luận văn thạc sĩ đặc điểm nhiễm và sự nhạy cảm của ký sinh trùng sốt rét plasmodium vivax với một số thuốc điều trị tại huyện krông pa tỉnh gia lai

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ --- Nguyễn Thị Thu Hiền ĐẶC ĐIỂM NHIỄM VÀ SỰ NHẠY CẢM KÝ SINH TRÙNG SỐT RÉT Plasmodi

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC

VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

-

Nguyễn Thị Thu Hiền

ĐẶC ĐIỂM NHIỄM VÀ SỰ NHẠY CẢM KÝ SINH TRÙNG

SỐT RÉT Plasmodium vivax VỚI MỘT SỐ THUỐC ĐIỀU TRỊ

TẠI HUYỆN KRÔNG PA, TỈNH GIA LAI

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Hà Nội – 2019

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC

VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

-

Nguyễn Thị Thu Hiền

ĐẶC ĐIỂM NHIỄM VÀ SỰ NHẠY CẢM KÝ SINH TRÙNG

SỐT RÉT Plasmodium vivax VỚI MỘT SỐ THUỐC ĐIỀU TRỊ

TẠI HUYỆN KRÔNG PA, TỈNH GIA LAI

Chuyên ngành: Động vật học

Mã số: 8420103

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC TS.BS Nguyễn Vân Hồng

Hà Nội – 2019

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan luận văn của tôi là công trình nghiên cứu của tác giả GS.TS Anna Rosanas - Urgell, PGS.TS Bùi Quang Phúc, TS Nguyễn Vân Hồng và TS Eduard Rovita - Vallbona, trong đó tôi là cộng sự của công trình này Các số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực Trong thời gian nghiên cứu tôi luôn chấp hành đúng quy định về y đức Nếu có gì sai sót tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm

Học viên

Nguyễn Thị Thu Hiền

LỜI CẢM ƠN

Trước hết tôi, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS.BS Nguyễn Vân Hồng, người thầy đã tận tâm động viên và trực tiếp giúp đỡ, hướng dẫn tôi trong suốt quá trình học tập nghiên cứu và hoàn thành luận văn này

Tôi xin trân trọng cảm ơn các thầy, cô giáo của Học viện Khoa học và công nghệ đã giảng dạy hướng dẫn tôi trong quá trình học tập tại đây

Tôi xin trân trọng cảm ơn Lãnh đạo Viện sốt rét - Ký sinh trùng - Côn trùng Trung ương đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi được học tập và nghiên cứu nâng cao trình độ Tôi cũng xin trân trọng cảm ơn sự ủng hộ, giúp đỡ quý báu của tập thể Lãnh đạo và các đồng nghiệp khoa Nghiên cứu điều trị sốt rét, Viện sốt rét - Ký sinh trùng - Côn trùng Trung ương, Viện Y học Nhiệt đới Antwerp, Bỉ đã tạo điều kiện tốt nhất trong thời gian tôi học tập, triển khai nghiên cứu và hoàn thành luận văn của tôi

Tôi cũng xin được cảm ơn đến các Quý cơ quan y tế địa phương nơi tôi tham gia nghiên cứu, đã ủng hộ và tạo điều kiện để tôi có được số liệu nghiên cứu

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè đã ủng

hộ, động viên tôi trong suốt quá trình học tập, làm việc và nghiên cứu

Hà Nội, ngày tháng năm 2019

Học viên

Nguyễn Thị Thu Hiền

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

ACTs Artemisinin based

Combination Therapies

Phối hợp thuốc điều trị sốt rét có artenmisinin hoặc dẫn chất của artemisinin

ACPR Adequate Clinical and

Parasitological Response

Đáp ứng lâm sàng và ký sinh

trùng đủ BMM Blood Medium Mixed Môi trường nuôi cấy

DHA Dihydroartemisinin Dihydroartemisinin

ETF Early Treatment Failure Thất bại điều trị sớm

FCT Fever clearance time Thời gian cắt sốt

iRBC Infected red blood cell Cặn hồng cầu nhiễm

IC50 Inhibitory Concentration Nồng độ ức chế 50% sự phát

triển của KST

LTF Late Treatment Failure Thất bại điều trị muộn

LCF Late Clinical Failure Thất bại lâm sàng muộn

Chữ viết tắt Tiếng Anh Tiếng Việt

Malariology, Parasitology

and Entomology

Côn trùng Trung ương

P falciparum Plasmodium falciparum Plasmodium falciparum

TES Therapeutic efficacy study Nghiên cứu hiệu lực điều trị

WWARN WorldWide Antimalarial

Resistance Network

Mạng lưới kháng thuốc sốt rét toàn cầu

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1 Đặc điểm nhiễm của từng loài Plasmodium pps trên người 3

Bảng 2 Cỡ mẫu tối thiểu dựa trên tỷ lệ thất bại lâm sàng 23

Bảng 3.1 Tình hình bệnh nhân SR 34

Bảng 3.2 Phân bố theo xã của bệnh nhân SR có KST dương tính 36

Bảng 3.3 Một số đặc điểm dân số học của nhóm bệnh nhân tham gia nghiên cứu 38

Bảng 3.4 Một số triệu chứng lâm sàng thường gặp của bệnh nhân SR do P vivax (thời điểm D0) 39

Bảng 3.5 Phân loại đáp ứng điều trị CQ đối với P vivax 46

Bảng 3.6 So sánh giá trị IC50 giữa 2 nhóm bệnh nhân được điều trị khỏi và nhóm bệnh nhân có tái phát KST 54

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Chu kỳ sinh học của KSTSR [6] 6

