luận văn thạc sĩ nghiên cứu đánh giá và xây dựng quy trình nhân giống cho loài sâm núi dành (callerya speciosa (champ ex benth) schot) phân bố trên địa bàn tỉnh bắc giang

BỘ GIÁO DỤC VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ ĐÀO TẠO VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ --- Nguyễn Thanh Loan ĐỀ TÀI: “ NGHIÊN CỨU ĐÁNH GIÁ VÀ XÂY DỰNG QUY TRÌNH NHÂN GIỐ

BỘ GIÁO DỤC VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC

VÀ ĐÀO TẠO VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

-

Nguyễn Thanh Loan

ĐỀ TÀI: “ NGHIÊN CỨU ĐÁNH GIÁ VÀ XÂY DỰNG QUY TRÌNH

NHÂN GIỐNG CHO LOÀI SÂM NÚI DÀNH (CALLERYA

SPECIOSA (CHAMP.EX BENTH) SCHOT) PHÂN BỐ TRÊN ĐỊA

BÀN TỈNH BẮC GIANG”

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội - 2019

BỘ GIÁO DỤC VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC

VÀ ĐÀO TẠO VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

-

Nguyễn Thanh Loan

ĐỀ TÀI: “ NGHIÊN CỨU ĐÁNH GIÁ VÀ XÂY DỰNG QUY TRÌNH

NHÂN GIỐNG CHO LOÀI SÂM NÚI DÀNH (CALLERYA SPECIOSA

(CHAMP.EX BENTH) SCHOT) PHÂN BỐ TRÊN ĐỊA BÀN

TỈNH BẮC GIANG”

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

Mã số: 8420114

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC :

Hướng dẫn 1: TS Đồng Thị Kim Cúc Hướng dẫn 2: TS Nguyễn Thị Thanh Hương

Lời cam đoan

Tôi xin cam đoan đã trực tiếp thực hiện các nghiên cứu trong luận văn này Mọi kết quả thu được nguyên bản, không chỉnh sửa hoặc sao chép từ các nghiên cứu khác Các số liệu chưa từng được công bố trong luận án, luận văn nào trước đây

Mọi dữ liệu trích dẫn tham khảo trong luận văn đều được thu thập và sử dụng từ nguồn dữ liệu mở hoặc với sự đồng ý của tác giả

Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm với những lời cam đoan trên!

Tác giả

Nguyễn Thanh Loan

Lời cảm ơn

Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể các thầy cô và các cán bộ công tác tại Học viện Khoa học và Công nghệ đã giảng dạy và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập tại Học viện

Đặc biệt, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc tới TS Đồng Thị Kim Cúc và TS Nguyễn Thị Thanh Hương đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ cho tôi trong quá trình công tác cũng như trong thời gian học tập, nghiên cứu và thực hiện luận văn này

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành tới tập thể các cán bộ, anh chị

em, bạn bè, đồng nghiệp trong Trung Tâm thực nghiệm Sinh học Nông nghiệp Công nghệ cao thuộc Viện Di truyền Nông nghiệp đã giúp đỡ và đóng góp những ý kiến quý báu để tôi hoàn thành luận văn này

Luận văn này được thực hiện bởi sự cho phép của Viện Di truyền Nông nghiệp, Trung tâm Thực nghiệm sinh học Nông nghiệp Công nghệ cao và được thực hiện từ nguồn kinh phí đề tài “Nghiên cứu đánh giá, bảo tồn nguồn gen cây Sâm Núi Dành phân bố trên địa bàn Tỉnh Bắc Giang”

Luận văn có sự động viên và giúp đỡ của gia đình tôi

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 9 tháng 10 năm 2019 Tác giả

Nguyễn Thanh Loan

Danh mục các ký hiệu và chữ viết tắt

DNA Deoxyribonucleic acid

PCR Polymerase Chain Reaction (phản ứng chuỗi

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

1.TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI 1

2 MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI 2

3 Ý NGHĨA CỦA ĐỀ TÀI 2

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1.NGUỒN GỐC VÀ ĐẶC ĐIỂM CỦA SÂM NÚI DÀNH 3

1.2 THÀNH PHẦN HÓA HỌC MỘT SỐ LOÀI THUỘC CHI CALLERYA 5

1.3.TỔNG QUAN PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU PHÂN LOẠI THỰC VẬT DỰA TRÊN CHỈ THỊ PHÂN TỬ 6

1.3.1 Tổng quan về trình tự bảo tồn trong các bộ gene thực vật 6

1.3.2 Bộ gene lục lạp 7

1.3.3 Các trình tự bảo tồn ở bộ gene trong nhân 7

1.3.4 Kết quả nghiên cứu ADN mã vạch trong kiểm định giống nhân sâm 9

1.4 CÁC NGHIÊN CỨU VỀ NHÂN GIỐNG VÔ TÍNH TRÊN CÂY SÂM NGỌC LINH 10

1.5 TÌNH HÌNH NHÂN GIỐNG LOÀI CELLERYA SPECIOSA CHAMP 11

1.5.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới 11

1.5.2 Tình hình nghiên cứu trong nước 12

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14 2.1.ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU, ĐỊA ĐIỂM VÀ THƠI GIAN NGHIÊN CỨU 14 2.1.1.Đối tượng 14

2.1.2.Vật liệu nghiên cứu 14

2.1.3 Địa điểm và thời gian nghiên cứu 14

2.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 14

2.2.1 Nội dung 1: Thu thập, lấy mẫu và phân loại chính xác loài Sâm Núi Dành bằng marker phân tử trong số các mẫu Sâm thu thập được trên địa bàn tỉnh Bắc Giang 14

2.2.2 Nội dung 2: Phân tích định tính một số nhóm chất trong củ Sâm Núi Dành 15 2.2.3 Nội dung 3: Nghiên cứu xây dựng quy trình nhân giống vô tính cho loài Sâm Núi Dành bằng phương pháp giâm hom và phương pháp nuôi cấy in-vitro 15 2.3.PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15

2.3.1.Phương pháp thu mẫu và lấy mẫu ngoài thực địa 15

2.3.2 Phương pháp đánh giá đa dạng di truyền của các giống/loài bằng các marker đặc trưng-Barcode 16

2.3.3 Phương pháp phân tích định tính một số nhóm hoạt chất có dược tính

trong loài Sâm Núi Dành 19

2.3.4 Phương pháp nhân giống vô tính cho loài Sâm Núi Dành 20

2.3.5 Phương pháp bố trí thí nghiệm 25

2.3.6.Phương pháp xử lý số liệu 25

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 26

3.1 THU THẬP, LẤY MẪU VÀ PHÂN LOẠI CHÍNH XÁC LOÀI SÂM NÚI DÀNH BẰNG MARKER PHÂN TỬ TRONG SỐ CÁC MẪU SÂM THU THẬP ĐƯỢC TRÊN ĐỊA BÀN TỈNH BẮC GIANG 26

3.1.1 Thu thập, lấy mẫu một số loài Sâm trên địa bàn tỉnh Bắc Giang 26

3.1.2 Nghiên cứu xác định các marker đặc trưng-Barcode (trình tự ITS của gen ribosom nhân) để nhận dạng chính xác loài Sâm Núi Dành 28

3.2 PHÂN TÍCH ĐỊNH TÍNH MỘT SỐ NHÓM CHẤT TRONG CỦ SÂM NÚI DÀNH 32

3.3 NHÂN GIỐNG VÔ TÍNH CHO LOÀI SÂM NÚI DÀNH BẰNG PHƯƠNG PHÁP GIÂM HOM VÀ PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY IN-VITRO 36

3.3.1 Phương pháp nhân giống loài Sâm Núi Dành tại vùng bản địa bằng các phương pháp giâm hom 36

3.3.2 Xây dựng quy trình nhân giống vô tính cho loài Sâm Núi Dành bằng phương pháp nuôi cấy in-vitro 40

3.3.2.5 Nghiên cứu ảnh hưởng của các loại giá thể đến tỷ lệ sống của cây Sâm Núi Dành in-vitro ngoài vườn ươm 51

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 54

4.1 KẾT LUẬN 54

4.2 KIẾN NGHỊ 55

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2 1 Danh sách các mồi ITS 14

Bảng 3.1 Danh sách kí hiệu 4 mẫu Sâm 28

Bảng 3.2 Thành phần bốn loại nucleotide của các mẫu Sâm nghiên cứu 30

Bảng 3 3 Hệ số tương đồng giữa các mẫu Sâm nghiên cứu 31

Bảng 3.4 Kết quả phân tích định tính mẫu Sâm Núi Dành dưới 3 năm tuổi 32

Bảng 3.5 Kết quả phân tích định tính mẫu Sâm Núi Dành từ 3-5 năm tuổi 33

Bảng 3.6 Kết quả phân tích định tính mẫu Sâm Núi Dành trên 5 năm tuổi 33

Bảng 3.7 Một số hình ảnh của phản ứng định tính một số nhóm chất 34

Bảng 3 8 Ảnh hưởng của IBA tới khả năng hình thành rễ hom giâm 36

Bảng 3.9 Ảnh hưởng của giá thể tới phát triển cây hom Sâm Núi Dành 37

Bảng 3.10 Ảnh hưởng của chất khử trùng và thời gian khử trùng đến khả năng tạo mẫu sạch bệnh 40

Bảng 3 11 Ảnh hưởng của Ki đến khả năng tái sinh chồi 42

Bảng 3 12 Ảnh hưởng của BA và IBA đến khả năng nhân nhanh chồi Sâm Núi Dành 45

Bảng 3 13 Ảnh hưởng của MS và nồng độ NAA đến sự hình thành rễ 46

Bảng 3 14 Ảnh hưởng của ½MS và nồng độ NAA đến sự hình thành rễ 46

Bảng 3 15 Ảnh hưởng của môi trường MS và IBA đến sự hình thành rễ 47

Bảng 3 16 Ảnh hưởng của môi trường ½MS và IBA đến sự hình thành rễ 48

Bảng 3 17 Ảnh hưởng của than hoạt tính tới chất lượng bộ rễ 50

Bảng 3 18 Ảnh hưởng của giá thể tới phát triển cây Sâm Núi Dành in-vitro 51

Bảng 3.19 Kết quả Blast trình tự các nucleotid vùng gen ITS của mẫu S1 trong NCBI 64

