luận văn thạc sĩ nghiên cứu chiết tách và phân tích đặc điểm cấu trúc của glycosaminoglycan từ hải sâm holothuria atra

Điển hình là các hợp chất glycosaminoglycan GAG được phân lập từ động vật biển nói chung và hải sâm nói riêng, còn được gọi là polysaccharide sulfate PS là một trong những hợp chất tự nh

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của bản thân tôi dưới sự

hướng dẫn của TS Phạm Đức Thịnh và tham khảo thêm các tài liệu đã

được công bố trước đó có nguồn gốc rõ ràng Các số liệu nêu trong luận văn

là kết quả làm việc của tôi trong suốt quá trình thực nghiệm tại Viện Nghiên cứu và Ứng dụng công nghệ Nha trang, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

Nha trang, tháng 6 năm 2019

Tác giả

Mai Ngô Thương Hoài

LỜI CẢM ƠN

Đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn Ban lãnh đạo Học viện Khoa học và Công nghệ Ban lãnh đạo và các Phòng ban thuộc Viện Nghiên cứu và Ứng dụng Công nghệ Nha Trang đã tạo mọi điều kiện cho tôi hoàn thành khóa học Thạc sĩ Hóa phân tích 2017-2019 Cảm ơn Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam thông qua Đề tài HTQT mã số QTRU04.06/18-19 đã hỗ trợ kinh phí thực hiện đề tài

Tiếp theo, tôi xin cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất đến TS Phạm Đức Thịnh - Phó Viện trưởng, Viện Nghiên cứu và Ứng dụng công nghệ Nha Trang

và TS Đào Việt Hà - Viện trưởng, Viện Hải dương học đã tận tình trong việc hướng dẫn tôi trong suốt quá trình nghiên cứu tại Viện và hoàn thành luận văn

Tôi xin cảm ơn các thầy cô giảng dạy và các anh chị cùng lớp cao học

CHE17 đã tận tình giảng dạy và giúp đỡ tôi bổ sung thêm kiến thức trong suốt khóa học

Tôi xin cảm ơn các anh chị Phòng Hóa Phân tích và Triển khai công nghệ thuộc Viện Nghiên cứu và Ứng dụng Công nghệ Nha Trang đã tạo điều kiện và giúp đỡ những thiếu sót về kiến thức chuyên ngành khi tôi làm thực nghiệm đề tài của mình

Cuối cùng tôi xin dành lời cảm ơn gia đình và bạn bè của tôi, đã luôn bên cạnh ủng hộ và hỗ trợ về mặt kinh tế cũng như tinh thần để tôi tiếp tục con đường học tập của mình

Học viên

Mai Ngô Thương Hoài

Danh mục các kí hiệu và chữ viết tắt

IR : Infrared Spectroscopydesorption/ionization

DANH MỤC CÁC HÌNH VÀ ĐỒ THỊ

Hình 1.1: Hình thái chung bên ngoài của hải sâm [13]………8

Hình 1.2 Hải sâm Holothuria atra……… 10

Hình 1.3 Cấu trúc của Fucan sulfate được phân lập từ các loài hải sâm 14

Hình 1.4 Cấu trúc Fucan sulfated từ hải sâm Holothuria edulis và Ludwigothurea Grise 16

Hình 1.5 Cấu trúc minh họa của Fucosylated chondroitin sulfate (R: ester sulfate)……… 16

Hình 1.6 Cấu trúc của Fucosylate chondroitin sulfate……… 17

Hình 2.1 Hải sâm Holothuria atra đã được xử lý mẫu ………27

Hình 2.2 Quy trình chiết tách glycosaminoglycan từ hải sâm

Holothuria atra………… 30

Hình 2.3 Phân đoạn tinh chế glycosaminoglycan bằng

sắc ký trao đổi anion……… 31

Hình 2.4 Độ dịch chuyển hóa học trong phổ NMR của polysaccharide………41

Hình 3.1 Sắc ký đồ GPC của glycosaminoglycan

từ hải sâm Holothuria atra………… 45

Hình 3.2 Phân đoạn glycosaminoglycan bằng

sắc ký trao đổi anion……… 50

Hình 3.3 Sắc ký đồ đường chuẩn của sắc kí khí GC ………51

Hình 3.4 Sắc ký đồ GC của thành phần đường đơn phân đoạn F2 ……….52

Hình 3.5 Phổ IR của phân đoạn F1 ……… 55

Hình 3.6 Phổ 1H-NMR của phân đoạn F1 ………58

Hình 3.7 Phổ 13C-NMR của phân đoạn F1……… 59

Hình 3.8 Phổ IR của phân đoạn F2 ……… 60

Hình 3.9 Phổ 1H-NMR của phân đoạn F2 ………61

Hình 3.10 Phổ 13C-NMR của phân đoạn F2 ……….62

DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Hàm lượng protein và lipit trong hải sâm

tại một số vùng biển trên thế giới[15] ………11

Bảng 1.2 Thành phần và hàm lượng khoáng vi lượng

của một số loài hải sâm [16]……… 12

Bảng 1 3 Thành phần hóa học của Fucosylated chondroitin sulfate được phân

lập từ thành tế bào của một số loài hải sâm [22]……… 18

Bảng 2.1 Các đỉnh phổ đặc trưng fucoidan trên phổ hồng ngoại [58]……… 39 Bảng 3.1 Hiệu suất chiết glycosaminoglycan của các loài hải sâm ……… 44 Bảng 3.2 Thành phần hóa học của glycosaminoglycan

từ mẫu thô hải sâm Holothuria atra………48

Bảng 3.3 Thông số các mẫu đường đơn chuẩn

được đo bằng phương pháp sắc kí khí GC……….51

Bảng 3.4 Thành phần hóa học của phân đoạn glycosaminoglycan

từ hải sâm Holothuria atra ……….54

Bảng 3.5.Thành phần hóa học của phân đoạn glycosaminoglycan

từ hải sâm Stichopus variegatus [49]……… 55

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 4

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 7

1.1.GIỚI THIỆU VỀ HẢI SÂM 7

1.1.1 Giới thiệu chung về hải sâm 7

1.1.2 Giới thiệu về hải sâm Holothuria atra 8

1.1.2.1.Đặc điểm hình thái và sinh sản 8

1.1.2.2 Phân bố và môi trường sống 9

1.1.2.3 Phân loại 9

1.1.3 Thành phần hóa học của hải sâm 10

1.1.3.1 Hàm lượng protein và lipit trong hải sâm tại một số vùng biển trên thế giới 10

1.1.3.2 Thành phần và hàm lượng khoáng vi lượng của một số

loài hải sâm 12

1.2 TỔNG QUAN VỀ CẤU TRÚC CỦA GLYCOSAMINOGLICAN 13

1.2.1 Các nghiên cứu về Fucan sulfate 13

1.2.2 Các nghiên cứu về Fucosylate chondroitin sulfate 16

1.2.3 Hoạt tính sinh học và ứng dụng của glycosaminoglycan 19

1.3 LỊCH SỬ NGHIÊN CỨU TRÊN THẾ GIỚI VÀ Ở VIỆT NAM VỀ GLYCOSAMINOGLYCAN TỪ HẢI SÂM 23

1.3.1 Lịch sử nghiên cứu trên thế giới 23

1.3.2 Lịch sử nghiên cứu tại Việt Nam 24

CHƯƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27

2.1 VẬT LIỆU VÀ ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 27

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 27

2.1.2 Dụng cụ - Thiết bị - Hóa chất 27

2.1.2.1 Dụng cụ 27

2.1.2.2 Thiết bị 28

2.1.2.3 Hóa chất 28

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 29

2.2.1 Phương pháp chiết tách và phân đoạn glycosaminoglycan từ hải

sâm 29

2.2.1.1 Phương pháp chiết tách glycosaminoglycan 29

2.2.1.2 Phương pháp tách phân đoạn glycosaminoglycan 31

2.2.2 Các phương pháp phân tích thành phần hóa học của glycosaminoglycan 31

2.2.2.1 Phương pháp xác định hàm lượng tổng carbohydrate 31

2.2.2.2 Phương pháp xác định hàm lượng sulfate 32

2.2.2.3 Phương pháp xác định hàm lượng uronic axít 32

2.2.2.4 Phương pháp xác định hàm lượng protein 32

2.2.2.5 Phương pháp xác định thành phần monosaccharide 32

2.2.2.6 Sắc ký thẩm thấu gel (GPC) 32

2.2.2.7 Phương pháp phổ hồng ngoại IR 33

2.2.2.8 Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR 33

2.3 THỰC NGHIỆM 33

2.3.1 Chiết tách và phân đoạn glycosaminoglycan từ hải sâm Holothuria atra 33

2.3.1.1 Xử lý mẫu 33

2.3.1.2 Chiết tách glycosaminoglycan 34

2.3.1.3 Phân đoạn tinh chế glycosaminoglycan bằng phương pháp sắc kí trao đổi anion DEAE-Sepharose fast flow (1,5 x 20 cm) 34