Hình 1.2 Diễn biến số mắc SR tại Việt Nam năm 2009 - 2018 8

Hình 1.3 Bản đồ P vivax kháng thuốc CQ 13

Hình 3.1 Tỷ lệ bệnh nhân còn sốt sau điều trị 42

Hình 3.2 Tỷ lệ bệnh nhân còn KST sau điều trị 44

Hình 3.3 Tỷ lệ ức chế sự tạo thành thể phân liệt của QN 50

Hình 3.4 Tỷ lệ ức chế sự tạo thành thể phân liệt của DHA 51

Hình 3.5 Tỷ lệ ức chế sự tạo thành thể phân liệt của CQ 52

Hình 3.6 Tỷ lệ ức chế sự tạo thành thể phân liệt của PQ 53

Hình 3.7 IC50 trung bình của thuốc SR đối với P vivax tại Gia Lai 56

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 VÀI NÉT VỀ BỆNH SỐT RÉT 3

1.1.1 Định nghĩa bệnh sốt rét 3

1.1.2 Ký sinh trùng sốt rét gây bệnh trên người 3

1.1.3 Chu kì phát triển của ký sinh trùng sốt rét 4

1.2 TÌNH HÌNH MẮC SỐT RÉT TRÊN THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM 6

1.2.1 Tình hình mắc sốt rét trên thế giới 6

1.2.2 Tình hình mắc sốt rét ở Việt Nam 8

1.3 ĐỊNH NGHĨA KSTSR KHÁNG THUỐC VÀ CÁC YẾU TỐ LIÊN QUAN 9

1.4 NGUYÊN NHÂN SỰ PHÁT SINH VÀ PHÁT TRIỂN KSTSR KHÁNG THUỐC 10

1.5 TÌNH HÌNH KSTSR P VIVAX GIẢM NHẠY CẢM VỚI THUỐC ĐIỀU TRỊ 11

1.5.1 Tình hình KSTSR P vivax kháng thuốc trên thế giới 11

1.5.2 Tình hình KSTSR P vivax giảm nhạy cảm với thuốc điều trị tại Việt Nam 15

1.6 CHẨN ĐOÁN VÀ ĐIỀU TRỊ BỆNH SỐT RÉT 16

1.6.1 Lâm sàng 16

1.6.2 Các phương pháp chẩn đoán 17

1.6.3 Điều trị 18

1.7 CÁC KỸ THUẬT ĐÁNH GIÁ SỰ NHẠY CẢM CỦA KSTSR VỚI THUỐC ĐIỀU TRỊ 18

1.7.1 Kỹ thuật in vivo 19

1.7.2 Kỹ thuật in vitro 20

CHƯƠNG 2 NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN

CỨU 22

2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU 22

2.1.1 Thử nghiệm in vivo 22

2.1.2 Thử nghiệm invitro 22

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22

2.2.1 Đối tượng nghiên cứu 22

2.2.2 Địa điểm nghiên cứu 22

2.2.3 Thời gian nghiên cứu 22

2.2.4 Thiết kế nghiên cứu 23

2.2.5 Cỡ mẫu nghiên cứu 23

2.2.6 Các kỹ thuật ứng dụng trong nghiên cứu 24

2.2.7 Những chỉ số đánh giá 31

2.2.8 Phân tích kết quả ngiên cứu……… ………32

2.2.9 Đạo đức trong nghiên cứu 33

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 34

3.1 TÌNH HÌNH KSTSR TẠI MỘT SỐ XÃ THUỘC HUYỆN KRÔNG PA, GIA LAI NĂM 2015 - 2016 34

3.1.1 Đặc điểm về bệnh nhân đến khám trong thời gian nghiên cứu 34

3.1.2 Đặc điểm phân bố KSTSR tại một số xã thuộc huyện Krông Pa, Gia Lai 36

3.1.3 Đặc điểm nhiễm P vivax ở bệnh nhân tham gia nghiên cứu 37

3.1.4 Đặc điểm KSTSR trên bệnh nhân nhiễm P vivax 41

3.2 HIỆU LỰC ĐIỀU TRỊ CỦA CQ TRÊN BỆNH NHÂN SR DO P VIVAX (IN VIVO) 42

3.2.1 Thời gian cắt sốt và sạch KST P vivax 42

3.2.2 Hiệu lực phác đồ chloroquin 3 ngày đối với SR P vivax tại một số xã thuộc huyện Krông Pa, Gia Lai 46

3.3 ĐÁNH GIÁ SỰ NHẠY CẢM CỦA P VIVAX VỚI MỘT SỐ THUỐC

ĐIỀU TRỊ TRONG PHÒNG THÍ NGHIỆM (IN VITRO) 49

3.3.1 Đánh giá tính nhạy cảm của P vivax với QN 50

3.3.2 Đánh giá tính nhạy cảm của P vivax với DHA 51

3.3.3 Đánh giá tính nhạy cảm của P vivax với CQ 52

3.3.4 Đánh giá tính nhạy cảm của P vivax với PQ 53

3.3.5 So sánh IC50 của nhóm bệnh nhân được điều trị khỏi và tái phát KST 54

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 57

4.1 KẾT LUẬN 57

4.1.1 Tỷ lệ nhiễm KSTSR P vivax tại điểm nghiên cứu 57

4.1.2 Hiệu lực của CQ đối với KSTSR do P vivax tại điểm nghiên cứu 57

4.1.3 Tính nhạy cảm của KSTSR P vivax đối với một số thuốc điều trị trong phòng thí nghiệm 57

4.2 KIẾN NGHỊ 57

TÀI LIỆU THAM KHẢO 58 PHỤ LỤC

MỞ ĐẦU

Bệnh sốt rét (SR) là bệnh truyền nhiễm do ký sinh trùng sốt rét

(KSTSR) thuộc giống Plasmodium gây nên Bệnh truyền theo đường máu, qua vector truyền bệnh là muỗi Anopheles Có 5 loài KSTSR gây bệnh cho người: Plasmodium falciparum (P falciparum), Plasmodium vivax (P vivax),

Plasmodium malariea (P malariae), Plasmodium ovale (P ovale) và Plasmodium knowlesi (P knowlesi) Triệu chứng điển hình của cơn sốt do SR

là: rét run, sốt và vã mồ hôi Bệnh tiến triển có chu kỳ và có hạn định nếu không bị tái nhiễm KSTSR gây miễn dịch đặc hiệu nhưng không bền vững Bệnh lưu hành tại địa phương, trong điều kiện thuận lợi có thể gây thành dịch Hiện chưa có vắcxin phòng bệnh nhưng có thuốc điều trị đặc hiệu và có thể phòng chống được Ở nước ta bệnh lưu hành chủ yếu vùng rừng, đồi, núi, ven biển nước lợ bệnh xảy ra quanh năm nhưng chủ yếu vào mùa mưa [1]

Việt Nam đặt mục tiêu loại trừ SR vào năm 2030 [2] Tuy nhiên SR do

P vivax có xu hướng tăng lên trong những năm gần đây, các biện pháp can

thiệp loại trừ SR do P vivax gặp nhiều khó khăn do có thể bị bỏ sót ký sinh trùng (KST) khi phát hiện bằng kính hiển vi, vì P vivax thường có mật độ thấp, P vivax phát triển và tồn tại được trong điều kiện khí hậu lạnh, hình thành giao bào sớm hơn P falciparum do vậy khả năng lây truyền trong cộng đồng cũng sớm hơn P falciparum [3], điều trị thể ngủ trong gan đòi hỏi thời

gian điều trị dài (14 ngày) [1], thiếu phương tiện chẩn đoán thiếu enzyme G6PD nên tuân thủ điều trị không cao, muỗi truyền bệnh thay đổi tập tính (hút máu trong và ngoài nhà, hút máu vào lúc chập tối) cũng như xuất hiện tình trạng KST kháng thuốc điều trị và muỗi SR kháng hóa chất diệt côn trùng [3]

Gia Lai là một trong những tỉnh có số KSTSR cao nhất trong cả nước Theo báo cáo chương trình phòng chống SR (PCSR), tại Gia Lai số KSTSR năm 2014 là 4.367 ca, chiếm 27,7% tổng số KST trên toàn quốc và năm 2018

số KST giảm xuống là 1.101 ca, nhưng vẫn chiếm 22.9% tổng số KST trên cả

nước [4] [5] Trong đó, SR do P vivax năm 2014 là 1.833 ca và năm 2018 là

336 ca Số ca mắc SR tập trung chủ yếu tại các huyện như Phú Thiện, Ya Pa, Krông Pa Đây là tỉnh có vùng SR lưu hành rộng nên hàng năm có nhiều PCSR được triển khai, tuy nhiên tỷ lệ mắc SR vẫn chưa có xu hướng giảm xuống [5]

Xác định tỷ lệ mắc SR và đánh giá độ nhạy cảm của P vivax với thuốc

điều trị có vai trò quan trọng trong phòng chống bệnh SR, ngăn chặn sự lây lan của chủng KST kháng thuốc, đề xuất phác đồ điều trị để làm giảm nguy

cơ mắc, tái phát, sốt rét ác tính (SRAT) và tử vong do SR Do đó chúng tôi tiến hành nghiên cứu: “Đặc điểm nhiễm và sự nhạy cảm ký sinh trùng sốt rét

Plasmodium vivax với một số thuốc điều trị tại huyện Krông Pa, tỉnh Gia

Lai”

Mục tiêu:

1 Đặc điểm nhiễm ký sinh trùng sốt rét P vivax tại một số xã thuộc

huyện Krông Pa, tỉnh Gia Lai;

2 Đánh giá hiệu lực điều trị của P vivax với chloroquin trên bệnh

nhân sốt rét tại một số xã thuộc huyện Krông Pa, tỉnh Gia Lai;

3 Đánh giá sự nhạy cảm của ký sinh trùng P vivax với một số thuốc

sốt rét trong phòng thí nghiệm

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 VÀI NÉT VỀ BỆNH SỐT RÉT

1.1.1 Định nghĩa bệnh sốt rét

Sốt rét là một bệnh lây truyền theo đường máu gây nên bởi KST

Plasmodium thông qua muỗi Anopheles truyền bệnh cho người [6]

1.1.2 Ký sinh trùng sốt rét gây bệnh trên người

Có 5 loài KSTSR gây bệnh cho người: P falciparum, P vivax, P

malariae, P ovale và P knowlesi Ở Việt Nam, P falciparum chiếm tỷ lệ cao

70 - 80%, thường gây SR nặng, biến chứng và tử vong P vivax chiếm tỷ lệ khoảng 20 - 30%, gây SR cách nhật, SR tái phát, P malariae chiếm 1 - 3% [6]; P ovale và P knowlesi có tỷ lệ rất thấp (< 0.05%) [7]

Bảng 1 Đặc điểm nhiễm của từng loài Plasmodium pps trên người

P falciparum P vivax P ovale P malariae P knowlesi

Giai đoạn ở gan

Đặc điểm Loài ký sinh trùng

P falciparum P vivax P ovale P malariae P knowlesi

9.000 - 30.000

6.000 - 20.000

20.000 - 236.000

Sốt sơ phát Nặng,

ác tính

Nhẹ, nặng

Nhẹ Nhẹ Nhẹ, nặng,

ác tính Tái phát (thể ngủ

Ở muỗi thoa trùng P falciparum P vivax P.ovale P malariae P knowlesi

KST phát triển

1.1.3 Chu kì phát triển của ký sinh trùng sốt rét

Chu kì phát triển của KSTSR phải qua 2 vật chủ là muỗi Anopheles và

người KST sinh sản hữu tính trong cơ thể muỗi (muỗi là vật chủ chính) và sinh sản vô tính trong tế bào gan và hồng cầu ở người (người là vật chủ phụ)