Bảng 3.20 Kết quả Blast trình tự các nucleotid vùng gen ITS của mẫu S2 trong NCBI 65

Bảng 3.21 Kết quả Blast trình tự các nucleotid vùng gen ITS của mẫu S3 trong NCBI 66

Bảng 3.22 Kết quả Blast trình tự các nucleotid vùng gen ITS của mẫu S4 trong NCBI 67

DANH MỤC HÌNH

Hình 3.1 a) Cây Sâm Núi Dành , b) Cây Sâm Đắng 26

Hình 3.2 Củ Sâm Núi Dành và củ Sâm Ngọt (Sâm Nam) 27

Hình 3.3 Các dạng lá Sâm thu tại tỉnh Bắc Giang 27

Hình 3.4 a) Quả Sâm Núi Dành b) Quả Sâm Đắng 27

Hình 3 5 Hom Sâm Núi Dành được xử lý qua các công thức thí nghiệm 37

Hình 3.6 Động thái tăng trưởng số chồi/hom 38

Hình 3.7 Động thái tăng trưởng chiều dài của chồi hom giâm 39

Hình 3.8 Động thái tăng trưởng số lá/chồi 39

Hình 3 9 Mẫu Sâm Núi Dành sau 2 tuần trên môi trường tái sinh 42

Hình 3 10 Chồi Sâm Núi Dành trên các CT môi trường nhân nhanh 44

Hình 3 11 Ảnh hưởng của môi trường và nồng độ các hoocmon tăng trưởng đến khả năng hình thành rễ 49

Hình 3 12 Chồi Sâm ra rễ trên môi trường có bổ sung 1 mg/l IBA + 0,4 mg/l THT 50

Hình 3 13 Cây Sâm Núi Dành in-vitro hoàn chỉnh 51

Hình 3.14 Cây Sâm Núi Dành in-vitro ra cây trên các công thức giá thể 52

MỞ ĐẦU

1.TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI

Ở Việt Nam, trong tổng số 3.948 loài cây thuốc có khoảng 87,1% là các loài mọc tự nhiên, tập trung chủ yếu ở các quần xã rừng, số còn lại là cây trồng Mỗi năm ngành Y dược tiêu thụ 30-50 tấn dược liệu các loại phục vụ chữa bệnh hoặc làm nguyên liệu cho công nghiệp dược và xuất khẩu Trong

số đó, trên 2/3 lượng dược liệu được khai thác từ nguồn cây thuốc mọc tự nhiên hoặc trồng trong nước, vì thế nhu cầu cây thuốc trong nước là rất lớn Năm 2016, Viện Dược liệu đã công bố tổng số 5117 loài cây thuốc đã được phát hiện [1]

Sâm Núi Dành là một loài cây thuốc phân bố ở chân Núi dành thuộc huyện Tân Yên, tỉnh Bắc Giang Hiện nay cho thấy do nhu cầu sử dụng dược liệu tăng mạnh trong thời gian gần đây nên Sâm Núi Dành bị khai thác ồ ạt, dẫn đến nguồn nguyên liệu đang trở nên cạn kiệt Theo Sách đỏ Việt Nam (2007), loài này được xếp ở mức độ sẽ bị nguy cấp bởi nơi cư trú của chúng

bị thu hẹp do rừng thường xuyên bị chặt phá; loài bị khai thác nhiều để làm thuốc có thể dẫn đến cạn kiệt [2] Một nguyên nhân khác dẫn đến sự cạn kiệt nguồn gen quý này là do cây Sâm Núi Dành rất khó nhân giống Hạt nảy mầm rất khó nảy mầm trong điều kiện tự nhiên, vùng phân bố của Sâm không

đa dạng Việc bảo tồn loài sâm quý này đang ở mức báo động, cần sự chung tay góp sức của các cấp, ngành và người dân địa phương

Một trong những mục tiêu quan trọng của đề tài là nhân giống vô tính được loài Sâm Núi Dành nhằm lưu giữ, bảo tồn nguồn gen quý của loài Sâm này do nguy cơ bị tuyệt chủng do khai thác ồ ạt Việc đáp ứng nhanh và bền vững nguồn giống Sâm Núi Dành có chất lượng tốt đang là yêu cầu cấp bách Nguồn cung cấp cây giống hiện nay chủ yếu bằng phương pháp nhân giống truyền thống: giâm cành, gieo hạt nhưng hệ số nhân giống đạt rất thấp, hạt gần như không nảy mầm ngoài tự nhiên Để cải thiện hệ số nhân giống cây Sâm này, chúng tôi đã nghiên cứu xây dựng quy trình nhân giống cho loài Sâm Núi Dành Nghiên cứu này được thực hiện nhằm thiết lập quy trình nhân giống vô tính loài Sâm Núi Dành có nguồn gốc từ tỉnh Bắc Giang Nuôi cấy

mô tế bào thực vật là một trong những công cụ hữu hiệu cho việc nhân giống

và bảo tồn này Nó cho phép trong thời gian ngắn nhất, nhân nhanh với quy

mô lớn và cây có độ đồng đều cao, sạch bệnh và giữ được đặc tính di truyền của bố mẹ

Xuất phát từ thực tiễn đó chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên

cứu, đánh giá và xây dựng quy trình nhân giống cho loài Sâm Núi Dành (Callerya speciosa (Champ ex Benth) Schot) phân bố trên địa bàn tỉnh Bắc Giang”

2 MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI

- Nghiên cứu, điều tra, thu thập các mẫu Sâm trên địa bàn tỉnh Bắc Giang Xác định chính xác tên loài Sâm Núi Dành bằng phương pháp sinh học phân tử và xác định thành phần một số hoạt chất trong củ Sâm Núi Dành

ở các độ tuổi khác nhau

- Xây dựng được quy trình nhân giống cho loài Sâm Núi Dành bằng

phương pháp giâm hom và công nghệ in-vitro

3 Ý NGHĨA CỦA ĐỀ TÀI

- Đề tài cung cấp các dẫn liệu khoa học bước đầu về nghiên cứu xây dựng quy trình nhân giống vô tính cho loài Sâm Núi Dành

- Các kết quả nghiên cứu của đề tài cũng là tài liệu tham khảo trong việc nghiên cứu, giảng dạy có giá trị cho lĩnh vực công nghệ sinh học và nhân

giống cây trồng bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1.NGUỒN GỐC VÀ ĐẶC ĐIỂM CỦA SÂM NÚI DÀNH

Sâm Núi Dành là một đối tượng chưa được nghiên cứu nhiều ở Việt Nam và trên thế giới Vì vậy, việc tiếp cận các kết quả nghiên cứu còn hạn chế, việc định hướng các tài liệu tham khảo trong và ngoài nước cũng khó khăn

Sâm Núi dành được biết đến qua một số bài báo của tác giả Trần Đình Dũng, Trung tâm Khoa học Công nghệ và Môi trường huyện Tân Yên, tỉnh Bắc Giang Theo bài viết của tác giả, trong sách “Đại Nam nhất thống chí”,

có ghi: “Tên nỏ sản xuất tại Yên Thế Sâm Nam sẵn ở đỉnh núi Chung Sơn

Cỏ thi cũng có ở Chung Sơn” Núi Chung Sơn được nhắc tới đó là Núi Dành, nay phần lớn thuộc xã Liên Chung và phần còn lại thuộc địa phận xã Việt Lập, huyện Tân Yên Những câu chuyện quanh loài Sâm quý này được người dân sinh sống dưới chân Núi dành kể lại Theo ông Nguyễn Văn Được, 72 tuổi ở thôn Hậu, nhà ngay dưới chân Núi dành cho biết: “Núi dành xưa kia toàn cây de với giàng giàng, mỗi lần Lý trưởng kiếm được củ sâm thì mừng lắm, hiện ở góc vườn nhà tôi còn một khóm sâm, mỗi năm nó chỉ ra một đốt

từ đó mọc rễ và ra củ nên củ không lớn, tôi cũng đã từng nhân thử giống Sâm Núi dành nhưng không thành công, và cũng đã nhiều lần thử du nhập những giống sâm khác về trồng nhưng không sống được có lẽ do thời tiết và thổ nhưỡng không hợp” Ông Nguyên Khắc Lư, 62 tuổi, ở thôn Hậu, xã Liên Chung tâm sự, gần hai chục năm trước ông nhận đất trồng rừng ở chân Núi dành Trong một lần cuốc đất thấy bật lên những củ nhỏ, mùi thơm, nếm thử thấy ngọt mát, vốn gia đình có nghề làm thuốc Đông y nên ông Lư biết mình gặp may khi tìm thấy gốc Sâm Núi dành và ông giữ gìn từ đó cho tới bây giờ Theo ông Lư, loại sâm này phải trên 10 năm tuổi dùng mới hữu dụng Những căn bệnh thông thường như ho cảm sốt, đau đầu, nhất là đối với trẻ nhỏ dùng chút ít là khỏi [3]

Bằng phương pháp mô tả đặc điểm hình thái, các tác giả Đồng Thị Kim Cúc và cộng sự, đã xác định được Sâm Núi Dành thuộc họ đậu (Fabaceae), chi Callerya có tên khoa học Callerya speciosa (Champ.) Schot., [4]

Đặc điểm nông sinh học:

Thân: Sâm Núi Dành thuộc dạng cây dây leo hoặc trườn, thường dài 4

-5 m hoặc hơn, cành non có lông màu bạc;

Rễ củ nạc, có lớp vỏ bên ngoài hơi cứng, bên trong lõi màu vàng nhạt, mùi thơm dịu và vị ngọt mát