2.3.2 Phân tích hàm lượng tổng carbohydrate 35

2.3.4 Phân tích hàm lượng uronic axit 36

2.3.5 Phân tích hàm lượng protein 37

2.3.6 Phân tích thành phần đường đơn 37

2.3.7 Phương pháp sắc kí thẩm thấu Gel (GPC) 38

2.3.8 Phương pháp phân tích phổ IR 39

2.3.9 Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR 40

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 43

3.1 PHÂN LẬP VÀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA GLYCOSAMINOGLYACAN TỪ HẢI SÂM HOLOTHURIA ATRA 43

3.1.1 Phân lập glycosaminoglycan từ hải sâm Holothuria atra 43

3.1.2 Thành phần hóa học của glycosaminoglycan từ hải sâm Holothuria atra 45

3.2 TÁCH PHÂN ĐOẠN VÀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CÁC PHÂN ĐOẠN CỦA GLYCOSAMINOGLYCAN

TỪ HẢI SÂM HOLOTHURIA ATRA 48

3.2.1 Tách phân đoạn glycosaminoglycan từ hải sâm

Holothuria atra 48

3.2.2 Thành phần hóa học của các phân đoạn glycosaminoglycan

từ hải sâm Holothuria atra 50

3.3 ĐẶC ĐIỂM CẤU TRÚC CỦA GLYCOSAMINOGLYCAN TỪ

HẢI SÂM HOLOTHURIA ATRA 55

3.3.1 Đặc điểm cấu trúc của phân đoạn F1 được chiết tách từ glycosaminoglycan của hải sâm Holothuria atra 55

3.3.1.1 Phổ hồng ngoại IR của phân đoạn F1 55

3.3.1.2 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1 H-NMR của phân đoạn F1 56

3.3.1.3 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13 C-NMR của phân đoạn F1 58

3.3.2 Đặc điểm cấu trúc của phân đoạn F2 được chiết tách từ glycosaminoglycan của hải sâm Holothuria atra 59

3.3.1.2 Phổ hồng ngoại IR của phân đoạn F2 59

3.3.2.2 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1 H-NMR của phân đoạn F2 60

3.3.2.4 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13 C-NMR của phân đoạn F2 61

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 63

4.1.KẾT LUẬN 63

4.2 KIẾN NGHỊ 64

TÀI LIỆU THAM KHẢO 65

MỞ ĐẦU

1 LÝ DO CHỌN ĐỀ TÀI:

Trong những năm gần đây, khái niệm về thực phẩm chức năng đã đưa ra một cách tiếp cận mới và thiết thực để có được một sức khỏe tốt đó là khuyến khích sử dụng các sản phẩm thiên nhiên giúp mang lại nhiều lợi ích sinh lý từ

đó làm giảm nguy cơ mắc các bệnh mãn tính khác nhau Hầu hết các thực phẩm chức năng và thuốc hiện nay có nguồn gốc trực tiếp hoặc gián tiếp từ tự nhiên, đặc biệt là các loài thực vật trên cạn và các loài sinh vật dưới biển Điển hình

là các hợp chất glycosaminoglycan (GAG) được phân lập từ động vật biển nói chung và hải sâm nói riêng, còn được gọi là polysaccharide sulfate (PS) là một trong những hợp chất tự nhiên có giá trị cao và đang được nghiên cứu rộng rãi gần đây nhờ sở hữu phổ hoạt tính sinh học rộng như: chống tạo mạch, kháng u, chống đông máu, kháng viêm, chống tăng huyết áp, chống huyết khối, [1, 2]

Glycosaminoglycan từ hải sâm được phân chia thành hai nhóm khác nhau là fucosylated chondroitin sulfate (FCS) và fucan sulfate (FS) FS là một polymer mạch thẳng được cấu tạo bởi gốc fucose và /hoặc fucose (sulfate), FS

từ mỗi loài hải sâm có sự khác biệt chủ yếu về mật độ và vị trí của các nhóm sulfate trong gốc đường fucose [2] FCS là một polymer có mạch nhánh và cấu trúc được tạo nên bởi các đơn vị lặp lại của disaccharide (1→3)-β-D-GalNAc-(1→4)-β-D-Gluc-(1→n) Cấu trúc mạch chính này cũng tương tự như cấu trúc của các chondroitin có nguồn gốc từ động vật có vú, tuy nhiên sự khác biệt độc đáo nhất của FCS hải sâm mà không một loài động vật hay thực vật ở cả trên cạn và dưới biển có được chính là ở cấu trúc mạch nhánh được tạo nên bởi các fucan sulfate ở vị trí C-3 của gốc Glucuronic axit [3] FCS của các loài hải sâm khác nhau được phân biệt dựa vào cấu tạo của mạch nhánh, số mạch nhánh và mức độ sulfate hóa ở mạch nhánh cũng như ở mạch chính [1, 2, 4] Cho tới nay, nhóm các hợp chất GAG đã được nghiên cứu từ nhiều loài hải sâm khác nhau

như Thelenata ananas [5], Peasonnothuria gaefei, Stichopus tremulus, Holothuria vagabunda [6], Cucumaria japonica [7], Apostichopus japonicus, Actinopyga mauritiana [8] Các nghiên cứu này đều cho thấy sự khác biệt về

đặc điểm cấu trúc lẫn hoạt tính sinh học của GAG giữa các loài hải sâm

Ở nước ta mặc dù đã có một số nghiên cứu về các hợp chất có hoạt tính sinh học từ hải sâm, tuy nhiên phần lớn các nghiên cứu này tập trung phân lập, nghiên cứu cấu trúc và hoạt tính sinh học của các hợp chất phân tử lượng thấp, các hợp chất polymer sinh học như GAG từ đối tượng này vẫn còn rất ít được quan tâm nghiên cứu Trong số gần 70 loài hải sâm được phát hiện ở biển Việt

Nam mới chỉ có hai loài Holothuria spinifera và Stichopus variegatus được nghiên cứu về hợp chất GAG [9, 10] Holothuria atra là một trong số các loài

hải sâm tự nhiên có phân bố rất phổ biến ở nước ta, tuy nhiên cho tới nay vẫn chưa có công bố nào nghiên cứu về hợp chất GAG từ hải sâm này.Vì vậy, thực

hiện đề tài “Nghiên cứu chiết tách và phân tích đặc trưng cấu trúc của

glycosaminoglycan từ hải sâm Holothuria atra” là cần thiết, các kết quả

nghiên cứu của đề tài sẽ góp phần làm cơ sở khoa học cho các nghiên cứu tiếp theo về mối tương quan giữa đặc trưng cấu trúc và hoạt tính sinh học nhằm định hướng phát triển và ứng dụng hiệu quả các hoạt chất tự nhiên thành thuốc hoặc thực phẩm chức năng, đóng góp một phần quan trọng vào việc phục vụ sức khỏe cộng đồng và phát triển kinh tế xã hội

2 MỤC ĐÍCH CỦA LUẬN VĂN:

Chiết tách và thu nhận glycosaminoglycan từ hải sâm Holothuria atra Phân tích một số đặc trưng cấu trúc của glycosaminoglycan từ loài hải sâm

Holothuria atra

3 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU:

3.1 Đối tượng nghiên cứu:

Glycosaminoglycan từ hải sâm Holothuria atra

3.2 Phạm vi nghiên cứu:

Hải sâm Holothuria atra thu thập ở vùng biển Nha trang, tỉnh Khánh Hòa

4 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU:

- Chiết tách và thu nhận hợp chất glycosaminoglycan từ hải sâm Holothuria atra

- Phân đoạn tinh chế glycosaminoglycan bằng phương pháp sắc ký

- Xác định thành phần hóa học của các phân đoạn glycosaminoglycan thu nhận được (gồm: tổng carbohydarte, hàm lượng sulfate, hàm lượng uronic axit, hàm lượng protein, thành phần các gốc đường đơn)

- Xác định được một số đặc điểm cấu trúc của phân đoạn glycosaminoglycan

đại diện từ loài hải sâm Holothuria atra

5 Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI

5.1 Ý nghĩa khoa học:

Các kết quả nghiên cứu của đề tài là số liệu khoa học mới về thành phần

hóa học và đặc điểm cấu trúc của glycosaminoglycan được phân lập từ hải sâm Holothuria atra