1.1.3.1 Ký sinh trùng sốt rét phát triển ở muỗi

Giao bào đực và giao bào cái ở người bị SR được muỗi Anopheles hút

vào dạ dày sẽ phát triển thành giao tử đực và giao tử cái: một giao bào cái phát triển thành một giao tử cái, một giao bào đực phát triển thành 4 - 8 giao

tử đực bằng hiện tượng thoát roi Giao tử đực kết hợp với giao tử cái tạo thành hợp tử (trứng thụ tinh) Trong vòng 18 - 24 giờ trứng này sẽ trở thành một trứng di động, đi xuyên qua vách dạ dày muỗi và phát triển thành một trứng nang nằm ở mặt ngoài và dưới lớp màng bao dạ dày, có kích thước từ

40 - 55µm Trứng nang phát triển thành nang thoa trùng, chứa hàng ngàn thoa

trùng trong đó Nang thoa trùng vỡ ra, các thoa trùng tự do sẽ hướng về và tập trung trong tuyến nước bọt của muỗi Khi muỗi đốt người thoa trùng sẽ xâm nhập vào cơ thể người Thời gian phát triển trong cơ thể muỗi khoảng 10 - 30

ngày tùy theo loại KST và nhiệt độ môi trường: P falciparum trong khoảng

10 ngày, P vivax 10 ngày, P malariae và P ovale 14 ngày, P knowlesi là 10

ngày ở nhiệt độ 20 - 28oC Nhiệt độ cao làm thời gian hoàn thành chu kỳ ngắn hơn

1.1.3.2 Ký sinh trùng sốt rét phát triển ở người

Gồm 2 giai đoạn: Giai đoạn trong gan (tiền hồng cầu) và giai đoạn trong máu (trong hồng cầu)

- Giai đoạn trong gan: Khi muỗi Anopheles đốt người, thoa trùng sẽ

theo nước bọt của muỗi xâm nhập vào hệ tuần hoàn Sau 30 phút, toàn bộ

thoa trùng vào gan và phát triển tại gan Đối với P falciparum và P malariae,

toàn bộ thoa trùng phát triển thành thể phân liệt và giải phóng KST non vào

máu Đối với P vivax và P ovale, một số thoa trùng khi xâm nhập tế bào gan

không phát triển ngay thành thể phân liệt mà tồn tại ở dạng thể ngủ trong gan, khi gặp điều kiện thuận lợi, thể ngủ sẽ được hoạt hóa, phát triển và phóng thích vào máu gây nên những cơn SR tái phát xa

- Giai đoạn trong máu: KST từ gan xâm nhập vào hồng cầu, phát triển

từ thể tư dưỡng thành thể phân liệt, phá vỡ hồng cầu giải phóng KST non gây nên cơn SR trên lâm sàng Hầu hết KST non quay lại ký sinh trong hồng cầu mới, một số biệt hóa thành thể hữu tính là giao bào đực và giao bào cái, những giao bào này nếu được muỗi hút vào dạ dày sẽ tiếp tục phát triển trong

cơ thể muỗi tạo thành thoa trùng, nếu không được muỗi hút, giao bào ở lại trong máu rồi bị tiêu đi

Hình 1.1 Chu kỳ sinh học của KSTSR [8]

1.2 TÌNH HÌNH MẮC SỐT RÉT TRÊN THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM

1.2.1 Tình hình mắc sốt rét trên thế giới

Đến nay mặc dù bệnh SR đã giảm ở nhiều quốc gia và khu vực trên thế giới, nhưng SR vẫn còn là vấn đề ảnh hưởng nghiêm trọng đến sức khỏe cộng đồng, đặc biệt ở các nước nhiệt đới do công tác PCSR còn nhiều khó khăn Theo báo cáo của Tổ chức Y tế thế giới (WHO), tỷ lệ mắc bệnh SR đã giảm trên toàn cầu từ năm 2010 đến 2017 từ 72 trường hợp/1.000 dân số nguy cơ xuống còn 59 trường hợp/1.000 dân số nguy cơ và không thay đổi đáng kể trong vòng 3 năm gần đây Năm 2017 có 219 triệu trường hợp mắc SR, giảm

20 triệu trường hợp so với năm 2010 [9] Trong đó 92% trường hợp mắc bệnh

là ở khu vực Châu Phi, 5% ở khu vực Đông Nam Á và 2% ở khu vực Địa Trung Hải 14 quốc gia Châu Phi và Ấn Độ chiếm 80% tổng số các trường hợp mắc SR trên toàn thế giới, đặc biệt là ở Nigeria (25%), Cộng hòa Dân chủ Congo (11%), Mozambique (5%), Ấn Độ (4%) và Uganda (4%)

Năm 2017, khu vực Đông Nam Á có khoảng 119.000 trường hợp mắc

SR, tỷ lệ mắc bệnh đã giảm 59% so với năm 2010 và tỷ lệ mắc SR giảm từ 17

trường hợp/1.000 dân số nguy cơ năm 2010 xuống 7 trường hợp/ 1.000 dân số nguy cơ vào năm 2017 [9]

Tử vong do SR đã giảm nhiều so với trước đây, tuy nhiên vẫn còn ở mức cao Năm 2017 có 435.000 trường hợp tử vong do SR trên toàn cầu trong khi số lượng này là 451.000 trường hợp năm 2016 và 607.000 trường hợp năm 2010 Tử vong do SR tập trung chủ yếu ở 17 quốc gia thuộc khu vực Châu Phi và Ấn Độ 7 quốc gia có tỷ lệ tử vong cao nhất trên toàn cầu là: Nigeria (19%), Cộng hòa Dân chủ Congo (11%), Burkina Faso (6%), Cộng hòa Tanzania (5%), Sierra Leone (4 %), Nigeria (4%) và Ấn Độ (4%) [9] Trẻ

em dưới 5 tuổi có nguy cơ tử vong cao chiếm > 50% trường hợp tử vong do

SR trên toàn thế giới

Trong 5 loài KSTSR gây bệnh cho người, P falciparum và P vivax là

2 loài có tỷ lệ mắc cao nhất và có vùng lưu hành rộng Tuy nhiên SR do P

vivax thường không được chú trọng nhiều như P falciparum do P falciparum

thường có tỷ lệ mắc và tử vong cao hơn đặc biệt ở châu Phi, châu Á Mặc dù vậy, SR do P vivax gây tác hại không nhỏ đến sức khỏe cộng đồng, đe dọa

sức khỏe của ít nhất 40% dân số thế giới chủ yếu ở các quốc gia Đông Nam

Á, châu Phi và Tây Thái Bình Dương, Nam Mỹ [10], [11] Mỗi năm có

khoảng 80 - 390 triệu ca mắc SR do P vivax (trong đó 80% số ca xảy ra ở Nam Á và Đông Nam Á), có những năm tỷ lệ P vivax chiếm đến 25 - 40% trong số 515 triệu ca SR chung trên toàn cầu [12] SRAT và tử vong do P

vivax cũng đã được báo cáo [13]

Năm 2017 số bệnh nhân mắc SR P vivax trên toàn thế giới là

7.510.000 trường hợp giảm 45,7% so với năm 2010 (16.440.000 trường hợp) Trong đó Châu Phi chiếm số lượng cao nhất với 701.000 trường hợp, theo sau

là Châu Mỹ 723.000 trường hợp và Đông Nam Á là 4.200.000, Trung Đông

có số lượng thấp nhất là 1.366.000 trường hợp [9]

1.2.2 Tình hình mắc sốt rét ở Việt Nam

Hình 1.2 Diễn biến số mắc SR tại Việt Nam năm 2009 - 2018

Tại Việt Nam, bệnh SR lây truyền quanh năm, có 1 đến 2 đỉnh cao tùy vùng, tùy theo vector truyền bệnh SR chính, có liên quan chặt chẽ với mùa mưa Bệnh nhân SR thường gặp vào các tháng đầu năm (tháng 1 đến tháng 3)

và các tháng cuối năm (tháng 9 đến tháng 12) [5] Trong vòng 10 năm trở lại đây, từ năm 2009 đến 2018 số bệnh nhân mắc SR ở Việt Nam giảm đáng kể:

số bệnh nhân mắc SR năm 2009 là 60.867 bệnh nhân, sau đó giảm xuống 54.297 bệnh nhân vào năm 2010, 35.406 bệnh nhân vào năm 2013 và chỉ còn 6.870 bệnh nhân năm 2018, giảm 88,71% so với năm 2009

Năm 2018 toàn quốc có 4.813 KSTSR, 10 tỉnh có KST lưu hành nặng ở Việt Nam là: Bình Phước, Gia Lai, Đắk Lắk, Phú Yên, Đắk Nông, Lâm Đồng, Kon Tum, Khánh Hòa, Bình Thuận và Quảng Bình Trong đó, KSTSR tập trung chủ yếu ở 3 tỉnh là: Bình Phước, Gia Lai và Đắk Lắk chiếm 64,66% tổng số KST Số KSTSR duy trì mức cao từ năm 2009 đến năm 2014 (16.130 - 15.752 KST) sau đó giảm xuống trong năm 2015 - 2016 (9.331 - 4.161 KST) Trong 3 năm trở lại đây số KST trên toàn quốc có xu hướng tăng dần: Từ 4.161 KST