Lá kép lông chim lẻ, trục chính của lá dài 6-15 cm, mang 3-7 lá chét; lá chét hình bầu dục dài hay trái xoan, cỡ 3-8 x 1-3 cm, 2 mặt có lông tơ màu trắng, gân bên có 5-6, mặt trên xanh thẫm, mặt dưới lá xanh nhạt

Hoa: Cụm hoa chùm, mọc ở đầu cành hay nách lá, dài đến 30 cm, cuống hoa và đài đều có lông nhung trắng Hoa to, mọc đơn độc trên đốt trục cụm hoa, dài 2,5-3 cm Đài hình chuông, 5 mảnh dính với nhau, cỡ 9 x 12

cm, mặt ngoài có lông, mép có 4 răng; tràng 5 cánh không đều nhau, tiền khai hoa cờ: cánh cờ (ở trên) lớn nhất, có màu sắc đẹp hơn và ở ngoài cùng, 2 cánh bên nhỏ hơn, trong cùng là 2 cánh thìa dính lại với nhau ở đáy tạo thành cấu trúc tương tự như cái thuyền con mang kèm nhị và nhụy

Cánh hoa màu trắng ngà, cánh cờ không có lông, 2 bên gốc có cục chai Nhị 10, 9 chiếc dính lại với nhau ở phần chỉ nhị thành 1 bó bao quanh nhụy, 1 chiếc rời Bầu nhụy lớn, 1 ô, mang 2 dãy noãn, khi phát triển được sẽ tạo ra quả Bầu hình thuôn, dài bằng nhị

Quả đậu, dẹp, cỡ 9-18 x 1,2-1,6 x 0,7-0,8 cm, có lông nâu phủ dầy Hạt 2-3, hình trứng, cỡ 1 cm

Củ sâm có lớp vỏ bên ngoài hơi cứng, bên trong lõi màu vàng nhạt, mùi thơm dịu và có vị hơi ngọt

Sinh học, sinh thái: Mùa ra hoa tháng 6-8, quả tháng 9-12 [4]

Giá trị sử dụng: Rễ củ được đào ở những cây trên 1 năm tuổi, phơi khô,

thái mỏng, tẩm nước gừng hoặc mật ong, sao vàng dùng làm thuốc; có tác dụng trị đau vùng lưng, khớp, thông kinh hoạt lạc, bổ nhuận phế, chữa cơ thể suy nhược, kém ăn, ho nhiều đờm, nhức đầu, bí tiểu tiện [5]

1.2 THÀNH PHẦN HÓA HỌC MỘT SỐ LOÀI THUỘC CHI CALLERYA

Ting Yin và cộng sự đã phân lập được flavonoid millettiaspecoside A, millettiaspecoside B, millettiaspecoside C, millettiaspecoside D, khaephuoside B, seguinoside K, ablbrissinoside B từ phân đoạn n-butanol

của dịch chiết cồn củ Callerya speciosa (Champ.) [6], [7]

Zong XK và cộng sự đã phân lập được thêm 5 chất từ dịch chiết cồn

95o củ Callerya speciosa: Isoliquitigenin, maackiain, pterocarpin,

medicarpin, homopterocapain [8]

Ping Ding và cộng sự đã phân lập được thêm 13 chất từ phân đoạn

ether và ethyl acetat dịch chiết củ M speciosa: docosanoic acid, tetracosane,

octadecane, hexacosanoic acid, β-sitosterol acetate, β-sitosterol, syringin, maackiain, ormononetin, ψ-baptigenin, rotundic acid, pedunculoside và daucosterol Trong đó có β-sitosterol acetate, syringin, ψ-baptigenin, rotundic acid và pedunculoside là những chất lần đầu tiên được công bố có mặt trong cây [9]

Wang Cheng – wen đã định lượng được hàm lượng flavonoid tổng

trong dịch chiết chloroform rễ củ Millettia speciosa lên đến 5,52 mg/g dược

5-Ito Chihiro và cộng sự đã phân lập được các isoflavonoid từ dịch chiết aceton của thân và hạt loài Callerya atropurpurea (Millettia atropurpurea) gồm: isoformonotein, sayanedine, prunetin, formonotein,

auriculasin, millepurone, vestitol và millepurpan [12]

Fang Song-Chwan và cộng sự đã phân lập được 6 flavonoid từ thân loài Callerya reticulata var reticulata (Millettia reticulata Benth.) gồm: (-)

epicatechin; narigenin; 5,7,3’,5’- tetrahydroxy flavone; formononetin;

isoliquirtigenin và genistein [13]

Theo Đỗ Tất Lợi, loài M speciosa có chứa tinh bột và alkaloid [14]

1.3.TỔNG QUAN PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU PHÂN LOẠI THỰC VẬT DỰA TRÊN CHỈ THỊ PHÂN TỬ

1.3.1 Tổng quan về trình tự bảo tồn trong các bộ gene thực vật

Hệ thống hóa là quá trình thăm dò, mô tả và giải thích tính đa dạng của thế giới sinh vật Vào năm 1758, Linnaeus đã xây dựng hệ thống phân loại mang tính thứ tự trước khi phát triển học thuyết tiến hóa Sự xuất hiện và phát triển của các kỹ thuật phân tử mà đặc biệt là phản ứng chuỗi polymer hóa – PCR [15] đã hình thành nên một lượng lớn các dữ liệu sẵn sàng cho việc giải trình tự DNA và các kỹ thuật làm nảy sinh đặc trưng nhận dạng DNA Nhiều dạng đặc điểm mang tính thông tin, đặc biệt là các trình tự DNA đã được ứng dụng trong nghiên cứu mối quan hệ phát sinh và quá trình tiến hóa ở thực vật Các thực vật bậc cao mang trong nó ba bộ gene: bộ gene trong nhân, bộ gene

ty thể và bộ gene lạp thể Tỷ lệ thay thế các nucleotide ở các bộ gene này xảy

ra không đồng đều Tỷ lệ thay thế các nucleotide ở mỗi bộ gene đã được đánh giá thông qua việc quan sát các thay thế nucleotide ở hàng loạt thực vật một

và hai lá mầm [16] Bộ gene ty thể có mức độ thay thế nucleotide thấp nhất, trung bình khoảng (0,2 - 1,1) × 10-9 thay thế cho một vị trí trong một năm Bộ gene lạp thể có mức độ thay thế nhanh hợn chút ít, khoảng (1,1 – 2,9) × 10-9

thay thế cho một vị trí trong một năm Trái lại, bộ gene trong nhân có tỷ lệ thay thế nucleotide nhanh hơn gấp 150 lần so với bộ gene ty thể (đến 31,5 ×

10-9 thay thế cho một vị trí trong một năm Nghiên cứu đánh giá về tỷ lệ thay thế nucleotide dựa trên các dữ liệu trình tự từ lúa và ngô cũng cho kết quả tương tự như Wolfe và cộng sự Tỷ lệ thay thế nucleotide ở những cây này khác về căn bản so với sự tiến hóa nhanh chóng của các phân tử ty thể ở động vật Trong lịch sử tương đối ngắn của hệ thống học phân tử, lúc đầu các nhà nghiên cứu tập trung tương đối nhiều vào bộ gene lục lạp, tuy nhiên điều đó

đã thay đổi khi các khảo sát về sau đã chuyển hướng sang các trình tự gene trong nhân [17]

1.3.2 Bộ gene lục lạp

Bộ gene lục lạp của đa số các thực vật trên cạn thông thường được đặc trưng bởi phân tử dạng vòng Bộ gene này bé nhất trong số ba bộ gene, khoảng 135-160kb [18] với hai phân đoạn lặp đảo [inverted repeat (IR) segments] chia phần phân tử còn lại thành một vùng LSC (large single-copy region) và một vùng SSC (small single-copy region) Thành phần, kích thước, cấu trúc và trình tự của bộ gene lục lạp đã được xác định là có mức độ bảo tồn cao trong các nghiên cứu về tiến hóa [19] Tính bảo tồn cao này chỉ ra rằng bất kỳ thay đổi nào về cấu trúc, cách sắp xếp hay thành phần đều liên quan mạnh mẽ đến quan hệ phát sinh Các phần khác nhau của bộ gene tiến hóa theo các tỷ lệ khác nhau và tương đối chậm ở mức độ trình tự nucleotide Những vùng không mã hóa của bộ gene lục lạp tiến hóa nhanh hơn những vùng mã hóa [16] Các đột biến ở DNA lục lạp thường là các thay thế nucleotide hay sự sắp xếp lại Các đột biến tăng đoạn hay mất đoạn tích lũy trong vùng không mang mã xảy ra với tỷ lệ ngang với sự thay thế nucleotide

và chính kiểu đột biến này làm tăng cường tính đa dạng của các vùng không mang mã Phần lớn các gene lục lạp là loại gene đơn bản trong khi các gene trong nhân là thành viên của những họ đa gene Tính bảo tồn cao của DNA lục lạp thực sự là ưu thế khi sử dụng nó để xây dựng lại mối quan hệ phát sinh

và quá trình tiến hóa ở các mức độ từ loài đến chi và đến họ thực vật [20],[17]

Có thể thấy những gene mã hóa và không mã hóa ở lục lạp thường được sử dụng trong nghiên cứu quan hệ phát sinh như sau:

1.3.3 Các trình tự bảo tồn ở bộ gene trong nhân

Bộ gene trong nhân có kích thước lớn nhất trong số ba bộ gene ở thực vật (1.1 × 106 đến 110 × 106 kbp) và bao gồm rất nhiều gene Phần lớn các nổ

lực nghiên cứu về quan hệ phát sinh bằng chỉ thị phân tử sử dụng các trình tự DNA ribosome trong nhân Cấu trúc căn bản của DNA ribosome là một đơn

vị lặp đơn, mỗi đơn vị như thế có thể lặp lại đến hàng ngàn lần trong bộ gene

Bộ gene trong nhân chứa một vùng sao mã có cấu trúc bao gồm khoảng trống bên ngoài vùng sao mã (ETS), tiếp theo là gene 18S mã hóa cho tiểu đơn vị nhỏ và gene 26S mã hóa cho tiểu đơn vị lớn vốn phân cách nhau bởi một gene nhỏ hơn là 5,8S Các khoảng trống trong vùng phiên mã (ITS1 và ITS2) tách rời những gene vừa đề cập Chiều dài của ba vùng mang mã là giống nhau ở các thực vật: gene 18S là khoảng 1800bp, 26S là khoảng 3300bp và gene 5,8S

là khoảng 160bp Ngược lại, chiều dài của các khoảng trống giữa các gene biến động từ 1 đến 8kb Họ gene rDNA chứa các vùng bảo tồn cao như 18S, 26S có thể sử dụng để suy luận các quan hệ phát sinh ở các mức độ phân loại cao Các đoạn tiến hóa nhanh như các vùng ITS có thể là thích hợp nhất trong

so sánh các loài và những chi gần nhau, thậm chí là so ở mức độ các quần thể

Các trình tự 18S rDNA thường được sử dụng rộng rãi hơn các trình tự 26S Cho dù cả hai vùng cùng được có dải ứng dụng rộng như nhau nhưng kích thước trên 3000bp của 26S rDNA đã cản trở các nhà nghiên cứu, đặc biệt

là trong việc giải trình tự toàn bộ gene Trái lại, kích thước của 18S rDNA khoảng 1800bp giúp cho nó được ưu tiên lựa chọn hơn để khuếch đại bằng PCR và giải trình tự Thực tế cho thấy hình thể cây quan hệ phát sinh sử dụng trình tự 18S rDNA khá đồng dạng với cây quan hệ phát sinh sử dụng trình tự

rbcL ở nhiều mức độ phân loại ở thực vật hạt kín Cho dù rất có tiềm năng

trong việc xây dựng cây quan hệ phát sinh ở thực vật, vùng 18S rDNA vẫn chưa được tận dụng trong hệ thống học thực vật hạt kín [17]

Gene 26S rDNA thường được lưu ý là ứng viên cho việc thay thế gene 18S rDNA Khi so sánh có thể nhận thấy toàn bộ gene 26S rDNA tiến hóa nhanh gấp từ 1,6 đến 2,2 lần và cung cấp các đặc điểm mang tính thông tin nhiều hơn 3 lần so với 18S rDNA

Gene 5,8S rDNA dễ dàng được khuếch đại và giải trình tự khi sử dụng các mồi định vị trên các gene 18S và 26S rDNA Gene 5,8S rDNA hiếm khi được sử dụng để suy luận quan hệ phát sinh bởi tính bảo tồn cao và kích thước bé (164-165bp) Tỷ lệ các vị trí mang thông tin tiềm năng cho phân tích quan hệ phát sinh ở thực vật có hạt cũng tương đương với gene 18S rDNA Vùng ITS: ITS1 phân cách gene 18S rDNA với gene 5,8S rDNA còn ITS 2 phân cách gene 5,8S rDNA với gene 26S rDNA Vùng ITS hiện hữu một cách rộng rãi dưới 700bp ở các thực vật có hoa [21] Vùng ITS chứa các trình tự bảo tồn cao nên rất nhiều mồi tổng thể được thiết kế cho việc khuếch đại và giải trình tự đã được mô tả Các trình tự ITS1 và ITS2 vốn giàu GC làm cho việc giải trình tự trở nên khó khăn Khó khăn trong việc giải trình tự biến động theo các nhóm thực vật và việc cho thêm DMSO hay BSA vào PCR hay phản ứng giải trình tự là việc bổ sung mang lại hiệu quả cao [22] Việc căn trình tự ITS từ nhiều họ thực vật hạt kín chỉ ra rằng các trình tự ITS1

và ITS2 đa dạng hơn trình tự của các gene rDNA Các trình tự ITS biến động một cách hiệu quả cho phép giải quyết những câu hỏi về quan hệ phát sinh ở những taxon có quan hệ họ hàng gần Theo đó, rất nhiều các bài báo thể hiện

sự thành công trong việc xây dựng lại lịch sử tiến hóa sử dụng các trình tự ITS [23],[24] Hơn nữa, vùng ITS được di truyền theo kiểu từ cả cha và mẹ khiến cho nó cũng có thể được sử dụng để thăm dò sự lai chéo [25]

1.3.4 Kết quả nghiên cứu ADN mã vạch trong kiểm định giống nhân sâm

Tại Hàn Quốc, việc sử dụng các chỉ thị phân tử trong phân loại chi Panax đã được triển khai nhiều và đạt được nhiều kết quả mang tính ứng dụng cao Trường đại học tổng hợp Hàn Quốc Thư viện BAC (bacterial artificial chromosome) gồm 106.368 dòng với chiều dài trung bình khoảng 98,61kb[26] Từ thư viện BAC các nhà khoa học đã thiết kế các chỉ thị phân

tử SSR và thành công trong việc xác định chỉ thị phân tử đặc hiệu trong phân biệt các giống sâm của Hàn Quốc và trên thế giới Trường đại học Chung Ang Hàn Quốc đã nghiên cứu sự khác nhau giữa các loài nhân sâm bằng chỉ thị phân tử RAPD Kết quả mồi OP-5A cho băng đơn ADN với các mẫu nhân

Mồi chỉ thị RAPD13B chỉ sự khác nhau giữa các loài sâm [27] Trường đại học William & Mary của Mỹ đã nghiên cứu đa dạng di truyền Sâm Mỹ và nghiên cứu chọn giống Sâm bằng chỉ thị phân tử [28]

Năm 2011, Lee và cộng sự đã phát triển một chỉ thị SCAR dẫn xuất từ

ISSR để nhận dạng các chủng sâm P.ginseng có đặc tính tốt phục vụ cho chọn

giống 34 trong số 85 mồi ISR hình thành locus đa hình Các mồi UBC-821, UBC-868 và UBC-878 làm nảy sinh các băng đa hình giữa các chủng

P.ginseng và cho phép phân biệt chúng với các mẫu P.quinquefolius và P.notoginseng [29]

Tác giả Hongtao Wang – Trung tâm nghiên cứu và sản xuất Sâm của Hàn Quốc đã nghiên cứu xác định chỉ thị phân tử đặc hiệu phân biệt giống sâm Chunpoong với các giống Sâm khác Giống sâm Chunpoong là một giống nhập nội chất lượng cao và chất lượng cao trong số chín giống nhân sâm Hàn Quốc Trung tâm đã nghiên cứu quy trình kiểm định giống Chunpoong bằng chỉ thị phân tử sử dụng các trình tự ADN của ty lạp thể (COX2) trên vị trí intron I và intron II Chỉ thị phân tử SNP đặc hiệu đã được nghiên cứu dùng phân biệt giống nhân sâm Chunpoong với các giống nhân sâm khác một cách đơn giản và chính xác [30]

Từ năm 2012 đến nay Trung tâm Ươm tạo và Hỗ trợ doanh nghiệp Khoa học công nghệ đã hợp tác nghiên cứu giải trình tự hệ gen lục lạp của Sâm Ngọc Linh với Trường đại học Quốc gia Seuol Hàn Quốc Cuối năm

2015 tác giả Nguyễn Văn Binh, cán bộ của Trung tâm đã nghiên cứu giải trình tự hoàn thiện genome lục lạp trên Sâm Ngọc Linh [31] Kết quả này đóng vai trò rất quan trọng trong việc nghiên cứu mối quan hệ di truyền của Sâm Ngọc Linh với các loài khác trong họ Araliaceae và là cơ sở dữ liệu cho việc thiết kế các chỉ thị phân tử đặc trưng cho loài

1.4 CÁC NGHIÊN CỨU VỀ NHÂN GIỐNG VÔ TÍNH TRÊN CÂY SÂM NGỌC LINH

Nguyễn Ngọc Dung là một trong những tác giả đầu tiên nghiên cứu nhân giống vô tính Sâm Ngọc Linh bằng con đường sinh học thông qua tái sinh từ mô sẹo [32] Năm 2010, Dương Tấn Nhật và cộng sự cũng tiến hành

nhân giống vô tính cây Sâm Ngọc Linh thông qua con đường phát sinh cơ quan [33] Mô sẹo được cảm ứng ở các mẫu củ Sâm Ngọc Linh cắt mỏng trên môi trường MS bổ sung 1,0 mg/l 2,4D và 0,2 mg/l TDZ trong điều kiện chiếu sáng 16h/ngày Môi trường tốt nhất cho tỷ lệ tăng sinh khối mô sẹo là môi trường MS bổ sung 1,0 mg/l 2,4D và 0,2 mg/l TDZ Số chồi tái sinh từ mô sẹo đạt cao nhất trên môi trường Sh bổ sung1,0 mg/l BA, 1,0 mg/l NAA và 2,0 g/l thanh hoạt tính Trong giai đoạn tăng trưởng chồi, môi trường ½MS đực bổ sung 1,0 mg/l BA và 0,5 mg/l NAA, 50 g/l sucrose và 2 g/l thanh hoạt

tính Nguyễn Bảo Triệu và công sự cũng đã tiến hành nghiên cứu nuôi cấy in

vitro Sâm Ngọc Linh trên môi trường MS bổ sung 1,0mg/l 2,4D, 0,2 mg/l

TDZ và trên môi trường SH bổ sung 1.0 mg/l BA, 0,5 mg/l NAA Mai Trường và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu về tạo và nhân giống phôi sôma Sâm Ngọc Linh trong môi trường lỏng [34] Hoàng Xuân Chiến và cộng sự đã thử nghiệm khả năng tạo củ in vitro và xác định hàm lượng saponin ở các cây trồng thử nghiệm 17 tháng tuổi [35] Các hệ phức hợp của GA/ABA và auxin/cytokinin trong quá trình hình thành củ cũng được tác giả khảo sát Nồng độ ABA thích hợp nhất cho quá trình tạo củ là 3,0 mg/l GA3 ức chế khả năng tạo củ in vitro cây Sâm Ngọc Linh Các chồi cây Sâm Ngọc Linh được cảm ứng để tạo củ thành công trên môt trường SH có bổ sung 1,0 mg/l NAA và 2,0 mg/l BA trong điều kiện chiếu sáng 16h/ngày Nồng độ đường sucrose tốt nhất cho quá trình tạo củ là 50 g/l Hàm lượng saponin trong củ của những cây 17 tháng tuổi nuôi trồng ngoài tự nhiên cũng đã được xác định

là G-Rb1 (0,21%), G-Rg1 (0,17%) MR2 (0,77%) [35]