5.2 Ý nghĩa thực tiễn:

Kết quả nghiên cứu của đề tài tạo cơ sở cho các nghiên cứu tiếp theo, giúp tìm kiếm và phát hiện những hoạt chất mới có giá trị dược dụng cao từ hải sâm, nhằm tạo ra các dược liệu mới phục vụ sức khỏe xã hội và nâng cao giá trị kinh tế của hải sâm

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN

1.1.TỔNG QUAN VỀ HẢI SÂM

1.1.1 Giới thiệu chung về hải sâm

Việc sử dụng hải sâm làm mặt hàng thực phẩm và hàng hóa đã bắt đầu ở Trung quốc khoảng 1000 năm trước, sau đó do nhu cầu về giá trị dinh dưỡng cũng như khả năng chữa một số loại bệnh truyền thống như: cao huyết áp, thấp khớp, hen suyễn, liệt dương, táo bón [4], dẫn đến việc khai thác hải sâm đã

lan rộng ra các nước châu Á Hải sâm là một loại động vật không xương sống

thuộc lớp Holothuroidea, do đó còn được gọi là Holothurian, là một trong năm lớp thuộc ngành động vật Da Gai (Echidermata) Tên khoa học của hải sâm "Cucumis marimus" có nghĩa là "dưa chuột biển" Hải sâm còn được gọi

với những cái tên như đỉa biển, con rum, sâm biển, hải thử, đồn độp, sa tốn,… [11] Lớp hải sâm có khoảng 11 nghìn loài thuộc 5 bộ Ở vùng biển Việt Nam

hiện nay ước tính có khoảng 70 loài hải sâm : Hải sâm trắng (Holothuria scabra); Hải sâm đen (Holothuria vagabunda); Hải sâm vú (Holothuria nobilis); Hải sâm mít (Actinopyga echinites)

Hải sâm có một cơ thể thon dài, cấu tạo chính bên ngoài gồmmiệng nằm

ở mặt bụng, quanh miệng có 20 xúc tu Hậu môn nằm cuối thân Mặt lưng có 2-3 hàng gai thịt lớn dạng hình nón khá dài chạy dọc theo hai đường biên lưng

cơ thể Những chiếc gai thịt dài cũng xuất hiện ở mặt bên và phần rìa bụng Mặt bụng phẳng, có thể thấy rất nhiều chân ống tập trung thành 3 dải, dải ở giữa rộng gấp đôi hai dải bên ngoài Chân ống hình trụ, nhỏ và dài, cuối chân có đĩa bám (Hình 1.1)[12] Hải sâm được tìm thấy trên tất cả các đại dương và biển,

ở tất cả các vĩ độ, nhưng chủ yếu chúng sống ở đáy biển, trên bề mặt hoặc ngay

cả nằm sâu trong các lớp trầm tích, một số loài khác thì lại nằm ở các rạn san

hô, trên các thềm đá cứng Thức ăn của hải sâm là các xác chết của động vật, loài phù du và các chất hữu cơ dưới biển, nên các nhà khoa học còn đặt cho

chúng cái tên là nhân viên vệ sinh biển Một trong những cách hải sâm bắt mồi

là nằm trong sóng và bắt những loài trôi trong đó bằng các xúc tu, nên nhiều khi có thể tìm thấy chúng với số lượng lớn ở cạnh các trang trại nuôi cá biển của con người [13] Hải sâm là động vật phân tính (trừ một số loài thuộc bộ không chân (Apoda)), sinh sản bằng cách phóng tinh trùng và trứng vào nước biển, trứng thụ tinh và phát triển ngoài cơ thể mẹ Tùy vào điều kiện thời tiết, nếu điều kiện thời tiết thuận lợi một cá thể có thể sản xuất hàng ngàn giao tử [14]

Hình 1.1: Hình thái chung bên ngoài của hải sâm [13]

1.1.2 Giới thiệu về hải sâm Holothuria atra

1.1.2.1.Đặc điểm hình thái và sinh sản

Holothuria atra có hình trụ hẹp, toàn bộ bề mặt cơ thể mịn màng và hoàn

toàn đen, một số con ở các rặn san hô thì lại có nếp nhăn ngang trên bề mặt lưng Miệng nằm ở mặt dưới được bao quanh bởi một rìa gồm 20 xúc tu màu đen, phân nhánh, hậu môn ở đầu còn lại Chiều dài tối đa khi trưởng thành vào khoảng 60 cm nhưng khích thước phổ biến là 20 cm Trọng lượng và chiều dài

trung bình của hải sâm Holothuria atra tại các nước trên thế lần lượt là: 200 g

và 20 cm (Ấn Độ), 300 g và 30 cm (Ai Cập), 335 g và 23 cm (Việt Nam), 400

g và 15 cm (Mauritius) [13] H atra là loài ăn tạp, chúng dùng xúc tu tìm kiếm

các mảnh vụn từ xác động vật và các chất hữu cơ khác trong lớp trầm tích Để

chống lại kẻ săn mồi, chúng sẽ phát ra một chất độc màu đỏ qua da khi bị xâm

phạm Mùa sinh sản của H atra chủ yếu là mùa hè và mùa thu, nhưng ở các vùng xích đạo thì chúng có thể sinh sản quanh năm H atra là loài phân tính,

nhưng chúng cũng có thể sinh sản bằng cách phân hạch ( các cá thể sống tự phân chia theo cách co thắt dần dần, sau một thời gian có thể tách ra thành hai

cá thể riêng biệt)

1.1.2.2 Phân bố và môi trường sống

Holothuria atra sống ở các rạn san hô, đầm , bùn cát, trên các lớp đá vụn

và các thảm cỏ biển từ 0 đến 20 cm hoặc ở các khu vực đá vôi trầm tích dưới biển ở Mauritius Màu sắc của chúng làm cho chúng dễ bị nhận ra, chính vì thế chúng hay ngụy trang thêm lớp cát trên lưng, đồng thời để giữ mát cho cơ thể

và tránh tia nắng mặt trời Chúng rất thích các rạn san hô, nơi chúng không phải

tiếp xúc hoàn toàn với sóng nhưng nước lại được sục khí tốt và mát Holothuria atra có khả năng chịu được mức nhiệt ở 390C

Trên thế giới, hải sâm phân bố nhiều ở các nước Trung Quốc, Nhật Bản, Australia, Ấn Độ, Malaysia và vùng biển Đông Phi Ở Việt Nam, hải sâm phân bố chủ yếu ở các vùng biển Quảng Ninh, Hải Phòng, Phú Yên, Khánh Hòa, Vũng Tàu, Phú Quốc, Côn Đảo, Kiên Giang, [15]

Hình 1.2 Hải sâm Holothuria atra

1.1.3 Thành phần hóa học của hải sâm

Thành phần hóa học chủ yếu là protein, lipid, khoáng, các nguyên tố vi lượng quý hiếm Thông qua hàm lượng các chất trên, ta có thể đánh giá được giá trị dinh dưỡng của hải sâm [6] Cũng giống như các loài thuỷ sản khác, hàm lượng các chất hóa học trong cơ thịt hải sâm cũng phụ thuộc vào giống loài, môi trường sống, trạng thái sinh lý, mùa vụ, nguồn thức ăn, thời tiết…

1.1.3.1 Hàm lượng protein và lipit trong hải sâm tại một số vùng biển trên thế giới

Thành phần hóa học tính theo % trọng lượng khô của một số loài hải sâm được thể hiện ở Bảng 1.1 cho ta thấy hải sâm ở các vùng biển trên thế giới thường gặp đều có hàm lượng protein đạt giá trị cao (32,0-65,0%) và hàm lượng lipid thấp (0,1-0,8%)

Protein trong mô hải sâm chứa nhiều thể keo (colagen) và chiếm 40÷60%

tổng số protein, đặc biệt có 1 số loài collagen có thể lên đến 77,5% [15] Hàm lượng protein trong hải sâm rất dễ tiêu hóa nên thích hợp cho người già yếu và suy nhược cơ thể Hàm lượng lipid trong hải sâm thấp nhưng lại chứa các hợp chất đặc biệt như phospholipid, monoglyceride, diglyceride, triglyceride, acid béo no và không no (34 loại acid béo), trong đó acid béo không bão hòa chiếm