Năm

Số lượng

bệnh nhân

năm 2016, tăng lên 4.813 KST vào năm 2018

Như vậy so sánh cùng kỳ với năm 2017, số bệnh nhân SR toàn quốc năm 2018 giảm 18,3% (6.870/8.411) nhưng KSTSR tăng 5,8% (4.813/4.548)

Cũng trong năm 2018, số bệnh nhân SRAT giảm 67,6% (12/37) so với năm 2017 Số tử vong do SR giảm 5 trường hợp (1/6) Không có dịch SR xảy

ra [5]

Cơ cấu KSTSR cũng có nhiều thay đổi, trước năm 2010 P falciparum

chiếm tỷ lệ cao > 70% tổng số KST trên toàn quốc, tuy nhiên tỷ lệ này giảm dần do kết quả của các biện pháp can thiệp phòng chống và loại trừ SR, sau

năm 2015 tỷ lệ nhiễm P falciparum chỉ còn dao động từ 46,6% đến 62,8%

Ngược lại tỷ lệ mắc SR do P vivax từ năm 2009 đến 2018 có xu hướng tăng dần, dao động trong khoảng 19.9% đến 50% Tỷ lệ mắc SR do P vivax

năm 2018 là 36.4% (1.751/4.813), tăng 143 trường hợp so với năm 2017

Cơ cấu KSTSR cũng có sự khác biệt giữa các khu vực: P falciparum

được tìm thấy chủ yếu tại khu vực miền Trung và Tây Nguyên chiếm 63,44%

(2.103/3.315) tổng số P falciparum trên toàn quốc năm 2018, trong khi 38,16% số mắc P vivax là ở khu vực miền Nam Năm 2018 phát hiện 2 trường hợp nhiễm P ovale và 11 trường hợp nhiễm P malariae, không có trường hợp nào nhiễm P knowlesi được phát hiện [5]

1.3 ĐỊNH NGHĨA KSTSR KHÁNG THUỐC VÀ CÁC YẾU TỐ LIÊN

QUAN

Một chủng KSTSR được xem là kháng thuốc khi tồn tại và phát triển trong môi trường có nồng độ thuốc tối thiểu đủ diệt hoặc ức chế sự nhân lên của KST Nói cách khác, khi uống và hấp thu đầy đủ một lượng thuốc bằng hoặc cao hơn lượng thông thường được khuyến cáo nhưng dưới liều độc mà chủng KST vẫn còn khả năng phát triển trong máu thì đó là chủng KST đã kháng thuốc

Kháng với một thuốc SR có thể là một hậu quả của mối liên quan đáp

ứng giữa nồng độ và hiệu quả thuốc đó Vì đặc tính dược động học của thuốc

SR thay đổi rất rộng giữa các bệnh nhân với nhau, khi xét về định nghĩa của kháng thuốc SR cũng có khi gặp phải trường hợp nồng độ thuốc trong huyết tương bình thường (phụ thuộc vào chuyển hóa, phân bố, thải trừ thuốc trong

cơ thể) [14]

Kháng thuốc SR không nhất thiết là một ca thất bại điều trị, nghĩa là thất bại với việc làm sạch KST trong máu và/hoặc giải quyết các triệu chứng lâm sàng khi đã chỉ định đúng thuốc SR Do vậy, trong khi kháng thuốc ắt sẽ dẫn đến thất bại điều trị, nhưng không phải tất cả trường hợp thất bại điều trị đều là do kháng thuốc Thất bại điều trị có thể do sử dụng liều không đúng, vấn đề chấp nhận điều trị của bệnh nhân, chất lượng thuốc kém, tương tác giữa các thuốc, hấp thu thuốc kém hoặc chẩn đoán nhầm bệnh

1.4 NGUYÊN NHÂN SỰ PHÁT SINH VÀ PHÁT TRIỂN KSTSR KHÁNG THUỐC

Gồm 3 nguyên nhân chủ yếu:

• Áp lực thuốc:

Dùng nhiều lần một loại thuốc trong một thời gian dài cho một đối tượng lớn trong quần thể sẽ tạo điều kiện thuận lợi cho chủng biến dị kháng

tự nhiên dần dần nhân lên, thay thế những chủng nhạy bị tiêu diệt dần còn gọi

là quá trình sàng lọc của áp lực thuốc Trong SR khi đối tượng bệnh nhân là

SR sơ nhiễm và có MĐKST cao, khi dùng một loại thuốc trong một thời gian dài, đặc biệt không đủ liều thì chủng KST dễ thích nghi dần với thuốc

Với một số thuốc, hiện tượng kháng có thể mất đi sau một thời gian ngừng sử dụng thuốc đó

• Sinh thái người - di biến động:

KST thường phát sinh, phát triển kháng ở những nơi có nhiều nguồn bệnh, MĐKST cao, nhất là ở quần thể chưa có miễn dịch, mới vào vùng SR nặng

KST kháng thuốc lan rộng đi xa chủ yếu do nguồn bệnh di chuyển

• Sự tiếp nhận của muỗi địa phương:

KST kháng thuốc lan gần hay xa đều do di biến động bệnh nhân và khả năng tiếp nhận của muỗi địa phương

KST kháng thuốc có thể chỉ xuất hiện tại một địa phương khi chủng KST kháng hoàn thành được chu kỳ phát triển hữu tính trong cơ thể muỗi địa phương

1.5 TÌNH HÌNH KSTSR P VIVAX GIẢM NHẠY CẢM VỚI THUỐC

lớn các quốc gia có SR lưu hành vẫn sử dụng CQ như là thuốc điều trị ưu

tiên cho SR do P vivax [9] Tình trạng P vivax giảm nhạy đối với CQ lần

đầu tiên được báo cáo từ hai bệnh nhân trở về từ Papua New Guinea vào năm 1989 (thất bại điều trị với phác đồ điều trị hiện hành) [15], sau đó cũng được tìm thấy ở Indonesia và Myanmar [16] Những nghiên cứu ở Papua New Guinea và Indonesia cho thấy 20 - 30% bệnh nhân tái phát KST sau 1 - 3 tuần điều trị với liều 25mg CQ bazơ/kg cân nặng [16], [17]

Khu vực biên giới Thái Lan đã xuất hiện tình trạng P vivax kháng

CQ được khẳng định bằng kỹ thuật sinh học phân tử Năm 2009 được coi là năm phát hiện có ý nghĩa về sự kháng CQ của KST tại Thái Lan khi nồng

độ CQ trong huyết tương > 100 ng/mL mà vẫn thất bại điều trị [18]

Nghiên cứu đa trung tâm tiến hành tại Alor thuộc quần đảo Lesser

Sundas, phía đông Indonesia về hiệu lực điều trị của CQ trên P vivax cho

thấy 8,33% thất bại điều trị sớm ở D2-3, có 5,56% xuất hiện lại KST thể vô

tính P vivax vào ngày D7, có 27,78% trường hợp xuất hiện P vivax vào

ngày D14, có 5,56% vào ngày D21 và 2,78% vào ngày D28, tỷ lệ kháng trên 50% [19]

Nghiên cứu đánh giá hiệu lực phác đồ CQ tại bệnh viện Mirpurkhas,

Sindh, Pakistan cho thấy 19% số ca P vivax kháng thuốc CQ phải thay thế phác đồ khác [12] Tại Colombia, tỷ lệ kháng là 11% và P vivax xuất hiện

lại vào ngày D11, D26 [20]

Ấn Độ là quốc gia có tình hình SR phức tạp, ca P vivax kháng CQ

đầu tiên được báo cáo vào năm 1995 [21] Nghiên cứu tiến hành tại khu vực Nadiad taluka, tỉnh Gujarat đánh giá hiệu lực CQ cho thấy: tỷ lệ tái phát là 28,31%, tỷ lệ tái phát cao nhất ở nhóm tuổi từ 5 - 10, không có sự khác biệt giữa nam và nữ, thời gian tái phát ngắn thường sau 2 - 3 tháng, thời gian tái phát dài nhất được theo dõi là 17 tháng [22] Nghiên cứu tiến hành tại Mumbai, Ấn Độ đánh giá hiệu lực phác đồ trên 283 trường hợp

nhiễm P vivax với CQ, thời gian theo dõi sau điều trị là 12 tháng thì có

đến 19 ca tái phát, 17/19 ca đó tái phát trong vòng 6 tháng đầu và xác định là

chủng Chesson (á chủng của P vivax), các tác giả cũng đưa ra khuyến cáo để theo dõi hiệu lực của thuốc đối với P vivax nên theo dõi liệu trình ít nhất 6

tháng [23]