1.5 TÌNH HÌNH NHÂN GIỐNG LOÀI CELLERYA SPECIOSA CHAMP

1.5.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Năm 2008, Huang và cs đã nghiên cứu về kỹ thuật nuôi cấy mô

Millettia speciosa Champ (tên gọi khác của Cellerya speciosa Champ.): Họ

đã tìm được môi trường nền là MS + 1,0 mg/l 6-BA + 0,1 mg/l IBA kết quả cho tỷ lệ cảm ứng tạo chồi có thể đạt 100% Sau khi cấy 20 ngày, các chồi nách bắt đầu nảy mầm và phát triển bình thường Với môi trường nhân nhanh

là MS + 2,0 mg/l 6-BA + 0,1 mg/l IBA, sau nuôi cấy 30 ngày cho hệ số nhân

cây hoàn chỉnh tốt nhất là 1/2MS + 0,5 mg/l IBA + 0,5 mg/l IAA cho tỷ lệ ra

rễ đạt 80%, chất lượng rễ tốt nhất [36]

Năm 2010, Pan và cs đã tiến hành nghiên cứu nuôi cấy mô tế bào cây

thuốc Millettia speciosa Champ Kết quả của nghiên cứu: sử dụng các đoạn thân cây của Millettia speciosa Champ để làm mẫu cấy để khử trùng và kết

luận là mẫu cấy khử trùng trong 5 phút với 0,1% HgCl2 là thích hợp nhất Môi trường cảm ứng tạo mô sẹo cao nhất là môi trường MS có bổ sung 1,0

mg/l αNAA [Error! Reference source not found.] Các chồi nách ở thân có

thể tái sinh tạo chồi trong môi trường nuôi cấy có bổ sung thêm với 2,0 và 2,5 mg/l 6-BA, nhưng tỷ lệ tái sinh tạo chồi cao nhất chỉ đạt 78,6% Môi trường tốt nhất cho tái sinh chồi nách là MS + 2,0 mg/l 6-BA + 0,05 mg/l αNAA, hệ

số nhân là 4,0 - 5,0 sau khi nuôi cấy trong 30 ngày Tỷ lệ ra rễ của chồi đạt 66,7% trên môi trường 1/2MS + 2,5 mg/l αNAA + 2,5 mg/l IBA và tỷ lệ sống của cây đạt 85% sau 30 ngày ở giai đoạn vườn ươm khi cây giống cấy mô được trồng trên giá thể là hỗn hợp chất đất và cát ở tỷ lệ (3:1) [37]

1.5.2 Tình hình nghiên cứu trong nước

Năm 2015, Nguyễn Thị Minh Hiền đã nghiên cứu nhân giống

in-vitro cây Sâm Nam Núi dành bằng phương pháp tạo callus Nghiên cứu đã

thu được các kết quả: Các chất điều tiết sinh trưởng 2,4-D, αNAA, BA có cảm ứng kích thích lớp mỏng mô lá Sâm Nam Núi dành tạo callus, tạo rễ nhưng không tạo chồi Bổ sung 3,0 mg/l αNAA là thích hợp nhất cho sự tái

sinh tạo callus cũng như tạo củ in vitro từ lớp mỏng mô lá Sâm Nam Núi

dành Nguồn gốc callus tái sinh từ các môi trường khác nhau có ảnh hưởng

rõ rệt đến sự sinh trưởng của callus khi được cấy chuyển lên các môi trường tái sinh mới Trong đó, các khối callus trước đó được tái sinh từ lớp mỏng tế bào mô lá Sâm Nam Núi dành trên môi trường (DCR + 3,0 mg/l αNAA) có khả năng sinh trưởng tốt nhất Nồng độ đường sucrose 30 g/l là thích hợp nhất cho sự sinh trưởng của callus

Theo nghiên cứu của Hoàng Vũ Thơ đăng trên tạp chí Công nghệ sinh học và Giống cây trồng với nội dung: “Nghiên cứu khả năng ra rễ của

Sâm Nam Núi dành (callerya spp.) bằng phương pháp giâm hom” Thời

gian giâm hom vào vụ Xuân, với hom thu từ cây mẹ tuổi 4 cho thấy: 1) Sử dụng IBA nồng độ 750ppm cho tỷ lệ ra rễ đạt 11,11%, số rễ trung bình trên hom là 0,24 rễ, chiều dài rễ trung bình là 3,0cm và chỉ số ra rễ đạt trị số 0,72; 2) Khi sử dụng NAA nồng độ 500ppm cho tỷ lệ ra rễ hom đạt 11,11%, số rễ trung bình trên hom là 0,2 rễ, chiều dài trung bình của rễ là 1,33cm và chỉ số ra rễ là 0,27; 3) Sử dụng TTG giâm hom cho tỷ lệ ra rễ đạt 2,22%, số rễ trung bình trên hom là 0,02, chiều dài trung bình của rễ là 1,5cm và chỉ số ra rễ là 0,03 Khả năng ra rễ của hom chịu ảnh hưởng rõ rệt của nồng độ hoocmone

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1.2.Vật liệu nghiên cứu

- Các mẫu Sâm thu thập trên địa bàn tỉnh Bắc Giang

- Danh sách các đoạn mồi ITS [38](Bảng 2.1)

Bảng 2 1 Danh sách các mồi ITS

2.1.3 Địa điểm và thời gian nghiên cứu

- Thí nghiệm giâm hom được thực hiện tại Viện Di truyền Nông nghiệp

và xã Việt Lập – huyện Tân Yên – Bắc Giang

- Nghiên cứu quy trình nhân giống in-vitro, nghiên cứu các marker đặc

trưng để nhận dạng chính xác loài Sâm Núi Dành được thực hiện tại Viện Di truyền Nông nghiệp

- Phân tích định tính các thành phần hóa học thực hiện tại Viện Hóa học – Viện Hàn Lâm Khoa học & Công nghệ Việt Nam

- Thời gian nghiên cứu : 2017 – 8/2019

2.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

2.2.1 Nội dung 1: Thu thập, lấy mẫu và phân loại chính xác loài

Sâm Núi Dành bằng marker phân tử trong số các mẫu Sâm thu thập được trên địa bàn tỉnh Bắc Giang

- Công việc 1 : Điều tra, thu thập thông tin và lấy mẫu một số loài Sâm phân

bố trên địa bàn tỉnh Bắc Giang

- Công việc 2: Nghiên cứu xác định các marker đặc trưng-Barcode (trình tự ITS của gen ribosom nhân) để nhận dạng chính xác loài Sâm Núi Dành

2.2.2 Nội dung 2: Phân tích định tính một số nhóm chất trong củ Sâm Núi Dành

- Công việc : Phân tích định tính một số nhóm chất trong loài Sâm Núi Dành

2.2.3 Nội dung 3: Nghiên cứu xây dựng quy trình nhân giống vô tính cho loài Sâm Núi Dành bằng phương pháp giâm hom và phương

pháp nuôi cấy in-vitro

- Công việc 1: Nghiên cứu phương pháp nhân giống loài Sâm Núi Dành tại vùng bản địa bằng các phương pháp giâm hom

- Công việc 2: Nghiên cứu xây dựng quy trình nhân giống cho loài Sâm Núi

Dành bằng phương pháp nuôi cấy in-vitro

2.3.PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.3.1.Phương pháp thu mẫu và lấy mẫu ngoài thực địa

Sử dụng phương pháp thu mẫu thực địa theo Nguyễn Nghĩa Thìn (1997, 2007)

- Phương pháp thu mẫu: Mẫu vật được thu hái theo danh lục đã phỏng vấn và theo sự chỉ dẫn của các thầy thuốc bản địa Các mẫu thu được có bộ phận dinh dưỡng và bộ phận sinh sản; trường hợp mẫu thu được không đủ đặc điểm phân loại (do không vào mùa hoa, quả) thì tiến hành thu và thay thế mẫu trong các đợt thu mẫu tiếp theo Mỗi mẫu đều được gắn nhãn (etyket) ghi số hiệu mẫu, địa điểm và nơi lấy, các đặc điểm quan trọng: cây gỗ hay dây leo; màu sắc lá, hoa, quả; mùi vị đặc trưng (nếu có); có nhựa mủ hay không; môi trường sống

- Cách xử lý mẫu: Mẫu vật được xử lý ngay sau mỗi đợt thu mẫu, ép tạm thời bằng giấy báo, buộc chặt, cho vào túi nilon và tẩm cồn 70%

- Chụp ảnh: sử dụng máy ảnh để ghi lại hình ảnh của các loài cây thuốc, cách

sơ chế, sử dụng và những hoạt động của tập thể trong quá trình nghiên cứu

2.3.2 Phương pháp đánh giá đa dạng di truyền của các giống/loài bằng các marker đặc trưng-Barcode

2.3.2.1 Tách chiết ADN tổng số

Phương pháp sử dụng CTAB có cải tiến

Quy trình:

- Chuẩn bị sẵn dung dịch đệm chiết CTAB ở 60C

- Nghiền 0,3 gam mẫu lá bằng chày cối sứ vô trùng trong nitơ lỏng đến khi thành dạng bột mịn (mẫu sâm, chày, cối được giữ trước ở - 80C)