ưu thế và các acid béo có nhiều nối đôi chiếm từ 43,1-75,0% gồm: linoleic, arachidoric, eicosatrrienic, eicosapentaenoic là các acid béo không thay thế có hoạt tính sinh học cao và là tiền chất của prostaglandin một loại dược phẩm quý Lipid trong hải sâm có khả năng chữa bệnh xơ cứng động mạch do dư thừa cholesterol Khi tiêm lipid của hải sâm cho thỏ bị bệnh cholesterol thì hàm lượng cholesterol huyết giảm 36,6%; lipoprotein giảm 31,6%; hệ số cholesterol trên phospholipid giảm 14,8% Dưới tác dụng của lipid hải sâm, khả năng làm đông máu tăng đáng kể Một số giả thuyết cho rằng lipid của hải sâm có khả năng tạo este hòa tan cholesterol và đào thải nó qua cơ quan bài tiết Vậy, thịt hải sâm giàu protein và nghèo lipid (nhưng lại chứa các hợp chất có hoạt tính sinh học cao) là một loại thực phẩm thích hợp cho những người bị rối loạn lipid máu và các bệnh lý về động mạch vành Hơn nữa, trong hải sâm có holothurin (trong cơ thịt) có tác dụng ức chế, đình chỉ sự phân bào, lipid hải sâm làm tăng trạng thái trao đổi lipid và protein trong máu, trong gan động vật, tăng cường quá trình oxy hóa khử trong cơ thể và góp phần chống xơ cứng động mạch ở người [8]

Bảng 1.1 Hàm lượng protein và lipit trong hải sâm tại một số vùng

biển trên thế giới[15]

2 Trung Quốc -Nhật Bản 64,0 0,8

3 Ấn Độ Dương-Thái Bình Dương 32,0÷ 52,0 0,5÷ 0,7

5 Nha Trang- Khánh Hòa 40,76÷ 77,54 0,1÷ 0,65

1.1.3.2 Thành phần và hàm lượng khoáng vi lượng của một số loài hải sâm

Thành phần và hàm lượng khoáng vi lượng trong mô cơ của một số loài hải sâm được trình bày ở Bảng 1.2 cho ta thấy trong thịt hải sâm chứa nhiều nguyên tố vi lượng quý hiếm như Se là chất giải độc, làm vô hiệu hóa các kim loại nặng đi vào cơ thể qua đường ăn uống (như chì và thủy ngân) để thải ra nước tiểu

Bảng 1.2 Thành phần khoáng vi lượng của một số loài hải sâm [16]

TT Tên loài

Hàm lượng (g/g trọng lượng khô)

Fe (x10 6 )

Cu (x10 6 )

Mg (x10 6 )

N (x10 6 )

Ngoài các yếu tố protein, lipid, khoáng, nguyên tố vi lượng… trong thành

cơ thể của hải sâm còn chứa một loại hợp chất quý hiếm có giá trị cực kì cao

về mặt dược liệu đó là polysaccharide sulfate (PS) hay glycosaminoglycan (GAG) là một trong những hợp chất có giá trị nhất của hải sâm vì chúng sở hữu những hoạt tính sinh học được đánh giá cao như: chống tạo mạch, kháng u, chống đông máu, kháng viêm, chống tăng huyết áp, chống huyết khối,…[1, 2] Glycosaminoglycan được phân chia thành hai nhóm khác nhau là fucosylated chondroitin sulfate (FCS) và fucan sulfate (FS) FS là một polymer mạch thẳng được cấu tạo bởi gốc fucose và /hoặc fucose (sulfate), FS từ mỗi loài hải sâm

có sự khác biệt chủ yếu về mật độ và vị trí của các nhóm sulfate trong gốc đường FS từ mỗi loài hải sâm có sự khác biệt chủ yếu về mật độ và vị trí của các nhóm sulfate trong gốc đường fucose [2] FCS là một polymer có mạch

nhánh, cấu trúc mạch nhánh của fucosylfated chondroitin sulfate được tạo nên

bởi các đơn vị lặp lại của disaccharide (1→n) Cấu trúc mạch chính này cũng tương tự như cấu trúc của các chondroitin có nguồn gốc từ động vật có vú, tuy nhiên sự khác biệt độc đáo nhất của FCS hải sâm mà không một loài động vật hay thực vật ở cả trên cạn

(1→3)-β-D-GalNAc-(1→4)-β-D-Gluc-và dưới biển có được chính là ở cấu trúc mạch nhánh được tạo nên bởi các fucan sulfate ở vị trí C-3 của gốc Glucuronic axit [3] FCS của các loài hải sâm khác nhau được phân biệt dựa vào cấu tạo của mạch nhánh, số mạch nhánh và mức độ sulfate hóa ở mạch nhánh cũng như ở mạch chính [1, 2, 4]

1.2 TỔNG QUAN VỀ CẤU TRÚC CỦA GLYCOSAMINOGLYCAN

1.2.1 Các nghiên cứu về Fucan sulfate

Nghiên cứu đầu tiên về cấu trúc của Fucan sulfate từ hải sâm được thực hiện bởi Ana - Cristina và cộng sự, nhóm tác giả này đã chiết tách và phân tích

cấu trúc fucan sulfate từ hải sâm Ludwigothurea grisea thu ở vùng biển Brazil,

fucan này được tạo nên bởi gốc đường đơn Fuc(2OSO3-) liên kết 1,3 với gốc

Fuc(2,4OSO3-) [17] Mười năm sau Kariya và cộng sự đã công bố một fucan

sulfate khác từ hải sâm Stichopus japonicus có cấu trúc tương tự với hải sâm Ludwigothurea grisea, chỉ khác nhau về tỉ lệ liên kết giữa các gốc Fuc(2OSO3-

) và gốc Fuc(2,4OSO3-) [18] Kể từ đó tới nay các nghiên cứu về cấu trúc của fucan sulfate từ hải sâm liên tục được công bố, đặc biệt trong vài năm gần đây nhờ các cải tiến về trang thiết bị kỹ thuật sử dụng trong phân tích cấu trúc của các polymer ngày càng hiện đại Cấu trúc của fucan sulfate từ hải sâm

Isostichopus badionotus được Chen và các cộng sự [4] giải thích chi tiết có cấu

tạo từ các đơn vị lặp lại của tetrasaccharide (Hình1.3) Một số fucan sulfate

khác được phân lập từ hải sâm Acaudina molpadioides cũng có cấu trúc gồm

các tetrasaccharide lặp lại tương tự như cấu trúc của fucan sulfate hải sâm

Isostichiopus Badionotus, chỉ khác nhau ở trình tự liên kết của các gốc fucose

sulfat (Hình 1.3)

Hình 1.3 Cấu trúc của Sulfate fucan được phân lập từ các loài hải sâm

Thelenota ananas, Isostichiopus badionotus [19], Acaudina molpadioides và

Stichopus japonicus [18]

Bằng phương pháp phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR ở nhiệt

độ cao, Wu và cộng sự [20] đã xác định và so sánh cấu trúc của fucan từ 4 loài

hải sâm khác nhau gồm Pearsonothuria graeffei, Holothuria vagabunda, Stichopus tremulu và Isostichopus badionotus, kết quả thu được cho thấy fucan sulfate của hải sâm Pearsonothuria graeffei có chứa chủ yếu các gốc 2,4- disulfate và non-sulfate fucose, fucan sulfate của hải sâm Isostichopus badionotus có chứa chủ yếu là các gốc non- sulfate fucose , 2-sulfate fucose và 2-4-disulfate fucose, trái ngược với hai loài trên, hải sâm Stichopus tremulu ở vùng biển lạnh và hải sâm Holothuria vagabunda ở vùng biển nóng (biển nhiệt

đới) có chứa chủ yếu các gốc non-sulfate fucose.Một năm sau đó nhóm tác giả

này đã công bố chi tiết cấu trúc của fucan sulfate từ hải sâm Pearsonothuria graeffei được tạo nên bằng sự lặp lại của tetrasaccaride [19] Năm 2015, Long

và các cộng sự [21] đã công bố một cấu trúc nhánh mới của fucan sulfate (Hình

1.3 D) từ hải sâm Apostichopus japonicus hoàn toàn khác so với cấu trúc của

fucan này đã được công bố trước đó bởi Kariya và cộng sự [18] Sau đó khi

nghiên cứu cấu trúc của sulfate fucan từ hai loài hải sâm Holothuria edulis và Ludwigothurea grise từ tác giả Myron và cộng sự [22] đã công bố rằng cấu

trúc của fucan sulfate từ hai loài hải sâm này cũng có cấu trúc mạch nhánh (Hình 1.4) chứ không phải có cấu trúc mạch thẳng như các công bố trước đó, như vậy có thể thấy cấu trúc của fucan sulfate không chỉ biến đổi theo loài mà còn phụ thuộc vào điều kiện môi trường sống cũng như các kỹ thuật chiết tách

và phân tích khác nhau [23] Trong khi đó, hoạt tính sinh học của glycosaminoglycan nói chung và fucan sulfate nói riêng chịu ảnh hưởng của các đặc trưng cấu trúc, với mỗi biến đổi về cấu trúc có thể dẫn đến những hoạt tính sinh học khác nhau và khả năng úng dụng khác nhau

