Nghiên cứu ứng dụng enzym tanase để thuỷ phân tanin và thử nghiệm lên men rượu vang từ dịch ép quả điều

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ --- VÕ THỊ THU GIANG NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG ENZYM TANASE ĐỂ THỦY PHÂN TANIN VÀ THỬ NGHI

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC

VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

-

VÕ THỊ THU GIANG

NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG ENZYM TANASE ĐỂ THỦY PHÂN TANIN

VÀ THỬ NGHIỆM LÊN MEN RƯỢU VANG TỪ DỊCH ÉP QUẢ ĐIỀU

LUẬN VĂN THẠC SĨ: SINH HỌC

TP Hồ Chí Minh - 2019

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC

VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

-

VÕ THỊ THU GIANG

NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG ENZYM TANASE ĐỂ THỦY PHÂN TANIN

VÀ THỬ NGHIỆM LÊN MEN RƯỢU VANG TỪ DỊCH ÉP QUẢ ĐIỀU

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

Mã số: 8420114

LUẬN VĂN THẠC SĨ: SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC :

Hướng dẫn 1: TS NGUYỄN VĂN KHOA Hướng dẫn 2: TS: LÊ THỊ ÁNH HỒNG

TP Hồ Chí Minh - 2019

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đề tài luận văn thạc sĩ: “Nghiên cứu ứng dụng enzym tanase để thủy phân tanin và thử nghiệm lên men rượu vang từ dịch ép quả điều” là do tôi thực hiện với sự đồng ý và hướng dẫn nhiệt tình của thầy

TS Nguyễn Văn Khoa và cô TS Lê Thị Ánh Hồng Đây không phải là bản sao chép của bất kì một cá nhân, tổ chức nào Các kết quả thực nghiệm, số liệu, nguồn thông tin trong luận văn là do tôi tiến hành, trích dẫn, tính toán và đánh giá

Tôi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm về những nội dung mà tôi đã trình bày ở luận văn này

TP Hồ Chí Minh, tháng 11 năm 2019

Người cam đoan

Võ Thị Thu Giang

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin gửi lời biết ơn sâu sắc đến thầy TS Nguyễn Văn Khoa và cô TS

Lê Thị Ánh Hồng đã dành rất nhiều thời gian, tâm huyết hướng dẫn nghiên cứu

và giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn tốt nghiệp

Chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Viện Sinh học nhiệt đới và Viện Công nghệ Hóa học, thầy cô giảng viên và Học viện Khoa học và Công nghệ đã tạo điều kiện thuận lợi nhất để tôi hoàn thành khóa học

Tôi xin cảm ơn đến tất cả bạn bè, đồng nghiệp, những người luôn động viên và giúp đỡ tôi vượt qua những khó khăn trong quá trình học tập, làm việc

và nghiên cứu

Và cuối cùng, tôi xin dành những tình cảm trân trọng nhất cho những người thân trong gia đình đã luôn động viên và giúp tôi vượt qua những khó khăn trong quá trình học tập, làm việc và nghiên cứu

Võ Thị Thu Giang

DANH MỤC KÝ HIỆU CÁC CHỮ VIẾT TẮT

NN&PTNT: Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn

(Food and Agriculture Organization of the United Nations)

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1: Một số thành phần dinh dưỡng ở quả điều……… 9

Bảng 2.1: Một số thành phần dinh dưỡng ở dịch ép quả điều 27

Bảng 2.2: Khảo sát ảnh hưởng của pH và nhiệt độ của dịch ép quả điều đến hoạt tính của enzym tanase 27

Bảng 2.3: Khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng enzym tanase 28

Bảng 2.4: Khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng gelatin đến quá trình tách loại tanin trong dịch ép quả điều 29

Bảng 2.5: Lựa chọn môi trường nhân giống nấm men 30

Bảng 2.6: Giá trị thay đổi của các thông số trong quá trình lên men chính 31

Bảng 2.7: Thiết kế thí nghiệm CCD để tối ưu hóa quá trình lên men chính ở dịch ép quả điều 32

Bảng 2.8: Kết quả xây dựng đường chuẩn axit gallic 33

Bảng 2.9: Điểm trung bình và hệ số trọng lượng 37

Bảng 2.10: Bảng điểm chất lượng của sản phẩm 38

Bảng 3.1: Một số các chỉ tiêu dinh dưỡng trong dịch ép quả điều ban đầu 40

Bảng 3.2: Ảnh hưởng của pH và nhiệt độ đến quá trình thủy phân tanin bằng enzym tanase trong thời gian 30 phút 42

Bảng 3.3: Ảnh hưởng của hàm lượng enzym tanase đến tách loại tanin 43

Bảng 3.4: Một số thành phần dinh dưỡng ở dịch quả điều sau quá trình tách loại tanin 47

Bảng 3.5: Kết quả phân tích ANOVA đến quá trình hình thành cồn trong lên men chính 54

Bảng 3.6: Tác động các yếu tố đến quá trình hình thành độ cồn theo phần mềm JMP 55

Bảng 3.7: Kết quả kiểm tra thực nghiệm từ thông số của 58 Bảng 3.8: Kết quả một số chỉ tiêu ở sản phẩm rượu vang điều 60 Bảng 3.9: Kết quả kiểm tra các chỉ tiêu vi sinh vật ở rượu vang điều 60