- Hoà tan mẫu đã nghiền nhỏ trong 800l CTAB buffer và 60l SDS 10% Thành phần dung dịch đệm chiết: Tris-bazơ 100 mM, EDTA 20 mM, NaCl 1,4 M, CTAB 2%

- Ủ mẫu ở 65C trong bể ổn nhiệt, thời gian 60 phút

- Bổ sung Chloroform, lắc nhẹ cho tới khi thành dạng nhũ sữa Ly tâm

11000 vòng/phút trong 30 phút ở nhiệt độ 4C Hút dung dịch phía trên chuyển sang ống mới

- Tiếp tục chiết lần 2 bằng Chloroform, thu được dịch chiết chứa ADN

- Tủa ADN bằng isopropanol đã làm lạnh Để ở -20C trong 1 giờ

- Ly tâm thu tủa 10500 vòng/phút trong 15 phút ở 4C

- Rửa tủa bằng ethanol 70%, ly tâm thu tủa, làm khô và hoà tan trong đệm TE

- Loại ARN: bổ sung RNase vào mẫu ADN và ủ ở 37C trong 1 giờ

Các bước tiếp theo tương tự các bước 5-9

2.3.2.2 Thành phần của một phản ứng PCR

2.3.2.4 Phương pháp điện di trên gel agarose

Cân 0,4 g agarose cho vào 40 ml TAE 1X, đun đến sôi để agarose tan hoàn toàn Để nguội 45-50C bổ sung 2,5 l Ethidium Bromide, đổ vào khuôn gel đã được chuẩn bị sẵn Sau 30-60 phút, khi gel đã nguội và đông cứng thì chuyển khay chứa bản gel vào máy điện di và cho đệm chạy TAE 1X vào buồng điện di sao cho đệm ngập bản gel khoảng 0,5-1 cm

Tra mẫu: Sản phẩm PCR được trộn với 4 l loading dye và tra vào các giếng trên gel

Chạy điện di: Sau khi tra mẫu điện di xong, máy điện di được kết nối với

bộ nguồn Đặt 130V

Quan sát: gel được soi dưới đèn tử ngoại, ADN sẽ được phát sáng nhờ liên kết với EtBr

2.3.2.5 Phương pháp thôi gel theo kit Qiagen

1 Cắt lấy đoạn ADN mong muốn từ gel agarose, cho đoạn gel vừa cắt vào ống eppendorf 2ml

2 Bổ sung buffer QG theo tỷ lệ 3 thể tích QG: 1 thể tích gel (100mg

~100μl)

3 Ủ ở nhiệt độ 50°C trong khoảng 10 phút cho đến khi gel tan hoàn toàn

4 Sau khi gel tan hoàn toàn, kiểm tra màu của dung dịch phải là màu vàng, nếu màu của dung dịch là màu cam hoặc màu tím xanh thì phải bổ sung 10μl sodium acetate 3M, pH 5

5 Cho dung dịch mẫu đã hoà tan ở trên vào cột QIAquick và ly tâm tốc

8 Chuyển cột QIAquick sang ống microcentrifuge 1.5ml sạch

9 Để hoà tan ADN, bổ sung 30 μl nước (pH 7 – 8.5) vào giữa màng của cột QIAquick và ly tâm tốc độ 13 000 rpm trong 1 phút, thu lượng ADN

tinh sạch

2.3.2.6 Giải trình tự

Sản phẩm PCR ITS sau khi được tinh sạch, được giải trình tự tại công ty Macrogen (Hàn Quốc) Kết quả giải trình tự được được so sánh với các trình tự tương đồng trên NCBI Sau đó, các trình tự được tập hợp lại và phân tích bằng chương trình MEGA v5.1 để tạo cây phát sinh loài

2.3.3 Phương pháp phân tích định tính một số nhóm hoạt chất có dược tính trong loài Sâm Núi Dành

2.3.3.1 Phương pháp chiết mẫu

Mẫu rễ Sâm Núi Dành được sấy khô, xay nhỏ và ngâm chiết với EtOH ở nhiệt độ phòng, 3 lần, mỗi lần 8 h Gộp dịch chiết của 3 lần chiết để tiến hành phân tích định tính

2.3.3.2.Định tính các nhóm chất bằng phản ứng hóa học

a Định tính saponin:

Bằng hiện tượng tạo bọt [39]

Cách tiến hành: cân 1g bột củ Sâm Núi Dành (qua rây số 32), cho vào bình tam giác có thể tích 500ml đã chứa sẵn 100ml nước sôi, giữ cho sôi nhẹ trong 30 phút, lọc, để nguội và thêm nước cho đúng 100ml Lấy 1 ống nghiệm

có chiều cao 16 cm và đường kính 16 mm, cho vào ống nghiệm 10ml nước sắc Bịt miệng các ống nghiệm rồi lắc theo chiều dọc trong 15 giây, mỗi giây

2 lần lắc Ðể yên 15 phút nếu có bọt xuất hiện thì kết luận trong mẫu có chứa saponin

b Định tính flavonoid :

- Phản ứng với kiềm: Thêm vài giọt dung dịch NaOH 10% vào dịch chiết sẽ thấy xuất hiện tủa vàng Sau đó, thêm nước cất, tủa sẽ tan và màu vàng của dung dịch sẽ được tăng thêm[40]

- Phản ứng Cyanidin (Phản ứng Shinoda): Ðây là phản ứng khử cũng được sử dụng để tìm sự có mặt của các dẫn chất nhóm flavonoid

- Phản ứng với dung dịch FeCl3

- Tác dụng với H2SO4 đậm đặc

c Định tính coumarin:

- Quan sát dưới đèn tử ngoại ở bước sóng 366nm

- Quan sát huỳnh quang của các vết coumarin dưới ánh sáng tử ngoại khi tác

dụng với dung dịch kiềm (Phản ứng chuyển từ đồng phân cis sang đồng phân

trans dưới tác dụng của tia tử ngoại)

Dựa vào huỳnh quang tăng lên ở môi trường kiềm khi soi dưới ánh đèn

tử ngoại Nguyên nhân sau khi mở vòng lacton bằng kiềm thì coumarin tạo thành dẫn chất hydroxycinnamic ở dạng cis (acid coumarinic) Chất này dưới tác dụng của tia tử ngoại thì chuyển thành dạng trans (acid coumaric) có huỳnh quang sáng hơn [41]

d Định tính acid hữu cơ:

Sử dụng thuốc thử Dragendorff (KBiI4 – Kali tetraiodobismutat)

Thuốc thử Dragendorff được chuẩn bị từ hai dung dịch sau:

Dung dịch 1: Lấy 0,85 g NaHSO3 hòa tan trong 40 ml nước cất và 10

ml acid acetic

Dung dịch 2: Lấy 8 g KI hòa tan trong 20 ml nước cất

Lấy 2 ml dung dịch 1 trộn với 5 ml dung dịch 2 và thêm 20 ml acid acetic sau đó thêm nước cất đến 100 ml là được thuốc thử Dragendorff

Nếu có mặt alkaloid thì thấy xuất hiện màu da cam sáng

2.3.4 Phương pháp nhân giống vô tính cho loài Sâm Núi Dành

2.3.4.1 Nghiên cứu phương pháp nhân giống vô tính bằng giâm hom

 Thí nghiệm 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ hoocmone sinh trưởng đến khả năng ra rễ và nảy chồi của hom Sâm Núi Dành

- Bố trí thí nghiệm: 4 công thức thí nghiệm và 1 công thức đối chứng:

+ ĐC: Nhúng qua nước cất

+ CT 1: Dung dịch IBA nồng độ 500ppm, nhúng nhanh trong 5 giây

+ CT 2: Dung dịch IBA nồng độ 1.000 ppm, nhúng nhanh trong 5 giây

+ CT 3: Dung dịch IBA nồng độ 1.500 ppm, nhúng nhanh trong 5 giây

+ CT 4: Dung dịch IBA nồng độ 2.000 ppm, nhúng nhanh trong 5 giây

Các công thức và đối chứng được bố trí theo khối ngẫu nhiên đầy đủ,

3 lần lặp, số mẫu cho mỗi công thức và đối chứng là 90 hom

-Vật liệu sử dụng: là các đoạn thân bánh tẻ có chứa mắt ngủ

- Phương pháp: Cắt thành các hom có từ 2 – 3 mắt Sau đó tiến hành nhúng nhanh qua các công thức thí nghiệm Và giâm hom vào trong khay cát sạch đã được xử lý sạch với nước và đem phơi khô

- Chăm sóc: Sau khi giâm hom được che nắng và giữ ẩm thường xuyên

 Thí nghiệm 2: Xác định giá thể ra cây phù hợp cho cây giâm hom

Các mẫu hom đã ra rễ thu được từ kết quả của thí nghiệm 1 được lấy làm vật liệu cho thí nghiệm 2

- Bố trí thí nghiệm: 4 công thức giá thể sau

+ GT 1: Đất tầng B

+ GT 2: 50% đất tầng B+ 20% trấu hun + 30% bột xơ dừa

+ GT 3: 30% đất tầng B + 20 % trấu hun + 50% bột xơ dừa

+ GT 4: 40% đất tầng B + 60% bột xơ dừa

Chú ý: Đất tầng B- lớp đất thứ 2 từ trên mặt xuống, sau lớp tầng đất mặt hay tầng đất canh tác (đất tầng A), tích tụ các chất rửa trôi từ tầng A xuống, được lấy tại chân Núi Dành - thôn Đồng Sen - xã Việt Lập - huyện Tân Yên

Giá thể được xử lý thuốc chống nấm (Benkona) trước khi sử dụng cho thí nghiệm Giá thể được đóng trong túi bầu có kích thước 10x10 Mật độ giâm 100 bầu/m2 Bầu được đặt trong bóng dâm có che phủ 1 lớp lưới đen Tưới nước giữ ẩm 3 lần/ngày trong tháng đầu tiên và 2 lần/ngày từ tháng thứ