Hình 1.4 Cấu trúc fucan sulfate từ hải sâm Holothuria edulis và

Ludwigothurea Grise

1.2.2 Các nghiên cứu về fucosylate chondroitin sulfate

Fucosylate chondroitin sulfate (FCS) là một hợp chất đặc biệt chỉ có duy nhất ở hải sâm [20] Về mặt cấu trúc, glycosaminoglycan của hải sâm được tạo nên bởi dạng polysaccharide phổ biến thường thấy ở động vật có vú là chondroitin sulfate , nhưng khác nhau ở vị trí C-3 của gốc uronic axit có tạo mạch nhánh bởi nhóm fucose sulfate, (Hình 1.5)[24] Nhóm fucose sulfate mạch nhánh có khả năng làm nhiệm vụ là tránh sự phân hủy của glycosaminoglycan bởi enzyme chondroitin được sinh ra bởi sinh vật biển, làm tăng mật độ điện tích để thích nghi với điều kiện môi trường biển và đồng thời

có hoạt tính sinh học cao hơn so với các hợp chất tương tự về mặt dược dụng,

ví dụ như hợp chất Heparin [25] nên FCS được nghiên cứu rất nhiều, đặc biệt

là những năm gần đây

Hình 1.5 Cấu trúc minh họa của fucosylated chondroitin sulfate (R: ester

sulfate)

 Sự đa dạng về cấu trúc của Fucosylate chondroitin sulfate (FCS)

Hình 1.6 Cấu trúc của fucosylate chondroitin sulfate

(a) glucuronic acid, Glucuronic Acid (b) N-acetyl- galactosamine, N-Acetyl galactosamine (c) mạch nhánh fucose, α-L-fucose [18]

Dựa vào sự phát triển của các kỹ thuật quang phổ hiện đại, sử dụng phương pháp phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân và phương pháp phân tích methyl hóa đã xác định được cấu trúc phân tử của FCS, nhìn chung gồm 3 thành phần chính là: uronic acid, sulfate, các gốc đường amin, cấu trúc mạch khung thì tương tự như chondroitin sulfate ở động vật có vú (CS), tuy nhiên mạch nhánh fucopyranose được phát hiện có thể gắn ở một vài vị trí khác nhau trên mạch chính (có thể ở gốc D-glucuronic acid hoặc gốc D-galactosamin) Hơn nữa các nhánh fucose này có mô hình sulfate có thể phân biệt được so với mạch

chondroitin sulfate [26] và mô hình sulfate của fucan nhìn chung thường ở vị trí C-2, 3 và 4, mặc dù một số công bố tồn tại kiểu liên kết glycosidic giữa các gốc fucose theo dạng liên kết (1→2, 1→3 hoặc 1→4) và liên kết glycosidic của các fucan này với mạch chính CS có thể ở vị trí C-3 của gốc glucuronic acid Cho tới nay, cấu trúc hóa học ưu thế của vài loài đã nhận biết được mức độ biến đổi cấu trúc bởi sự biến đổi lớn liên quan đến sự sulfat hóa và thành phần nhánh (Hình 1.6) Dựa trên thành phần monosaccharide từ mỗi loài, các tài liệu tham khảo cho thấy hầu hết tỉ lệ giống nhau giữa D-glucoronic acid và D-glucosamine nhưng tỷ lệ của sulfate và fucose có sự thay đổi lớn Theo tác giả Zhao và cộng sự [27] đã nhận định thành phần monosaccharide không chỉ phụ thuộc vào loài khác nhau mà còn bị ảnh hưởng bởi phương pháp chiết tách

Ngoài ra, kết quả nghiên cứu của Chen và cộng sự [19] đã chỉ ra rằng, mùa vụ thu hoạch và môi trường sống có thể ảnh hưởng đến sự thay đổi cấu trúc FSC Bảng 1.3 mô tả tổng hợp về tỷ lệ thành phần monosaccharide theocác tài liệu đã được công bố về FSC các loài hải sâm khác nhau

Bảng 1 3 Thành phần hóa học của FCS được phân lập từ thành tế bào

của một số loài hải sâm [22]

Loài hải sâm Thành phần hóa học (tỉ lệ mol)

1.2.3 Hoạt tính sinh học và ứng dụng của glycosaminoglycan

Hải sâm được xem là món cao lương mỹ vị ở Malaysia, Trung Quốc, Nhật Bản, Indonesia do người ta tin tưởng vào tác dụng chữa bệnh của nó: cao huyết áp, thấp khớp, hen suyễn, liệt dương, táo bón…[11, 25].Người ta thường mua hải sâm khô và nấu cho mềm dưới dạng món súp hoặc món hầm hoặc om

và món hải sâm nhìn giống món thạch nhưng ăn không ngon lắm Trong ẩm thực Nhật Bản, món Konotawa được nấu bằng hải sâm nấu thành cao, ướp muối

và xử lý khô để ăn dần Nhìn chung món ăn chế biến từ hải sâm không ngon lắm, và cũng không thể sử dụng được hết giá trị vốn có của nó

Sau này nhờ sự phát triển của khoa học kỹ thuật các nghiên cứu về hải sâm cho thấy chúng có chứa nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học quý như: các polysaccharide sulfates hóa, saponin, collagen, glycosyl shingolipid, sialic acid, … [26], trong đó được quan tâm nhất chính là các hoạt tính sinh học của các glycosaminoglycan (polysaccharide sulfates) Các glycosaminoglycan của hải sâm có thể được chia thành hai dạng chính là fucan sulfate hóa (FS) hay còn gọi là fucoidan Hải sâm và fucosylated chondroitin sulfate hóa (FSC) [27] Các thành phần này đã và đang thu hút sự quan tâm nghiên cứu nhờ sở hữu nhiều hoạt tính sinh học thú vị như: kháng đông tụ, chống tắc nghẽn mạch máu [27], điều chỉnh sự hình thành mạch máu [28] ức sự di căn của tế bào ung thư [29], kháng tế bào hủy xương và kháng ung thư [27] Trong đó hoạt tính kháng đông tụ là một trong số các hoạt tính được nghiên cứu sâu rộng nhất của các

glycosaminoglycan hải sâm

1.2.3.1 Hoạt tính chống đông tụ máu của FCS

Gần đây, hầu hết các nghiên cứu về hoạt tính sinh học của FCS đã được tập trung vào chống đông máu và chống huyết khối FCS thể hiện tác dụng chống đông máu tuyệt vời thông qua thrombin (FIIa) và ức chế yếu tố Xa (Fxa) qua trung gian antithrombin III (ATIII), và cũng chứng minh rằng trọng lượng phân tử và mức độ sulfate hóa của một FCS tác động lớn đến hoạt tính sinh học

này [30, 31] FCS chiết xuất từ hải sâm Ludwigothurea grisea cho thấy hoạt

tính chống huyết khối rất tốt trên các nhánh fucose sulfate [32] Các hoạt động chống đông máu của FCS với các kiểu sulfate khác nhau cũng đã được điều tra

và nó đã được chứng minh là nhánh fucose 2,4-O-sulfate, là đặc điểm cấu trúc quan trọng cần thiết cho việc chống đông máu và ức chế thrombin Các hoạt

động chống đông máu của hải sâm Holothuria Mecicana trong công trình

nghiên cứu xét nghiệm đông máu huyết tương của Qinying và cộng sự [33], đem so sánh với hoạt tính chống đông tụ máu của Heparin và hải sâm

Isostichopus badionotus [4, 34] Kết quả hiển thị FCS của Holothuria Mecicana có hoạt tính chống đông máu nội tại tương tự như Heparin, nhưng lại yếu hơn của hải sâm I badionotus, là do mật độ sulfate hóa của các nhánh fucosyl ở hải sâm I badionotus cao hơn hải sâm H Mecicana Qua các công

trình nghiên cứu[4, 30, 31, 32, 33, 34], ta có thể thấy FCS là một tiềm năng và

có thể sử dụng để thay thế Heparin trong lĩnh vực chống đông tụ máu Ngoài

ra, các nghiên cứu của Liu và cộng sự [ 30, 35], cũng đã phân lập ra hai phân

đoạn FCS từ hải sâm Cucumaria frondosa và Thelenota anana, và chứng minh

được FSC có tiềm năng trong điều trị ung thư và chống đông tụ máu

1.2.3.2 Hoạt tính tái sinh tế bào

Glycosaminoglycan đóng một vai trò quan trọng trong sự phát triển mô mới của cơ thể vì nó có khả năng liên kết với protein hình thành treoglycans

và các yếu tố tăng trưởng tuần tự, là trung tâm của sự biệt hóa tế bào và chức năng [36] Sự tham gia của chondroitin sulfate (CS) và dermatan sulfate (DS), trong các cơ chế tái tạo của hệ thống thần kinh trung ương, phát triển gan và tái tạo mô liên kết đã thúc đẩy sự quan tâm về glycosaminoglycan trong y học tái sinh [37] Vì hiện tại CS không thể được tổng hợp hóa học, nên các nhà nghiên cứu đã tổng hợp qua các sản phẩm có nguồn gốc tự nhiên thông qua các động vật trên cạn lẫn động vật dưới biển [38, 39] Và công trình nghiên cứu của J Valcarcel và cộng sự [40] đã công bố rằng glycosaminoglycan có trong động vật biển tìm thấy CS có hàm lượng cao hơn trong động vật trên cạn