Hình 1.3 Bản đồ P vivax kháng thuốc CQ (httpp://www.pnas.org 2013)

Nghiên cứu tiến hành đánh giá hiệu lực CQ đối với P vivax tại Calcutta

và Orissa, Ấn Độ năm 1998 - 2001, thu nhận 800 trường hợp nhiễm P vivax,

trong đó 480 bệnh nhân được theo dõi đủ liệu trình có 1,25% (6/480) trường

hợp phát hiện kháng thuốc CQ và thời điểm tối đa vẫn tồn tại KST P vivax

trong máu sau điều trị đủ liều là D5 [21]

Thuốc CQ là thuốc lựa chọn ưu tiên trong điều trị SR do P vivax chưa

biến chứng ở nhiều quốc gia trên thế giới ngoại trừ Indonesia, Papua New Guinea, Sudan, Namibia, Nam Phi quần đảo Solomon và Vanuatu và

Campuchia - nơi mà tình hình P vivax kháng thuốc lan rộng đã chuyển sang

dùng thuốc phối hợp ACTs [24] Các nghiên cứu trước đây cho thấy thất bại

điều trị đối với P vivax thường xuất hiện trước ngày 28 (D28) Thất bại điều trị với CQ cũng đã được quan sát thấy tại châu Á, châu Phi và Mỹ Latinh [17]

Theo tổng kết của hệ thống theo dõi SR kháng thuốc toàn cầu (WorldWide Antimalarial Resistance Network (WWARN)) các nghiên cứu về

kháng thuốc do P vivax còn rất hạn chế Trong vòng 60 năm qua, chỉ có

khoảng 15% (n =198) số thử nghiệm đã ấn bản liên quan đánh giá hiệu lực

của thuốc đối với P vivax, nên các nghiên cứu hiện nay đang tập trung để có

số liệu bổ sung cho những khoảng trống này [12]

Khác với P falciparum, P vivax có thể ngủ trong gan nên có khả năng

khởi động các giai đoạn nhiễm trùng trong máu sau nhiều tuần hoặc nhiều

năm kể từ lần nhiễm đầu tiên Phân biệt tái phát với tái nhiễm do P vivax còn

nhiều khó khăn do kỹ thuật sinh học phân tử chưa được áp dụng [12]

Do vậy, các quốc gia trong mạng lưới loại trừ SR châu Á Thái Bình

Dương (Asia Pacific Malaria Elimination Network - APMEN) đã xác định P

vivax là một trong những thách thức lớn nhất trong loại trừ SR

1.5.1.2 Tình hình P vivax kháng piperaquin (PQ)

Hiện tại CQ và PQ là thuốc dùng để điều trị thể vô tính và diệt thể ngủ

của P vivax [25], nên có khả năng ngăn ngừa P vivax tái phát Liệu pháp PQ

có thể làm tăng hoạt tính của CQ chống lại sự kháng thuốc của KSTSR P

vivax ở giai đoạn trong hồng cầu [26] Dù nhiều báo cáo các vùng địa lý khác

nhau cho thấy P vivax kháng PQ [27] nhất là tại Indonesia, song bằng chứng

tin cậy chưa thực sự thuyết phục do nhiều yếu tố gây nhiễu như điều trị không

có giám sát, chưa đánh giá được khả năng dung nạp của KST, mức độ tái nhiễm [17], [28], tái phát có thể xảy ra sớm hoặc muộn (16 ngày đến 3 năm)

kể từ khi lần nhiễm SR đầu tiên, ngay cả khi đã điều trị đủ liều [29]

Các nghiên cứu trong thời gian gần đây cũng cho thấy bằng chứng KSTSR đa kháng thuốc ở các mức độ khác nhau [30], [31] Do đó, các thử nghiệm lâm sàng để tìm ra 1 thuốc mới, có hiệu quả diệt thể ngủ trong gan của KST đồng thời rút ngắn thời gian điều trị có vai trò quan trọng trong

phòng chống và loại trừ SR do P vivax Sự nghiên cứu phát triển thành công

của Tafenoquine [32] - một thuốc SR mới có thể mở ra một bước ngoặt lớn trong việc loại trừ SR trên phạm vi toàn cầu trong tương lai gần

1.5.2 Tình hình KSTSR P vivax giảm nhạy cảm với thuốc điều trị

tại Việt Nam

Tại Việt Nam, mặc dù có một báo cáo về P vivax kháng với CQ được công bố vào năm 2002 [33] nhưng đến nay P vivax vẫn được coi là nhạy cảm

với CQ: Nghiên cứu năm 2009 tại miền Trung, Việt Nam đánh giá sự nhạy

cảm P vivax với CQ (liều 25 mg/kg/ngày x 3 ngày), hoặc halofantrin (liều

điều trị là 8 mg/kg/ x 3 lần/ngày), hiệu lực phác đồ CQ là 100% và halofantrine là 87,5%

Nghiên cứu của Nông Thị Tiến và cộng sự (cs) giai đoạn 1998 -

2000, kết quả thử nghiệm trên 252 bệnh nhân SR nhiễm P vivax đơn thuần

tại 9 điểm nghiên cứu khác nhau tại một số khu vực SR lưu hành nặng, vùng sâu, vùng xa ở Việt Nam cho thấy tỷ lệ điều trị khỏi đến D28 với CQ

là 100% [34] Kết quả nghiên cứu đáp ứng của KSTSR P vivax với phác

đồ CQ tại 3 tỉnh miền Trung - Tây nguyên năm 2012 cho thấy tỷ lệ ACPR

là 100%, không có trường hợp nào thất bại điều trị [35]

Nghiên cứu tại Cư Jut, Đăk Nông năm 2014 (n = 41), MĐKST P

vivax ngày D0 trung bình là 2.525/µl máu, theo dõi cho thấy thời gian làm sạch KST thể vô tính sau điều trị CQ trung bình 38,20 ± 6,52 giờ, song song đó thời gian cắt sốt cải thiện triệu chứng lâm sàng trung bình là 28,14

± 10,16 giờ Hiệu lực điều trị là 100% [36]

Nghiên cứu tại Khánh Vĩnh, Khánh Hòa năm 2017, đánh giá hiệu lực phác đồ chuẩn (CQ liều 25mg/kg cân nặng x 3 ngày) sau điều trị cho thấy thuốc vẫn còn tỷ lệ chữa khỏi cao (> 95%), không có ca bệnh nào tồn tại KSTSR thể vô tính từ ngày D3 trở đi [37]

Mặc dù vậy, các dấu hiệu sớm nghi ngờ P vivax kháng CQ cũng xuất hiện rải rác tại một số vùng SR lưu hành: Tình trạng còn KST ngày D3 sau điều trị đủ liều CQ gặp ở Ninh Thuận tỷ lệ D3 dương tính là 1,5% - 3% [38], nghiên cứu tại Gia Lai tỷ lệ này là 4,34% (2/46) [39]

Nghiên cứu tiến hành từ năm 1997 - 2000 trên 240 bệnh nhân P

vivax tại Bình Thuận: có hai trường hợp xuất hiện lại KST vào ngày 14

KST, 8 trường hợp xuất hiện lại KST vào ngày 16, 18 trường hợp xuất hiện lại KST vào ngày 18 và 26 trường hợp xuất hiện KST vào ngày 25 sau khi điều trị CQ 3 ngày theo liều chuẩn [33] Nghiên cứu tại Ninh Thuận năm 2015- 2016 tỷ lệ LFC là 13,3% (2/15) [40] Tại Gia Lai năm 2017, tỷ lệ LCF là 4,76% [39]

Nghiên cứu tại Quảng Nam năm 2011 cho thấy tỷ lệ thất bại vào ngày 28 là 3.5% (8/232), nghiên cứu này cũng xác định được 3 trường hợp

(3/232) P vivax kháng CQ bằng phương pháp đo nồng độ thuốc CQ trong

máu vào ngày tái xuất hiện lại KST trong máu sau điều trị đủ liều với CQ +

PQ [41]

Tại Việt Nam, số liệu liên quan đến kháng thuốc do P vivax vẫn còn

hạn chế, các báo cáo đăng tải có tỷ lệ thất bại dao động từ 0 đến < 14% [33], [38], [42]

1.6 CHẨN ĐOÁN VÀ ĐIỀU TRỊ BỆNH SỐT RÉT

1.6.1 Lâm sàng

Biểu hiện lâm sàng của bệnh SR thường rất đa dạng Tùy thuộc vào loại KST nhiễm, miễn dịch của cơ thể (bị SR nhiều lần hay lần đầu), trẻ em hay người lớn, phụ nữ mang thai Người bệnh biểu hiện có cơn sốt điển hình hoặc sốt không thành cơn:

- Cơn sốt điển hình có chu kì với 3 giai đoạn: rét run - sốt nóng - vã

mồ hôi

- Cơn sốt điển hình thường gặp ở người SR tái phát Cơn sốt có tính

chu kì, P falciparum và P knowlesi gây sốt hàng ngày (mỗi ngày 1 cơn sốt), P vivax gây sốt cách nhật (cách ngày 1 cơn sốt), P malariae (gây sốt cách 2 ngày), P ovale (sốt cách 3 ngày), giữa 2 cơn sốt bệnh nhân cảm

thấy bình thường

- Cơn sốt không điển hình: Gặp ở người mới bị SR lần đầu Biểu hiện ban đầu mệt mỏi cơ, nhức đầu, chán ăn, ớn lạnh, gai rét, các biểu hiện lâm sàng không rõ Sốt tăng nhanh trong vài ngày rồi trở thành sốt liên tục cao không thành cơn

- Các dấu hiệu khác kèm theo sốt: thiếu máu, giảm hồng cầu, bạch cầu bình thường hoặc giảm, gan, lách sưng và các triệu chứng khác như nhức đầu mất ngủ, đau mỏi khớp

1.6.2 Các phương pháp chẩn đoán

1.6.2.1 Phương pháp nhuộm Giem sa soi kính hiển vi

- Kỹ thuật lấy lam máu nhuộm Giêm sa soi dưới kính hiển vi phát

hiện KST là kỹ thuật cơ bản được coi là tiêu chuẩn vàng trong chẩn đoán

SR

- Mỗi bệnh nhân cần được lấy một lam máu đầu ngón tay (giọt dày

hoặc cả giọt dày và giọt mỏng trên cùng một lam kính) Ở trẻ nhỏ có thể lấy máu ở ngón chân cái Ngoài ra có thể lấy máu ở đường tĩnh mạch hoặc tìm KSTSR qua tuỷ xương hoặc lấy máu trong da

- Lam máu nhuộm Giêm sa được để khô tự nhiên và soi dưới kính

hiển vi phát hiện KST

+ Ưu điểm: Xác định được mật độ, thể, loại, KST là phương pháp

đơn giản, thời gian trả lời kết quả nhanh có thể làm ở tuyến cơ sở, giá thành thấp

+ Nhược điểm: Cần phải đào tạo xét nghiệm viên nên khá tốn kém

và mất thời gian Chất lượng kết quả phụ thuộc vào trình độ, năng lực của xét nghiệm viên

1.6.2.2 Xét nghiệm nhanh phát hiện kháng nguyên SR

Xét nghiệm chẩn đoán nhanh phát hiện kháng nguyên đặc hiệu loài của KSTSR ở trong máu người bệnh Hiện nay có một số xét nghiệm chẩn đoán nhanh đã hoặc đang dùng ở Việt Nam như: Para Sight F và

Paracheck P f (ORCHID - Ấn Độ), xét nghiệm SD Malaria Ag P f/ P v

(standard diagnostics, inc, Hàn Quốc)

+ Ưu điểm: đơn giản, dễ sử dụng, cho kết quả sau 15 phút, không

đòi hỏi các dụng cụ, trang thiết bị đắt tiền

+ Nhược điểm: Không thể xác định MĐKST, có thể cho kết quả

dương tính giả trong một số trường hợp (KST đã được tiêu diệt bởi thuốc nhưng kháng nguyên vẫn tồn tại trong máu ít nhất 2 tuần) hoặc âm tính giả (MĐKST quá thấp hoặc quá cao), chất lượng của xét nghiệm nhanh phụ thuộc vào điều kiện bảo quản…

1.6.3 Điều trị

Nguyên tắc:

+ Điều trị sớm, đúng và đủ liều

+ Điều trị cắt cơn sốt kết hợp với chống lây lan (SR do P

falciparum) và điều trị tiệt căn (SR do P vivax, P ovale)

+ Các trường hợp SR do P falciparum không được dùng một thuốc

SR đơn thuần, phải điều trị thuốc SR phối hợp để hạn chế kháng thuốc và tăng hiệu lực điều trị

+ Điều trị thuốc SR đặc hiệu kết hợp với điều trị hỗ trợ và nâng cao thể trạng

+ Các trường hợp SRAT phải chuyển về đơn vị hồi sức cấp cứu của bệnh viện từ tuyến huyện trở lên, theo dõi chặt chẽ và hồi sức tích cực

Theo Hướng dẫn chẩn đoán, điều trị bệnh SR năm 2016 của Bộ Y tế,

tại Việt Nam phác đồ điều trị P vivax như sau:

Chloroquin phosphat liều: 25mg baze/kg/ngày x 3 ngày + primaquin

liều: 0,25mg/kg/ ngày x 14 ngày

1.7 CÁC KỸ THUẬT ĐÁNH GIÁ SỰ NHẠY CẢM CỦA KSTSR VỚI THUỐC ĐIỀU TRỊ

WHO khuyến cáo giám sát đáp ứng của KST với các thuốc SR phải

được thực hiện hàng năm theo kỹ thuật in vitro (thí nghiệm được tiến hành

sử dụng KSTSR đã được phân lập từ môi trường sinh học thông thường của

chúng để nuôi trong ống nghiệm) và in vivo (tác động lên KSTSR được thử

nghiệm trên cơ thể con người) Các phương pháp này có vai trò quan trọng trong việc định hướng, lựa chọn các thuốc, các phác đồ điều trị, ngăn chặn sự lưu hành và gia tăng của SR kháng thuốc Phương pháp này đã được thực

hiện ở nhiều nước trên thế giới Giám sát in vivo là phương pháp quan trọng

nhất để quyết định phác đồ điều trị, phát triển và lựa chọn chính sách thuốc

chống SR quốc gia Việc giám sát in vitro, nhằm xác định độ nhạy cảm của

KST với thuốc SR cung cấp những dấu hiệu dự báo sớm KST kháng thuốc

và sự cần thiết thay đổi chiến lược dùng thuốc trên địa bàn

1.7.1 Kỹ thuật in vivo

Đối với P vivax đánh giá hiệu lực của thuốc CQ được thực hiện theo

dõi trên lâm sàng là 28 ngày hoặc 42 ngày tùy theo điều kiện ở từng địa

phương [43], [44]

*Thử nghiệm in vivo 28 ngày (WHO, 1981): Theo dõi KST các

ngày D0 (trước khi uống thuốc), D1, D2, D3, D7, D14, D21 và D28 Thử nghiệm này được khuyến cáo vì nó cung cấp được nhiều thông tin, tách được nhạy và kháng độ 1 hoặc xác định được theo dõi thất bại lâm sàng muộn/thời gian sạch KST/đáp ứng lâm sàng và KST đủ (LCF/ thời gian sạch KST/ACPR) thường hay áp dụng trong đánh giá hiệu lực các thuốc

CQ, artesunat

* Thử nghiệm in vivo 42/63 ngày (WHO, 2009): Theo dõi KST các

ngày D0 (trước khi uống thuốc), D1, D2, D3, D7, D14, D21, D28, D35, D42/D49,

D56 và D63 Thử nghiệm này được áp dụng với các thuốc có thời gian bán hủy lâu như PQ (theo dõi đến D42), mefloquin (theo dõi đến D63)

Những thử nghiệm này phải tuân theo các bước: chọn bệnh nhân đúng tiêu chuẩn đề ra, cho bệnh nhân uống thuốc theo phác đồ chuẩn của

từng thuốc, theo dõi xét nghiệm KST theo thời gian quy định, ngăn ngừa tái nhiễm để xác định tái phát được chính xác Quy trình bao gồm cả theo dõi đáp ứng KST và đáp ứng lâm sàng nhằm xác định hiệu quả thực tế của từng phác đồ thuốc, giám sát đáp ứng với thuốc và xây dựng chính sách thuốc quốc gia

1.7.2 Kỹ thuật in vitro

* Kỹ thuật Macro test (1968)

Thử nghiệm in vitro (macro test) đã được thực hiện nhằm đánh giá

tính nhạy cảm của KSTSR với CQ hoặc các thuốc chống SR khác Kỹ thuật này dựa trên đánh giá sự ức chế thể tư dưỡng trẻ của KSTSR phát triển thành thể phân liệt trong môi trường nuôi cấy thích hợp của giếng chứng (không có thuốc) so với các giếng thuốc có nồng độ từ thấp lên cao