2 Theo dõi các chỉ tiêu sinh trưởng, phát triển của hom Sâm ở các công thức thí nghiệm Các đặc điểm hình thái được theo dõi bằng phương pháp quan sát, đo đếm trực tiếp số cây sống, cây chết

2.3.4.2 Nghiên cứu xây dựng quy trình nhân giống vô tính bằng phương pháp nuôi cấy in-vitro Sâm Núi Dành

Vật liệu: Đoạn thân bánh tẻ có chứa mắt ngủ lấy từ cây Sâm Núi Dành

1 -1,5 năm tuổi Khử trùng sơ bộ dưới vòi nước chảy, rửa bằng chất tẩy nhẹ (xà phòng hoặc nước rửa chén loãng) rồi tráng qua bằng nước cất vô trùng Sau đó mẫu được đưa vào trong box cấy, khử trùng nhanh bằng cồn 70% trong 20 giây rồi rửa sạch 2 lần bằng nước cất vô trùng Sau đó thực hiện thí nghiệm khử trùng

Thí nghiệm 1: Nghiên cứu xác định biện pháp khử trùng tạo mẫu sạch:

CT5: Lắc khử trùng mẫu bằng Javen 6% trong 10 phút

CT6: Lắc khử trùng mẫu bằng Javen 6% trong 12 phút

CT7: Lắc khử trùng mẫu bằng Javen 6% trong 14 phút

CT8: Lắc khử trùng mẫu bằng Javen 6% trong 16 phút

Mẫu cấy sau khi khử trùng được cấy vào môi trường nền MS [42] không chứa hoocmon sinh trưởng Theo dõi tỷ lệ mẫu sạch bệnh, tỷ lệ mẫu nảy chồi và chất lượng chồi sau khử trùng sau 20 ngày vào mẫu

Thí nghiệm 2: Nghiên cứu xác định môi trường tái sinh chồi:

- Bố trí thí nghiệm: gồm 5 công thức và 1 đối chứng

ĐC: MS + 30 g/l Sucrose + 6,5 g/l Agar CT1: ĐC + 0,2 mg/l Ki

CT2: ĐC + 0,4 mg/l Ki CT3: ĐC + 0,6 mg/l Ki CT4: ĐC + 0,8 mg/l Ki CT5: ĐC + 1 mg/l Ki

- Sử dụng các mẫu sạch thu được từ phương pháp khử trùng tốt nhất của thí nghiệm 1 cấy trên các công thức môi trường tái sinh

- Theo dõi các chỉ tiêu sinh trưởng, tái sinh chồi, chất lượng chồi sau

30 ngày nuôi cấy

Thí nghiệm 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của BA và IBA đến hệ số nhân chồi

Chồi tái sinh được lấy từ môi trường tái sinh tốt nhất, chồi xanh mập đã

có lá được cắt thành từng đoạn dài 3-5 cm chứa 1-2 mắt ngủ được chuyển sang môi trường nhân nhanh

- Bố trí thí nghiệm: Sử dụng môi trường: MS + 30 mg/l sucrose + 6,5 mg/l aga có bổ sung BA ở các nồng độ: 2; 2,5; 3 và 3,5 mg/l và IBA ở các nồng độ: 0,1; 0,2; 0,3 và 0,4 mg/l

Theo dõi hệ số nhân chồi, chiều cao trung bình của chồi và chất lượng chồi sau 60 ngày nuôi cấy

Thí nghiệm 4: Nghiên cứu môi trường tạo rễ cho chồi Sâm Núi Dành vitro:

in-+ Thí nghiệm 4.1: Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường nền có bổ sung NAA ở các nồng độ đến khả năng hình thành rễ của chồi Sâm Núi Dành

- Bố trí thí nghiệm: gồm 10 công thức và 2 đối chứng

ĐC1: MS + 30 g/l sucrose + 6,5 g/l

agar

ĐC2: ½ MS + 30 g/l sucrose + 6,5 g/l agar

+ Thí nghiệm 4.2: Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường nền có bổ sung IBA

ở các nồng đến khả năng hình thành rễ của chồi Sâm Núi Dành

- Bố trí thí nghiệm: gồm 10 công thức sau:

+ Thí nghiệm 4.3: Nghiên cứu ảnh hưởng của than hoạt tính đến chất lượng rễ

Môi trường ra rễ tối ưu nhất từ kết quả của thí nghiệm 1 và thí nghiệm

2 được bổ sung thêm than hoạt tính với các nồng độ: 0,2; 0,4; 0,6 và 0,8 mg/l

Các thí nghiệm được theo dõi tỷ lệ ra rễ, số rễ trung bình trên mỗi mẫu, chiều dài trung bình của rễ và chỉ số ra rễ sau 90 ngày nuôi cấy

Thí nghiệm 5: Nghiên cứu ảnh hưởng của các loại giá thể đến tỷ lệ sống

của cây Sâm Núi Dành in-vitro ngoài vườn ươm

Cây Sâm Núi Dành in-vitro hoàn chỉnh được đưa ra vườn trên các loại

giá thể khác nhau

Cây in vitro hoàn chỉnh có 2-4 rễ, thân dài 10-15cm, có 3-4 nhánh thân

được huấn luyện và trồng trong bầu tại vườn ươm

- Bố trí thí nghiệm: gồm 4 công thức giá thể sau:

- GT 1: Đất tầng B

- GT 2: 50% đât tầng B + 20% trấu hun + 30% bột xơ dừa

- GT 3: 30% đất tầng B+ 20 % trấu hun + 50% bột xơ dừa

- GT 4: 40% đất tầng B + 60% bột xơ dừa

Giá thể được xử lý thuốc chống nấm (Benkona) trước khi sử dụng cho thí nghiệm Giá thể được đóng trong túi bầu có kích thước 10x10 Mật độ giâm 80 bầu/m2

Bầu được đặt trong nhà lưới có che phủ bằng nylon và 1 lớp lưới đen

Tưới nước giữ ẩm 3 lần/ngày trong tháng đầu tiên và 2 lần/ngày từ tháng thứ

2 Theo dõi tỷ lệ cây sống, cây chết, sinh trưởng và phát triển của cây

2.3.5 Phương pháp bố trí thí nghiệm

Các thí nghiệm được bố trí theo phương pháp ngẫu nhiên hoàn toàn

(Complete Randomized Design -CRD) với 20 bình, mỗi bình 4 mẫu, lặp lại 3

Số mẫu nảy chồi

 Tỷ lệ mẫu nảy chồi = x 100%

Tổng số mẫu

Số mẫu ra chồi (rễ)

 Tỷ lệ ra chồi (rễ) = x 100%

Tổng số mẫu (rễ)

 Số lượng chồi trung bình, số rễ trung bình và chiều dài trung bình chồi

trên mỗi mẫu được tính theo công thức:

 Chỉ số ra rễ = Số rễ TB/mẫu x Chiều dài rễ TB/mẫu

Điều kiện môi trường và phòng nuôi cấy

Môi trường nuôi cấy được điều chỉnh pH = 5,8 trước khi hấp khử trùng

ở áp suất 1,1 atm, nhiệt độ 1210C trong 25 phút Điều kiện nuôi cấy in vitro:

14h sáng, cường độ ánh sáng 2000 - 2500 lux, nhiệt độ 25 ± 20C

2.3.6.Phương pháp xử lý số liệu

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN

3.1 THU THẬP, LẤY MẪU VÀ PHÂN LOẠI CHÍNH XÁC LOÀI SÂM NÚI DÀNH BẰNG MARKER PHÂN TỬ TRONG SỐ CÁC MẪU SÂM THU THẬP ĐƯỢC TRÊN ĐỊA BÀN TỈNH BẮC GIANG

3.1.1 Thu thập, lấy mẫu một số loài Sâm trên địa bàn tỉnh Bắc Giang

+ Sâm Đắng ở chân núi Yên Tử, huyện Sơn Động

- Đặc điểm: Thân dây leo, cành non có lông nâu Lá kép lông chim lẻ, 11-15 lá chét, lá chét dài thon nhọn, mặt phủ lông tơ màu nâu Hoa màu nâu,

có lông tơ màu nâu phủ bên ngoài Quả đậu, có lông nâu phủ, có 2-3 hạt hình trứng

+ Sâm Ngọt (người dân còn gọi là Sâm Nam) thu tại huyện Lạng Giang

- Đặc điểm: Thân dây leo, cành non có lông bạc Lá kép lông chim lẻ, 7-11 lá chét, lá chét dài thon nhọn Hoa màu trắng ngà, có phủ lông nhung trắng Quả đậu, có phủ lông nâu, có 5-6 hạt hình trứng

+ Sâm Núi Dành thu tại xã Việt Lập và xã Liên Chung huyện Tân Yên

- Đặc điểm: Thân dây leo, cành non có lông bạc Lá kép lông chim lẻ, 3-7 lá chét, lá chét hình bầu dục, mặt phủ long tơ trắng Hoa trắng ngà, có phủ lông nhung trắng Quả đậu, có lông nâu phủ dầy, có 2-3 hạt hình trứng

a) b) Hình 3.1 a) Cây Sâm Núi Dành , b) Cây Sâm Đắng

Hình 3.2 Củ Sâm Núi Dành và củ Sâm Ngọt (Sâm Nam)

Hình 3.3 Các dạng lá Sâm thu tại tỉnh Bắc Giang

a) b) Hình 3.4 a) Quả Sâm Núi Dành b) Quả Sâm Đắng

3.1.2 Nghiên cứu xác định các marker đặc trưng-Barcode (trình tự ITS của gen ribosom nhân) để nhận dạng chính xác loài Sâm Núi Dành

Sử dụng 04 mẫu Sâm đã thu thập được làm nguồn vật liệu để tiến hành nghiên cứu cho thí nghiệm này, từ đó xác định được chính xác loài Sâm Núi Dành làm nguồn vật liệu chuẩn cho những nghiên cứu tiếp theo