1.2.3.3 Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định

Theo các nghiên cứu được công bố, glycosaminoglycan của hải sâm [27,

28, 29] cũng như fucoidan của rong biển [41] đều sở hữu những hoạt tính sinh học quý có giá trị dược học cao Trong đó, fucoidan của rong biển đã được chứng minh là có hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định mạnh [42], nhưng ở hải sâm lại chưa có công bố nào Sau đó, vào năm 2017, đã có công trình nghiên

cứu công bố về hoạt tính này ở 5 mẫu hải sâm Stichopus variegatus, Holothuria spinifera, H atra, P.graeffei, B argus [43], kết quả thu nhận được rằng chỉ có

2 phân đoạn F3- S variegatus và F3- H spinifera có thấy sự kháng lại các

chủng gây bệnh với đường kính vòng vô khuẩn là từ 10 – 11 mm trên hai chủng

vi khuẩn bệnh là B cereus và S aureus, đây đều là hai chuẩn vi khuẩn gram

âm Đặc biệt hai phân đoạn F3- S variegatus và F3- H spinifera đều là các

phân đoạn fucan sulfate hóa cao với hàm lượng sulfate lần lượt là 38,60% và 32,92%, kết quả này có thể liên quan đến vai trò của nhóm sulfate với hoạt tính kháng khuẩn của hai phân đoạn glycosaminoglycan này Như vậy, glycosaminoglycan của hải sâm cũng có thể được coi như là một chất kháng sinh tiềm năng mới và cần được nghiên cứu sâu hơn

1.2.2.4 Hoạt tính gây độc tế bào ung thư

Theo các công trình nghiên cứu đã công bố [29, 18], glycosaminoglycan của hải sâm có phổ hoạt tính sinh học rất đa dạng, đặc biệt là hoạt tính kháng ung thư, do vậy nhóm polymer đã trở thành đề tài thu hút được sự quan tâm nghiên cứu của rất nhiều nhà khoa học trên thế giới nhằm tìm kiếm các nguồn dược liệu mới Theo báo cáo nghiên cứu của tác giả Thịnh và cộng sự [43], thử

nghiệm các phân đoạn có hàm lượng sulfate cao của 3 mẫu hải sâm S variegatus, H spinifera, B argus để tiến hành thử nghiệm thăm dò hoạt tính

gây độc tế bào ung thư người trên hai dòng tế bào ung thư là ung thư phổi 1) và ung thư gan (Hep-G2) Chất đối chứng dương được sử dụng ở thí nghiệm này là DMSO (Dimethyl sulfoxide) Kết quả thí nghiệm cho thấy chỉ có 2 mẫu

(LU-F3 - H spinifera và (LU-F3 – B argus có hoạt tính gây độc tế bào ung thư, trong

đó mẫu F3 – B argus có hoạt tính gây độc tế bào rất tốt trên 02 dòng tế bào

ung thư phổi (LU-1) và ung thư gan (Hep-G2) với tỷ lệ gây độc tế bào là 78,22%

(LU-1), 71,05% (Hep-G2) Phân đoạn F3 - H spinifera chỉ có hoạt tính gây

độc tế bào ung thư gan (Hep-G2) với tỷ lệ gây độc là 53,15% Đặc biệt là 2

phân đoạn F3 - H spinifera và F3 – B.argus đều là phân đoạn của fucan sulfate Bên cạnh đó phân đoạn F3 - H spinifera vừa có hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định và gây độc tế bào gan, F3 – B.argus chỉ có hoạt tính rất tốt với gây

độc tế bào ung thư phổi và gan Điều này cho thấy cơ chế sinh học của các glycosaminoglycan từ hải sâm rất khác nhau, có thể có hoạt tính tốt với dòng

tế bào ung thư này, nhưng lại không có hoạt tính với dòng ung thư khác, đó là

do sự khác nhau về đặc trưng cấu trúc Theo những công trình nghiên cứu khác của Kariya và cộng sự [18], hai phân đoạn fucan sulfate được phân lập từ loài

hải sâm Stichoupus japonicus đều có khả năng ức chế tế bào hủy xương tới

99,8% và 96,3% sự hình thành của tế bào hủy xương Tác giả Su và cộng sự [44] vào năm 2011 đã công bố hai phân đoạn glycosaminoglycan được phân

lập từ hải sâm Acaudina leucoptoct có hoạt tính ức chế sự hình thành của tế bào

ung thư S180

1.3 LỊCH SỬ NGHIÊN CỨU TRÊN THẾ GIỚI VÀ Ở VIỆT NAM VỀ GLYCOSAMINOGLYCAN TỪ HẢI SÂM

1.3.1 Lịch sử nghiên cứu trên thế giới

Vào năm 1984, Vaseur là nhà nghiên cứu đầu tiên về hoạt chất polysaccharide sulfates ở động vật biển không xương [23] Nhưng mãi tới năm

1987, cấu trúc của các Fucan sulfate mới được nghiên cứu [3] Sau đó các nghiên cứu về cấu trúc của polysaccharide sulfates, đặc biệt ở hải sâm (GAG) được tăng lên đáng kể trong hai thập kỷ qua Alves và các cộng sự [45] đã công

bố cấu trúc và hoạt tính sinh học của các polysaccharide sulfates từ hai loài hải

sâm Isostichopus badionotus và Ludwigothurea grisea Trái ngược với cấu trúc

phức tạp và dị thể của fucoidan từ rong nâu [4, 46], polysaccharide sulfates từ động vật không xương sống biển có cấu trúc đồng nhất, mạch thẳng và lặp lại với chỉ từ 1-, 3- hoặc 4- đơn vị đường Trong đó kiểu liên kết glycosid và mô hình sulfates là thống nhất và không thay đổi Tuy nhiên, mỗi loài đều có một cấu trúc fucan sulfates hóa riêng biệt, các cấu trúc khác nhau ở vị trí liên kết giữa các gốc fucose và mức độ cũng như vị trí sulfates trên các gốc đường Thành phần chủ yếu của polysaccharide sulfates từ hải sâm là L-fucose và các nhóm este sulfates, các polysaccharides này là một trong những hợp chất có hoạt tính sinh học mạnh nhất của hải sâm Chen và các cộng sự [19] đã công

bố các nghiên cứu về cấu trúc và hoạt tính kháng đông tụ của fucan sulfates từ

các loài hải sâm Isostichopus badionotus và L grisea Kariya và cộng sự [18]

đã phân lập được hai loại fucan sulfates từ hải sâm Sichopus japonicus nghiên

cứu đặc điểm cấu trúc và hoạt tính ức chế tế bào hủy xương Gần đây, nhóm tác giả Long Yu và cộng sự [21] đã công bố các kết quả hoạt tính kháng ung

thư dạ dày của fucan sulfates được phân lập từ loài hải sâm Acaudina

molpadioides

Như trên ta có thể thấy, các polysaccharide sulfates từ hải sâm sở hữu nhiều hoạt tính sinh học quý Hoạt tính sinh học của polysaccharide có mối quan hệ chặt chẽ với cấu trúc của chúng Do vậy, việc phân tích cấu trúc

polysaccharide có ý nghĩa vô cùng quan trọng giúp giải thích cơ chế các

tương tác sinh học và thúc đẩy nhanh chóng đưa vào ứng dụng trong thực tiễn [21] Cho đến nay polysaccharide sulfates (fucoidan) từ hơn 20 loài rong nâu khác nhau đã được nghiên cứu cấu trúc và phát triển thành các thực phẩm chức năng thương mại Tuy nhiên, mới chỉ có polysaccharide sulfates

