã được phát hiện ức chế sự tăng sinh và gây chết tế bào trong dòng

tế bào u lympho HS-Sultan của người [54] Fucoidan từ L saccharina, L digitata, F serratus, F distichus và F vesiculosus có tác dụng khóa chặt tế bào ung thư vú MDA-MB-231 ngăn kết dính với các tiểu cầu, một hiệu ứng

mà có thể có ý nghĩa quan trọng trong quá trình di căn khối u [47,55]

Dựa trên nghiên cứu fucoidan liên kết với fibronectin, Liu và cộng sự đưa ra giả thuyết rằng fucoidan ức chế sự bám dính của tế bào MDA-MB-231 với fibronectin theo các cách sau:

- Bằng cách ngăn chặn heparin của protein và vùng liên kết tế bào

- Bằng cách điều chỉnh việc tổ chức lại cấu trúc dưới phân tử intergrin alpha5

Điều chỉnh giảm sự biểu hiện của vinculin [56] Bệnh bạch cầu T-cell khi trưởng thành (ATL) bị gây ra bởi vi rút gây bệnh bạch cầu tế bào T typ 1 (HTLV-1) và đến nay căn bệnh này vẫn chưa có thuốc chữa Fucoidan ức chế đáng kể sự tăng trưởng của tế bào máu đơn nhân ngoại biên của bệnh nhân mắc bệnh bạch cầu (ATL) và các dòng tế bào T bị nhiễm HTLV-1 nhưng không phải là của các tế bào máu đơn nhân ngoại biên bình thường Fucoidan

từ Mekabu có khả năng ức chế khối u tới 65,4 % [47,56,57]

Fucoidan của L japonica có thể phục hồi các chức năng miễn dịch của

chuột bị ức chế miễn dịch, và đó là một miễn dịch tác động trực tiếp trên đại thực bào và tế bào lympho T [58] Ngoài ra, nó cũng có thể thúc đẩy sự phục hồi chức năng miễn dịch trên các con chuột bị chiếu xạ Cơ chế này liên quan đến sự kìm hãm quá trình giáng hóa tế bào lympho bởi fucoidan [47,59] Fucoidan có thể làm tăng khả năng sản xuất interleukin-1 (IL-1) và interferon-

γ (IFN-γ) trong thử nghiệm in vitro, tăng cường các chức năng của tế bào