Các nghiên cứu ban đầu cho thấy kỹ thuật này cho kết quả nhanh, đáng tin cậy dùng để dự đoán sự xuất hiện và lan tràn của kháng CQ trong điều kiện thực địa, vấn đề chính trong thực hiện thử nghiệm này là tìm được máu nhiễm KST có MĐKST phù hợp, không quá nhiều hoặc quá ít KST hoặc KST quá trẻ, thử nghiệm đòi hỏi phải lấy máu tĩnh mạch [43], [45], [46]

* Kỹ thuật Micro test (1978)

Năm 1978, thử nghiệm in vitro khác được đưa ra là micro test

(Rieckmann - 1978) và trở thành phương pháp chuẩn của WHO từ năm

1980 đến nay Kỹ thuật này dựa trên nguyên tắc nuôi cấy P falciparum

trong môi trường RPMI 1640 [47] Bộ micro test KIT của WHO có các nồng độ thuốc được gắn trên các giếng của phiến nhựa 96 giếng, chia làm

12 hàng, mỗi hàng 8 giếng: có 1 giếng chứng và 7 giếng có nồng độ thuốc khác nhau tùy thuộc mỗi loại thuốc thử nghiệm Quy trình này để xác định

sự nhạy cảm in vitro của P falciparum với thuốc SR tại thực địa Kỹ thuật

này có ưu điểm áp dụng cùng một thời điểm trên nhiều bệnh nhân (trong

cùng 1 đĩa thử), kỹ thuật thử nghiệm trên in vitro cho biết kết quả nhanh hơn theo dõi in vivo, song lại có nhược điểm là chúng không thể thay thế được hoàn toàn kết quả in vivo mà chỉ mang tính chất bổ trợ kết quả đánh

giá cho nhau và trang thiết bị đắt tiền [43], [45], [46], [48]

Đối với P vivax, quy trình nuôi cấy thực địa tương tự như nuôi P

falciparum nhưng môi trường nuôi cấy (BMM) là môi trường McCoy trong

đó đặc biệt chú trọng mẫu KST trước khi đưa vào nuôi cấy cần mật độ thể nhẫn non > 65% để nâng cao tỷ lệ thành công trong quá trình nuôi cấy [49]

CHƯƠNG 2 NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

- Thuốc CQ dạng siro lọ 150mL, chứa 50mg bazơ, code: 0000000876, sản xuất 11/2012, hết hạn 11/2017, hãng sản xuất Sanofi, Pháp

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1 Đối tượng nghiên cứu

Tất cả các bệnh nhân có dấu hiệu nghi ngờ mắc SR đến khám tại trạm y

tế xã hoặc các bệnh nhân được sàng lọc chủ động trong cộng đồng được phát

hiện nhiễm P vivax

2.2.2 Địa điểm nghiên cứu

Nghiên cứu được tiến hành tại năm xã (Chư R’Căm, Ia Rsươm, Uar, Ia Rsai và Chư Gu) thuộc huyện Krông Pa, tỉnh Gia Lai

2.2.3 Thời gian nghiên cứu

- Thời gian nghiên cứu tại thực địa từ 8/2015 đến tháng 12/2016

- Thời gian phân tích kết quả viết và hoàn thành luận văn từ tháng 8/2018 đến tháng 8/2019

2.2.4 Nội dung nghiên cứu

- Nghiên cứu cắt ngang: đánh giá tỷ lệ mắc bệnh và các yếu tố liên quan

- Nghiên cứu đánh giá hiệu lực điều trị của P vivax với thuốc CQ trên bệnh nhân SR do P vivax theo qui trình theo dõi 42 ngày của WHO năm

2009 [44]

- Nghiên cứu đánh giá sự nhạy cảm của P vivax đối với một số thuốc

SR thường dùng tại Việt Nam: QN, DHA, CQ và PQ trong phòng thí nghiệm

(in vitro) theo quy trình nuôi cấy P vivax tại thực địa [49]

2.2.5 Cỡ mẫu nghiên cứu

2.2.5.1 Nghiên cứu cắt ngang

Tất cả các bệnh nhân nghi ngờ mắc SR được khám, sàng lọc tại thời điểm tiến hành nghiên cứu

2.2.5.2 Đánh giá hiệu lực điều trị của CQ trên bệnh nhân SR do P vivax tại điểm nghiên cứu

Cỡ mẫu:

Tỷ lệ điều trị thất bại của một số phác đồ điều trị SR đã nghiên cứu trước đó là khoảng 10%, do vậy tỷ lệ (d) 10% được chọn để xác định cỡ mẫu

đánh giá hiệu lực điều trị của P vivax với thuốc điều trị với độ tin cậy 95%

Theo bảng chọn mẫu qui định cho đánh giá hiệu lực điều trị thuốc SR (WHO

- 1987) (bảng 2) cỡ mẫu là 35 bệnh nhân Nếu tính tỷ lệ mất bệnh nhân theo dõi là 20% Khi đó cỡ mẫu tối thiểu cần đánh giá sự nhạy cảm của KST với thuốc SR là: 35 + 0.2 *35 = 42 bệnh nhân

Bảng 2 Cỡ mẫu tối thiểu dựa trên tỷ lệ thất bại lâm sàng

Tỷ lệ ước tính trong quần thể (p), độ tin cậy 95%

d 0,05 0,10 0,15 0,20 0,25 0,30 0,35 0,40 0,45 0,50 0,05 73 138 196 246 288 323 350 369 380 384

2.2.5.3 Đánh giá sự nhạy cảm của P vivax với một số thuốc điều trị SR

Tất cả các trường hợp nhiễm P vivax đã xác định ở trên có MĐKST

thể nhẫn non > 65% sẽ được đưa vào nuôi cấy để xác định sự nhạy cảm của KST với một số thuốc SR

2.2.6 Các kỹ thuật ứng dụng trong nghiên cứu

2.2.6.1 Thử nghiệm in vivo

- Tiêu chuẩn lựa chọn: Những bệnh nhân đủ các tiêu chuẩn dưới đây

được tuyển chọn vào nhóm nghiên cứu

 Đơn nhiễm với P vivax xác định bằng kính hiển vi với MĐKST thể

vô tính > 250/µl;

 Bệnh nhân ≥ 1 tuổi;

 Nhiệt độ nách ≥ 37.5ºC và/hoặc có tiền sử sốt trong vòng 48 giờ trở

lại đây;

 Bệnh nhân hoặc người giám hộ hợp pháp (đối với trẻ em) đồng ý

tham gia nghiên cứu, lấy mẫu và tái khám bằng văn bản

- Tiêu chuẩn loại trừ: Những bệnh nhân có một trong những dấu hiệu

sau cần được loại ra khỏi nghiên cứu

 Dấu hiệu hoặc triệu chứng của SR nặng/SRAT (theo phân loại của WHO; Phụ lục I);

 Dấu hiệu hoặc triệu chứng của suy dinh dưỡng nặng, xác định bằng cân nặng theo tuổi ≤ 3 đơn vị của độ lệch chuẩn (NCHS/WHO, Phụ lục II);

 Lam máu xác định nhiễm chủng KST Plasmodium khác (bao gồm cả

nhiễm phối hợp);

 Thiếu máu nặng, xác định bằng nồng độ hemoglobin (Hb) < 7g/dl ở người lớn và < 5g/dl ở trẻ em;

 Tiền sử quá mẫn với bất kỳ thành phần nào của thuốc được đánh giá;

 Đang mắc các bệnh gây sốt khác ngoài bệnh SR;

 Tiền sử mắc hoặc đang điều trị các bệnh mãn tính (tim, thận, bệnh gan, hồng cầu hình liềm, HIV/AIDS);

 Đang có thai (xác định bằng que thử thai) hoặc đang cho con bú;

 Thường xuyên sử dụng các thuốc SR có ảnh hưởng đến tác dụng của thuốc SR;

 Đã sử dụng các thuốc điều trị SR trong vòng 3 ngày gần đây (phỏng vấn bệnh nhân)

- Phác đồ điều trị SR do P vivax

Bệnh nhân trong tiêu chuẩn nghiên cứu được nhận đủ liều điều trị CQ với tổng liều 25mg bazơ CQ/kg trọng lượng cơ thể, liệu trình 3 ngày (Phụ lục III) Ngày bệnh nhân được thu nhận và uống liều thuốc CQ đầu tiên được gọi

là ngày D0

Tất cả các lần bệnh nhân uống CQ đều được giám sát Bệnh nhân sẽ được theo dõi 60 phút sau khi uống thuốc để phát hiện các biến cố bất lợi hoặc nôn mửa Nếu bệnh nhân có nôn trong vòng 30 phút sau khi uống thuốc

sẽ được uống lặp lại đủ liều thuốc như ban đầu, bệnh nhân nôn trong vòng 31

- 60 phút sau khi uống thuốc sẽ uống lại nửa liều thuốc Nếu bệnh nhân vẫn tiếp tục nôn, bệnh nhân sẽ bị loại khỏi nghiên cứu và được điều trị bằng phác