(glycosaminoglycan) từ 4 loài hải sâm được nghiên cứu cấu trúc cho tới ngày nay

1.3.2 Lịch sử nghiên cứu tại Việt Nam

Bởi đặc thù nước ta nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới và cận nhiệt, địa hình phía đông giáp với Vịnh Bắc Bộ và biển Đông, nên nguồn tài nguyên sinh vật biển hết sức phong phú và đa đạng (11.000 loài sinh vật thủy sinh, 1.300 loài sinh vật trên đảo, cùng vô số loài chủng vi sinh vật ).Tuy vậy, việc nghiên cứu sinh vật nhiệt đới biển của Việt Nam cho đến nay vẫn chủ yếu theo định hướng giá trị thực phẩm, dinh dưỡng và xuất khẩu, việc nghiên cứu, khai thác,

sử dụng hợp lý nguồn tài nguyên thiên nhiên sinh vật để tạo ra các sản phẩm

có giá trị cao phục vụ cuộc sống còn hạn chế chưa tương xứng với tiềm năng của biển Việt Nam Các nghiên cứu về hợp chất thiên nhiên từ sinh vật biển ở Việt Nam mặc dù đã bắt đầu từ những thập niên 60 của thế kỷ 20, nhưng từ đó cho tới nay không có nhiều công trình liên quan được công bố Các nghiên cứu hầu hết tập trung vào xác định thành phần hóa học và hàm lượng của các nhóm hợp chất lipit, protein, các nguyên tố đa-vi lượng, các nhóm chất độc tố biển Các nghiên cứu sâu hơn về hóa học và hoạt tính sinh học của các hợp chất thiên nhiên biển chỉ mới được bắt đầu khoảng 10 năm trở lại đây chủ yếu được thực

hiện bởi các nhà khoa học thuộc Viện Hóa sinh biển, Viện Hóa học các Hợp chất thiên nhiên và một số viện khác thuộc Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam Trong tuyển tập cụm công trình “Khai thác sử dụng hợp lý nguồn tài nguyên thiên nhiên sinh vật Biển Việt Nam nhằm tạo ra các sản phẩm

có giá trị phục vụ cuộc sống” do các nhà khoa học thuộc Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam (gồm các Viện Hóa sinh biển, Viện Hóa học các Hợp chất thiên nhiên, Viện Nghiên cứu và Ứng dụng công nghệ Nha Trang, Viện Tài nguyên Môi trường Biển Hải phòng) thực hiện, đã công bố các kết quả nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của các hợp chất thiên nhiên từ 5

đối tượng sinh vật biển chọn lọc (gồm: hải miên cành Haliclona sp1., bọt biển xốp đen Icrinia echinata, Cầu gai Diadema setosum, hải sâm Holothuria vagabunda và Holothuria scabra) Các tác giả đã tách chiết xác định được cấu

trúc 30 chất sạch (có 4 chất mới lần đầu tiên được phân lập từ thiên nhiên) cùng những kết quả thử nghiệm hoạt tính sinh học cho thấy một số chất sạch có hoạt tính chống ung thư và kháng sinh rất cao Trong số tất cả các nhóm hợp chất đã

và đang nghiên cứu từ sinh vật biển, thì hầu như chưa có bất kỳ nghiên cứu nào thực hiện với nhóm các hoạt chất polysaccharide sulfates hóa từ đối tượng này, mặc dù chúng sở hữu hoạt tính kháng động tụ và kháng ung thư rất mạnh [23]

Ở nước ta, nhóm hoạt chất polysaccharide sulfates từ tài nguyên biển mới chỉ được nghiên cứu trên đối tượng thực vật biển, cụ thể là các loài rong biển trong khoảng 10 năm trở lại đây [47] Trong khi đó, vẫn còn rất ít nghiên cứu về polysaccharide sulfate từ hải sâm nói riêng cũng như động vật thân mềm biển nói chung, mặc dù đây là nhóm chất có hoạt tính kháng đông tụ máu và kháng ung thư mạnh với tiềm năng rất lớn để phát triển thành các nguồn dược liệu và

thuốc mới

Tóm lại, từ việc phân tích tổng quan tình hình nghiên cứu ở nước ngoài

và trong nước, đề tài: “Nghiên cứu chiết tách và phân tích đặc trưng cấu

trúc của glycosaminoglycan từ hải sâm Holothuria atra” được đề xuất thực

hiện nhằm đóng góp thêm các nghiên cứu về glycosaminoglycan từ sinh vật biển nói chung và từ hải sâm nói riêng, theo hướng nghiên cứu các hợp chất mới có hoạt tính sinh học ứng dụng làm thực phẩm bổ dưỡng và thực phẩm bảo

vệ sức khỏe từ nguồn tài nguyên biển

CHƯƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 VẬT LIỆU VÀ ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu của đề tài là nhóm hợp chất glycosaminoglycan (hay còn được gọi là polysaccharide sulfate) được chiết tách từ Hải sâm

Holothuria atra thu ở biển Nha trang Hải sâm Holothuria atra được thu tại

vùng biển Nha trang vào thời điểm tháng 12 năm 2018, mẫu được thu một cách ngẫy nhiên bằng phương pháp lặn bắt bằng tay, mẫu sau khi bắt được giữ trong nước biển sử dụng các thùng xốp có nắp đậy để vận chuyển về phòng thí nghiệm Mẫu hải sâm được phân loại bởi Thạc sĩ Nguyễn Thị Mỹ Ngân, chuyên gia phân loại động vật biển không xương sống thuộc Viện Hải Dương Học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

Hình 2.1 Hải sâm Holothuria atra đã được xử lý mẫu

2.1.2 Dụng cụ - Thiết bị - Hóa chất

2.1.2.1 Dụng cụ

Các dụng cụ dùng trong thí nghiệm như: ống nghiệm, bình tam giác, cốc thủy tinh, ống đông, pipet, cuvet, ống ly tâm…

2.1.2.2 Thiết bị

Các thiết bị chính sử dụng trong nghiên cứu bao gồm:

 Máy sắc ký trao đổi anion hiệu năng cao HPEAC Dionex ICS-3000 (Thermo, Mỹ)

 Máy phân tích thành phần cacbonhydrat: Biotronik (Durrum-X4-20; 0,63x30 cm; 60oC; bicinchoninate method; Shimadzu C-R2AX detector

 Máy phân tích phổ 1H-NMR, 13C-NMR: Bruker WM-500

 LC/MS iontrap 1100 AGILENT

 Thiết bị phân tích phổ hồng ngoại: NICOLET IMPACT-410FT-IR SPECPTROMETER

 Máy li tâm siêu tốc: eppendorf, Centrifuge 8504 R

 Máy đông khô: LyoQuest Plus ECO 50 (Telstar, Spain)

 Máy sấy chân không: FRANCE-ETUVE

 Máy cô quay chân không: Heidolph-Laboratory 4003-digital

 Màng siêu lọc MWCO 10kDa, VIVAFLOW 200

 Máy đo quang: SHIMAZDU UV-VIS 1601PC SPECTROMETER

 Máy xay đa năng QE-1000: xuất xứ Trung Quốc, điện áp 220V/ 50Hz, công suất 2400W, tốc độ quay 28000 r.p.m

2.1.2.3 Hóa chất

Các hóa chất tinh khiết sử dụng của hãng Sigma bao gồm: L-Cystein, Acetyl galactosamin, N-Acetyl glucosamin, Glucuronic acid, D-Galactose, L-Fucose, D-Glucose, D-glucuronic acid EDTA, CH3COONa, CH3COOH, NaHB4, NH4OH, Na2SO4, K2SO4, NaOH, TCA (Tricloacetic acid), Gelatin, BaCl2, TFA (Trifluoroacetic acid), nhựa trao đổi ion DEAE-Sepharose Fast Flow, màng thẩm tách kích thước 10 kDa

N-Các hóa chất công nghiệp khác gồm: Enzyme Papain có xuất xứ Ấn Độ,

hoạt độ 50.000 UI/gam; cồn thực phẩm (Ethanol 98%); Aceton (TQ-Trung Quốc); HCl (TQ); NaCl (TQ); H2SO4(TQ); NaOH (TQ)

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1 Phương pháp chiết tách và phân đoạn glycosaminoglycan từ hải sâm

2.2.1.1 Phương pháp chiết tách glycosaminoglycan

Phương pháp chiết tách glycosaminoglycan từ hải sâm được thực hiện dựa theo phương pháp của (X Dong và cs, 2014) [1] Phương pháp chiết tách glycosaminoglycan được thực hiện như sơ đồ hình 2.2