Bảng 3.1 Danh sách kí hiệu 4 mẫu Sâm

STT Ký hiệu

Lập, Tân Yên, Bắc Giang

Chung, Tân Yên, Bắc Giang

Động

Giang

3.1.2.1 Phân tích các sản phẩm khuếch đại

Sau khi thực hiện phản ứng PCR, sản phẩm khuếch đại với cặp mồi ITS1/ITS4 và được điện di trên gel agarose 1,5% cho băng đơn hình với kích thước khoảng 700 bp Kết quả khuếch đại sản phẩm PCR chúng tôi tiến hành thôi gel, sử dụng cột Sigma GenElute TM Agarose Spin column (USA), nhằm thu được sản phẩm PCR đặc hiệu

3.1.2.2 Kết quả giải trình tự vùng ITS-rDNA của các mẫu Sâm

- Kích thước đoạn trình tự của các mẫu Sâm nghiên cứu

Sản phẩm PCR với cặp mồi ITS1/ITS4 sau khi tinh sạch được phân tích trực tiếp trên máy giải trình tự ABI PRISM 3700 DNA Analyzer (Applied Biotech) của công ty Macrogen (Hàn Quốc) và phần mềm MEGA v5.1, kết quả cho ra giản đồ có các đỉnh (peak) với bốn màu sắc khác nhau tương ứng với bốn loại nucleotide và biểu thị dãy trình tự các nucleotide Kết

quả đã thu được 04 đoạn trình tự ITS của 04 mẫu giống Sâm với số nucleotide khác nhau trên từng mẫu giống:

Trình tự mẫu S1 (1-640)

ATCCCGACCTGAACTGAGGTCTCGTCGTGAGCGTTCGAGGACGCCCGTGGG TCACGGAGGCCGGGTTCGGCAGGGGTCGCGCACGACTGGTCTCGAGCGTC ACTCAACCACCGTCTGTCGTGGCGCGCACCCCGCCGCGGACTCGATTTTCA GCCAACCGAGAGGCACCGGTGCTCACGGGAAGCCACCATCCACCCTGCAC AATTAGAGCACCTATCGCTAGGCAATTGGGCATCGGGCAACGGTCTGTGAC GCCCAGGCAAACGTGCCCTCAACCTAATGGCTTCGGGCGCAACTTGCGTTC AAAGACTCGATGGTTCCCGGGATTCTGCAATTCACACCAAGTATCGCATTT CGCTACGTTCTTCATCGATGCAAGAGCCTAGATATCTGTTGCCGAGAGTCA TTCTGTATAGCGTGTCAAGGCGCCGCCCGCCGGACCACCGTCTCCGGGCCG ACGGGGGCGCGCTGAACCAGTTTCAGTTCCTTGGGGCATTTGGCGCCCGGG TTTGTGTTTGGCTCGGCGGGGAACACACTGCGTGGCCCCCCTCCGAGCCCG AGGGAGAGGATGCGGCGCTGAGCACCGCAAGCCAACCCTACCGAGTGGTC AGACAGATTGCCGGTGACTGCTGGCCAGGGC

Trình tự mẫu S2 (1-633)

CTCCGATCTGAGTCTCGTCGTGAGCGTTCGAGCACGCCCGTGGGTCACG GAGGCCGGGTTCGGCAGGGGTCGCGCACGACTGGTCTCGAGCGTCACT CAACCACCGTCTGTCGTGGCGCGCACCCCGCCGCGGACTCGATTTTCAG CCAACCGAGAGGCACCGGTGCTCACGGGAAGCCACCATCCACCCTGCA CAATTAGAGCACCTATCGCTAGGCAATTGGGCATCGGGCAACGGTCTGT GACGCCCAGGCAAACGTGCCCTCAACCTAATGGCTTCGGGCGCAACTTG CGTTCAAAGACTCGATGGTTCACGGGATTCTGCAATTCACACCAAGTAT CGCATTTCGCTACGTTCTTCATCGATGCAAGAGCCTAAATATCCGTTGCC GAAAGTCATTCCGTATCGCGTGTCAAGGCGCCGCCCGCCGGACCACCGT CTCCGGGCCAACGGGGGCGCGCTGAACCAGTTTCAGTTCCTTGGCGCAT TCGGCGCCCGGGTTCGTGTTTGGCTCGGCGGGAAACACACTGCGTGGCC CCCCTCCAAGCCCGAGGGAGAGGATGCGGCGCTGAGCACCGCAAGCCA ACCCTACCGAGTGGTCAAACAGATCGCCGGTGGACTGCTGCAGGCCG

Trình tự mẫu S3 (1-490)

GGTGATCGAGCTTTCAGCAGTCCACCGGTCGATCTGTTTGACCACTCGG TAGGGTTGGCTTGCGGTGCTCAGCGCCGCATCCTCTCCCTCGGGCTCGG AGGGGGGCCACGCAGTGTGTTCCCCGCCGAGCCAAACACGAACCCGGG CGCCAAATGCGCCAAGGAACTGAAACTGGTTCAGCGCGCCCCCGTCGG

CCCGGAGACGGTGGTCCGGCGGGCGGCGCCTTGACACGCGATACGGAA TGACTCTCGGCAACGGATATCTAGGCTCTTGCATCGATGAAGAACGTAG CGAAATGCGATACTTGGTGTGAATTGCAGAATCCCGTGAACCATCGAGT CTTTGAACGCAAGTTGCGCCCGAAGCCATTAGTTGAGGGCACGTCTGCC TGGGCGTCACAGACCGTTGCCCGATGCCCAATTGCCTACGATAGGTGCT CTAATTGGCGGGGGATGGGGCTTCCCGGAAGCCGGGCCTCCGGTTGGTG AAA

Trình tự mẫu S4 (1-544)

GGTGATCGAGCTTTGCAGCAGTCCACCGGCGATCTGTTTGACCACTCGG TAGGGTTGGCTTGCGGTGCTCAGCGCCGCATCCTCTCCCTCGGGCTCGG AGGGGGGCCACGCAGTGTGTTCCCCGCCGAGCCAAACACGAACCCGGG CGCCGAATGCGCCAAGGAACTGAAACTGGTTCAGCGCGCCCCCGTCGG CCCGGAGACGGTGGTCCGGCGGGCGGCGCCTTGACACGCGATACAGAA TGACTCTCGGCAACGGATATCTAGGCTCTTGCATCGATGAAGAACGTAG CGAAATGCGATACTTGGTGTGAATTGCAGAATCCCGTGAACCATCGAGT CTTTGAACGCAAGTTGCGCCCGAAGCCTTTAGGTTGAGGGCACGTCTGC CTGGGCGTCACAGACCGTTGCCCGATGCCCAATTGCCTACGATAGGTGC TCTAATTGTGCAGGGTGGATGGTGGCTTCCCGTGAGCACCGGTGCCTCT CGGTTGGTGAAAATCAATCCGCGGCGGGGTGCCCCCACAAAAGGGGTT GATGACCTC

Kết quả phân tích vùng ITS cho thấy trình tự các nucleotide giữa 4 mẫu Sâm có sự khác biệt nhau Kết quả ở bảng 3.2 cho thấy, các mẫu nghiên cứu có tỷ lệ Guanin và Cytosine cao hơn tỷ lệ Adenine và Thymine hay nói một cách khác là đều có thành phần GC cao hơn thành phần AT Tỉ lệ thành phần GC trung bình của 4 mẫu Sâm nghiên cứu là 61,7% và tỉ lệ thành phần

* Kết quả so sánh các mẫu nghiên cứu trên Blast

Theo kết quả Blast (Basic Local Alignmet Search Tool) trong NCBI (National Center for Biotechnology Information), sự tương đồng của trình tự các nucleotid vùng ITS ở mẫu S1 với các nghiên cứu khác trong cùng chi

Callerya vào khoảng 88-99%, trong đó tương đồng với loài Callerya speciosa là 99%, cao nhất trong chi Callerya (Bảng 3.3 – Phụ lục 2)

Khi so sánh sự tương đồng trình tự các nucleotid vùng ITS của mẫu S2

với các trình tự có sẵn của các nghiên cứu khác trong chi Callerya dao động

từ 87-99%, trong đó tương đồng với loài Callerya speciosa là 99%, cao nhất trong chi Callerya (Bảng 3.4 – Phụ lục 2)

Mẫu S3, khi so sánh sự tương đồng trình tự các nucleotid vùng ITS với

các trình tự có sẵn của các nghiên cứu khác trong chi Callerya dao động từ 88-93%, tương đồng với loài Callerya speciosa là 88% (Bảng 3.5- Phụ lục 2)

Mẫu S6, khi so sánh sự tương đồng trình tự các nucleotid vùng ITS với

các trình tự có sẵn của các nghiên cứu khác trong chi Callerya dao động từ 88-91%, tương đồng với loài Callerya speciosa là 88% (Bảng 3.6- Phụ lục 2)

* Kết quả so sánh trình tự gen ITS giữa các mẫu Sâm nghiên cứu

Kết quả so sánh sự sai khác giữa 04 mẫu sâm nghiên cứu được trình bày

ở bảng 3.7 Từ bảng kết quả cho thấy, mức tương đồng di truyền của 04 mẫu Sâm dao động trong khoảng 43,4% đến 98,7% Hai mẫu (S1-S3) có mức sai khác di truyền lớn nhất (hệ số tương đồng di truyền nhỏ nhất là 0.43) Hai mẫu Sâm S1 và S2 có mối quan hệ di truyền gần nhau nhất trong 4 mẫu nghiên cứu (có hệ số tương đồng di truyền cao nhất là 0,975) Mẫu sâm S1 có

hệ số tương đồng với mẫu S3 và S4 là 0,434 và 0,43

Bảng 3 3 Hệ số tương đồng giữa các mẫu Sâm nghiên cứu