Điều trị triệt để

Trừ khi tái phát P.vivax xảy ra trước ngày 42, điều trị PQ sẽ được cung

cấp cho bệnh nhân vào ngày D42 và liều điều trị được thực hiện theo hướng dẫn quốc gia (0.25mg/kg/ngày x 14 ngày) nếu bệnh nhân có xét nghiệm âm tính với thiếu men G6PD

Thuốc điều trị đồng thời

Bất kỳ loại thuốc mới nào được bệnh nhân uống bổ sung trong thời gian theo dõi 42 ngày vì bất kỳ lý do gì, đều phải được ghi trong mục các thuốc dùng đồng thời (ví dụ như thuốc kháng sinh điều trị nhiễm trùng, thuốc chống nôn vv…) Mỗi loại thuốc mới cần phải ghi một lần

Đối với bệnh nhân ngừng thuốc thử nghiệm sớm hoặc những người không đáp ứng với thử nghiệm thuốc và được điều trị bằng thuốc SR khác, các thông tin này phải được ghi lại ngày bắt đầu và ngày kết thúc dùng thuốc trong mục các thuốc dùng đồng thời, mục “Thuốc điều trị sốt rét”

Danh mục các thuốc cần phải tránh khi điều trị thuốc SR (Phụ lục IV)

- Theo dõi bệnh nhân thử nghiệm lâm sàng

Từ ngày D 0 cho đến khi sạch KST

Sau khi bệnh nhân được lấy 5mL máu tĩnh mạch, uống liều thuốc CQ đầu tiên và được theo dõi trong vòng 1 giờ, bệnh nhân sẽ được theo dõi 12 giờ một lần bằng lam máu cho đến ngày thứ 3 hoặc lâu hơn (nếu cần thiết) cho đến khi sạch KST thể hiện bằng hai lam máu liên tiếp âm tính

Mỗi ngày tái khám, bệnh nhân được phỏng vấn và khám lâm sàng lấy các mẫu máu đầu ngón tay (giọt mỏng và giọt dày), nhuộm Giemsa và soi kính hiển vi để phát hiện KST và đếm mật độ

Ngày 7, 14, 21, 28, 35, 42

Vào những ngày theo dõi bệnh nhân được yêu cầu quay lại trạm y tế khám hoặc nhân viên y tế đến khám tại nhà, bệnh nhân sẽ được phỏng vấn và khám lâm sàng, thu thập mẫu máu đầu ngón tay (giọt mỏng và giọt dày),

nhuộm Giemsa và soi kính hiển vi để phát hiện KST và mật độ

Bệnh nhân được yêu cầu quay lại trạm y tế khám vào bất kỳ thời gian nào trong thời gian theo dõi nếu có bất kỳ dấu hiệu nào của bệnh SR (ví dụ: sốt, đau đầu…) hoặc có bất kỳ dấu hiệu nào của bệnh như sốt, xuất hiện các dấu hiệu nguy hiểm (không uống được hoặc không bú được, nôn mửa nặng,

co giật, hôn mê bất tỉnh, không có khả năng đứng, ngồi, khó thở) hoặc trong trường hợp mắc các bệnh khác

Quy trình xét nghiệm và đánh giá

 Soi kính hiển vi

Lam máu được lấy tại thời điểm sàng lọc, tiêu bản được nhuộm nhanh

(10% Giemsa trong 15 phút) để xác định sự có mặt của thể tư dưỡng P vivax

với MĐKST ≥ 250 KST/µl Các lam máu của các bệnh nhân tham gia nghiên cứu và các ngày theo dõi được nhuộm với nồng độ Giemsa 3% trong 45 phút Các lam máu được soi tại vật kính dầu có độ phóng đại 100x

Nhiễm phối hợp: 100 vi trường của tiêu bản giọt đặc được đếm để loại

trừ nhiễm phối hợp Trong trường hợp nghi ngờ, tiêu bản giọt mỏng được sử dụng để xác nhận Nếu các lam máu của ngày theo dõi không có sự hiện diện của nhiễm phối hợp, bệnh nhân sẽ được giữ lại để theo dõi

MĐKST: được xác định bằng số lượng KST đếm được trên 200 bạch cầu

đếm trên máy đếm tay MĐKST là số lượng KST thể vô tính/µl máu, được tính dựa trên số lượng KST thể vô tính trên số lượng bạch cầu đếm được và được hiệu chỉnh dựa trên số lượng bạch cầu ước tính (8.000 bạch cầu/µl máu)

MĐKSTSR/µl = Số lượng KSTSR đếm được x 8.000

Số lượng bạch cầu đếm được

Trong đó, 8.000 là số lượng bạch cầu ước tính

Khi số lượng KST thể vô tính đếm được nhỏ hơn 10 trên 200 bạch cầu trên lam máu theo dõi, số lượng KST phải được tiếp tục đếm cho đến khi số lượng bạch cầu đạt được ít nhất là 500 bạch cầu (vi trường đầy đủ mà tại đó

500 bạch cầu được đếm) Lam máu được coi là âm tính khi số lượng bạch cầu đếm được là 1.000 mà không có sự hiện diện của KST thể vô tính

 Thể tư dưỡng: Số lượng KST thể tư dưỡng được đếm ở tất cả các lam máu dương tính từ ngày D0 và vào ngày KST xuất hiện trở lại so với 200 bạch cầu trên mỗi lam máu Chỉ những bệnh nhân nào có MĐKST thể nhẫn non đạt

từ ˃ 65% trở lên mới được đưa vào nuôi cấy đánh giá sự nhạy cảm của KST với thuốc

 Giao bào: số lượng giao bào được tính dựa trên số lượng giao bào đếm được trên 500 bạch cầu

Tất cả các lam máu phải được đọc bởi hai kỹ thuật viên có kinh nghiệm theo phương pháp mù đôi để xác định thời gian sạch KST Trong trường hợp kết quả soi lam không phù hợp (khác nhau về kết quả chủng KST, MĐKST sai khác hơn 25%), lam máu phải được đọc lại bởi kỹ thuật viên thứ ba Kết quả cuối cùng của MĐKST được tính bằng trung bình cộng của hai kết quả gần nhau nhất

 Nồng độ Heamoglobin: 5µl máu toàn phần được lấy vào cuvette,

nồng độ heamoglobin được đo bằng máy Hemocue vào ngày D0

2.2.6.2 Thử nghiệm in vitro

Các mẫu máu nhiễm P.vivax đơn thuần có MĐKST thể nhẫn non >

65% được đưa vào nuôi cấy đánh giá sự nhạy cảm của KST với thuốc SR [49]

- Chuẩn bị phiến nhựa gắn thuốc

Các phiến nhựa được gắn các thuốc SR với các nồng độ thuốc khác nhau theo nguyên tắc giảm ½ nồng độ Giếng A có nồng độ thuốc cao nhất, giếng G có nồng độ thuốc thấp nhất, giếng H là giếng chứng (không có thuốc):

Nồng độ của thuốc QN là: (A)1.600 nM/L  (B)800 nM/L  (C)400 nM/L  (D)200 nM/L  (E)100 nM/L  (F)50 nM/L  (G)25 nM/L;

Nồng độ thuốc DHA là: (A)32,0 nM/L  (B)16,0 nM/L  (C)8,0 nM/L

 (D)4,0 nM/L  (E)2,0 nM/L  (F)1,0 nM/L  (G)0,5 nM/L;

Nồng độ thuốc CQ là: (A)800 nM/L  (B)400 nM/L  (C)200 nM/L

(D)100 nM/L  (E)50 nM/L  (F)25 nM/L  (G)12,5 nM/L;

Nồng độ thuốc PQ là: (A)400 nM/L  (B)200 nM/L  (C)100 nM/L  (D)50 nM/L  (E)25 nM/L  (F)12,5 nM/L  (G)6,25 nM/L

Hình 2 Sơ đồ nồng độ thuốc gắn trên phiến nhựa 96 giếng

Các phiến nhựa đã gắn thuốc được bảo quản ở 2 - 8oC, bọc kín bằng giấy bạc

- Chuẩn bị hóa chất, môi trường, nguyên vật liệu trước nuôi cấy

Các dung dịch dùng cho nuôi cấy được bảo quản trong ngăn mát tủ lạnh và huyết thanh bảo quản tại ngăn đá được lấy ra cho vào tủ ấm 37oC để

rã đông hoàn toàn rồi chuyển ra tủ an toàn sinh học Lấy 5,6mL dung dịch McCoy 2,8µl dung dịch Gentamycin, 56µl dung dịch Glucose 20%, 1,4mL dung dịch huyết thanh AB cho vào ống Falcon 15mL, trộn đều để được môi