Hình 2.2 Quy trình chiết tách glycosaminoglycan từ hải sâm Holothuria atra

Xử lý hóa học

Bất hoạt enzyme

Chiết với các điều kiện thích hơp nhất: pH =6, nhiệt độ 55 C, tỷ lệ DM/NL 40/1, thời gian 24

giờ

Ly tâm

 Ngâm chiết với EtOH 98%, trong vòng 5-7 ngày, tỷ lệ cồn/hải sâm:

3 lít/1kg

 Sau đó chiết với Aceton trong vòng 24h, tỷ lệ aceton/khối lượng hải sâm: 2 lít/1kg

 Ngâm chiết trong điều Hải sâm tươi

Bã

Tủa

amonium bromide (cetavlon) 10%

Hexadecyltrimethyl-Ly tâm Dịch

Hòa tan Tủa 2N NaCl/EtOH 20%

Ly tâm +rửa muối

Cồn 85%

Dịch

Sấy Nội tạng, tạp

chất

2.2.1.2 Phương pháp tách phân đoạn glycosaminoglycan

GAG từ hải sâm được tiến hành tách phân đoạn tinh chế theo phương pháp

sử dụng cột sắc ký trao đổi anion trên cột DEAE-Sepharose Fast Flow [49]

Hình 2.3 Phân đoạn tinh chế các glycosaminoglycan bằng

sắc ký trao đổi anion

2.2.2 Các phương pháp phân tích thành phần hóa học của

glycosaminoglycan

2.2.2.1 Phương pháp xác định hàm lượng tổng carbohydrate

Phân tích hàm lượng tổng carbohydrate: Hàm lượng đường tổng được

xác định bằng phương pháp phenol-axít sulfuric [50] Dung dịch chuẩn được

Chuẩn bị cột tách

(cột sắc ký trao đổi anion)

Chuẩn bị dung dịch glycosaminoglycan

Chạy mẫu lên cột

Chạy thẩm tách

Cô đặc Thu phân đoạn

Bột glycosaminoglycan Đông khô

sử dụng là glucose với các nồng độ khác nhau từ 25 -200𝜇𝑔/𝑚𝑙

2.2.2.2 Phương pháp xác định hàm lượng sulfate

Hàm lượng sulfate được phân tích bằng phương pháp đo độ đục với BaCl2/gelatin, sử dụng K2SO4 làm chất chuẩn [51] Dung dịch chuẩn được sử dụng là K2SO4 với các nồng độ từ khác nhau từ 100 – 1000µg/ml

2.2.2.3 Phương pháp xác định hàm lượng uronic axít

Hàm lượng uronic axít được xác định sử dụng phương pháp Carbazole [10] Dung dịch chuẩn được sử dụng là D-glucuronic axit với các nồng độ khác nhau từ 10 – 50µg/ml

2.2.2.4 Phương pháp xác định hàm lượng protein

Hàm lượng protein được xác định theo phương pháp của Lowry [52] Dung dịch chuẩn được sử dụng là Albumin huyết thanh bò (BSA – Bovine serium albumin) với các nồng độ khác nhau từ 40 – 200 µg/ml

2.2.2.5 Phương pháp xác định thành phần monosaccharide

Thành phần đường đơn được xác định bằng phương pháp HPLC, sau khi glycosaminoglycan được thủy phân axít về các monomer Các đường đơn fucose, glucose, galactose, mannose, xylose, rhamnose được sử dụng làm chất chuẩn [53]

2.2.2.6 Sắc ký thẩm thấu gel (GPC)

Khối lượng phân tử trung bình của glycosaminoglycan xác định bằng phương pháp sắc ký thẩm thấu gel (Gel Permeation Chromatography - GPC) Phép đo GPC được thực hiện trên thiết bị HPLC Agilent 1100, với cột Shodex SB-806HQ và detector RID (refractive index detector) tại Trường Đại học Khoa học tự nhiên, Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh Nhiệt độ của cột được giữ ở 600C Glycosaminoglycan nồng độ 1mg/ml Thể tích mẫu bơm

là 0,5ml với tốc độ 1,0ml/phút Dung dịch NaCl (1mg/ml) được sử dụng làm chất rửa giải [54]

2.2.2.7 Phương pháp phổ hồng ngoại IR

Mẫu glycosaminoglycan được ép viên với KBr theo tỉ lệ 10 mg mẫu/20

mg KBr Phổ hồng ngoại FT-IR của glycosaminoglycan được ghi trên máy Carl Zeiss IR-75 spectrometer (đo tại Viện Hóa sinh Hữu cơ Thái Bình Dương

- Viện Hàn lâm Khoa học Nga - Chi nhánh Viễn Đông, L.B.Nga), trong vùng

số sóng 4000-400 cm-1 [6] Dựa vào phổ IR trong vùng từ 800 đến 1732 cm-1

ta có thể xác định được các nhóm sulfate trong các phân tử đường nằm ở vị trí axial hay equatorial [55, 56]

2.2.2.8 Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR và 13C-NMR được ghi trên máy Brucker Advance DPX- 500 NMR spectrometer (Đức) (đo tại Viện Hóa sinh Hữu cơ Thái Bình Dương - Viện Hàn lâm Khoa học Nga - Chi nhánh Viễn Đông, L.B.Nga và Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam) Mẫu glycosaminoglycan được pha trong D2O với nồng độ 20 μg/ml,

đo ở tần số 75,5 MHz tại nhiệt độ 350C

2.3 THỰC NGHIỆM

2.3.1 Chiết tách và phân đoạn glycosaminoglycan từ hải sâm

Holothuria atra

2.3.1.1 Xử lý mẫu

Hải sâm tươi mổ bụng, loại bỏ nội tạng, phần thịt được rửa sạch với nước

và axit axetic 0,1N để loại bớt mùi, cắt nhỏ Tiếp theo, ngâm chiết phần thịt hải sâm đã làm sạch với cồn 98%và 5ml HCHO, trong vòng 5-7 ngày ở nhiệt

độ phòng, tỷ lệ cồn/khối lượng hải sâm: 3/1 (v/v) để xử lý loại chất béo và các hợp chất màu Lọc tách dịch chiết cồn ( được lưu giữ lại sử dụng cho các nghiên

cứu khác), phần thịt hải sâm được chiết tiếp với cồn 96% ở nhiệt độ 600C trong thời gian 5 giờ, dịch chiết được lọc tách, phần thịt được ngâm chiết qua đêm với aceton ở nhiệt độ phòng Sau khi lọc tách dịch chiết aceton, phần thịt hải sâm được phơi khô tự nhiên trong không khí ở nhiệt độ phòng Bỏ vào hộp có nắp đậy để bảo quản

2.3.1.2 Chiết tách glycosaminoglycan

Hải sâm sau khi phơi khô tiến hành thủy phân trong 500ml dung dịch NaOH 0.5 N trong 4 giờ ở nhiệt độ 60oC, sau đó được hiệu chỉnh về pH = 6 bằng dung dịch CH3COOH 0.5 N Sau thủy phân ta có được hỗn hợp dịch sệt Dịch sệt chiết với hỗn hợp (3,5g enzyme papain và 5mM L.Cysteine, 5mM EDTA), sấy ở nhiệt độ 600C trong 24h Hỗn hợp chiết sau đó được đun sôi khoảng 10 - 15 phút để bất hoạt enzyme, tiến hành lọc qua màng vải sạch tinh khiết, giấy lọc Tiếp đó cho ly tâm với cồn (3 lần: 75 độ, lần cuối cồn 96 %), thu dịch, loại bỏ cặn Dịch chiết sau khi ly tâm được cô quay chân không đến còn ¼ thể tích ban đầu (100 ml), cho thêm từ từ 10 ml Cetavlon 10% vào, khuấy trộn đều để tạo kết tủa glycosaminoglycan cho đến khi dung dịch trở nên trong suốt, kết tủa để lắng qua đêm ở 40C Tiếp tục đem hỗn hợp ly tâm với cồn 20% tốc độ 7000 vòng/phút, thời gian 10 phút, nhiệt độ 10 C, thu lấy kết tủa Hòa tan tủa (phức polysaccharide-cetavlon) với dung dịch 500 ml dung dịch [NaCl 2N/ Ethanol = 100 : 15 (v/v), tiếp theo thêm vào 4 – 5 lần thể tích Ethanol 96%

để kết tủa polysaccharide sulfate hóa, để yên trong vòng 24 h.Tiến hành gạn lọc, ly tâm với cồn 75% để loại dần muối ra khỏi polysaccharides (7000/phút,

10oC, 10 phút), thu được tủa polysaccharides Tủa polysaccharides được hòa tan với nước cất và đem đi thẩm tách 3 ngày bằng nước máy chạy nước nhỏ giọt, 1 ngày trong nước cất Thu dịch và cô quay chân không để thu được bột polysaccharides sulfate thô hay glycosaminoglycan thô