DANH MỤC HÌNH ẢNH, SƠ ĐỒ

Hình 1.1: Cây điều 3

Hình 1.2: Khu vực trồng điều trên thế giới 5

Hình 1.3: Đóng góp của các nước đối với sản lượng điều thế giới năm 6

Hình 1.4: Thị trường xuất khẩu hạt điều của Việt Nam 6

Hình 1.5: Quả điều 8

Hình 1.6: Quả điều bị vứt bỏ khi đến mùa thu hoạch 8

Hình 1.7: Phản ứng thủy phân ellagitanin 11

Hình 1.8: Phản ứng thủy phân gallotanin 11

Hình 1.9: Cấu trúc của các flavonoic 12

Hình 1.10: Phản ứng xúc tác thủy phân ở enzym tanase 13

Hình 2.1: Quá trình ép quả điều bằng máy ép trục vít………24

Hình 3.1: Hiệu quả tách loại tanin bằng gelatin ở các nồng độ khác nhau….45 Hình 3.2: Hiệu quả tách loại tanin bằng gelatin ở các nhiệt độ khác nhau 46

Hình 3.3: Dịch ép quả điều trước và sau xử lý bằng enzyme tanase và gelatin 48

Hình 3.4: Đường cong sinh trưởng của nấm men Saccharomyces cerevisiae K1 V1116 (S1) 49

Hình 3.5: Đường cong sinh trưởng của nấm men Saccharomyces uvarum 664 (S2) 49

Hình 3.6: Sự biến thiên oBrix 51

Hình 3.7: Sự biến thiên độ cồn 51

Hình 3.8: Sự biến đổi hàm lượng axit tổng số trong quá trình lên men chính 52

Hình 3.9: Sự biến đổi giá trị pH trong quá trình lên men chính 52

Hình 3.10: Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của 3 yếu tố khảo sát đến độ cồn tạo thành trong không gian 3 chiều 55 Hình 3.11: Kết quả tối ưu hóa ba yếu tố ảnh hưởng theo phần mềm JMP 56 Hình 3.12: Kết quả các chỉ tiêu theo dõi trong quá trình lên men 58 Hình 3.13: Rượu vang điều 59

Sơ đồ 3.1: Giản đồ phân tích HPLC xác định axit gallic trong dịch ép quả điều trước và sau khi thủy phân bằng enzym tanase 44

Sơ đồ 3.2: Quy trình sản xuất rượu vang điều……….61

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN

LỜI CẢM ƠN

BẢNG KÝ HIỆU CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC BẢNG

DANH MỤC HÌNH ẢN, SƠ ĐỒ

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 CÂY ĐIỀU 3

1.1.1 Khái quát về cây điều 3

1.1.2 Tình hình sản xuất, chế biến và tiêu thụ hạt điều 5

2 QUẢ ĐIỀU 7

1.3 TANIN 10

1.3.1 Định nghĩa 10

1.3.2 Phân loại và cấu trúc 10

1.4 ENZYM TANASE 12

1.4.1 Định nghĩa và tính đặc hiệu 12

1.4.2 Thành phần cấu tạo và cơ chế xúc tác của enzym tanase 12

1.4.3 Ứng dụng và các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính enzym 13

1.5 GELATIN 14

1.5.1 Định nghĩa 14

1.5.2 Tính chất 14

1.5.3 Liên kết hóa học giữa gelatin và tanin 15

1.6 RƯỢU VANG 16

1.6.1 Giới thiệu chung về rượu vang 16

1.6.2 Phân loại rượu vang 16

1.6.3 Tình hình sản xuất rượu vang 18

1.6.3.1 Trên thế giới 18

1.6.3.2 Ở Việt Nam 18

1.6.4 Cơ chế lên men rượu vang 19

1.6.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men 20

1.6.5.1 Nấm men 20

1.6.5.2 Ảnh hưởng của pH 21

1.6.5.3 Ảnh hưởng của hàm lượng khí oxy 21

1.6.5.4 Ảnh hưởng của nhiệt độ 21

1.6.5.5 Ảnh hưởng của nồng độ đường 22

1.6.6.6 Ảnh hưởng của nồng độ etanol 22

1.6.6.7 Ảnh hưởng của thời gian lên men 22

1.6.6.8 Ảnh hưởng của CO2 23

Chương 2: NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24

2.1 THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU 24

2.1.1 Thời gian 24

2.1.2 Địa điểm 24

2.2 NGUYÊN VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 24

2.2.1 Dịch ép quả điều 24

2.2.2 Enzym tanase 24

2.2.3 Gelatin 25

2.2.4 Vi sinh vật 25

2.3 MÔI TRƯỜNG, HÓA CHẤT, DỤNG CỤ VÀ THIẾT BỊ NGHIÊN

CỨU 25

2.3.1 Môi trường 25

2.3.2 Hóa chất 25

2.3.4 Dụng cụ và thiết bị 26

2.4 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 26

2.4.1 Xác định thành phần dinh dưỡng ở dịch ép quả điều ban đầu 26

2.4.2 Xác định sự ảnh hưởng của giá trị pH, nhiệt độ ở dịch ép quả điều và hàm lượng enzym tanase đến hiệu suất thủy phân tanin 26

2.4.3 Xác định sự ảnh hưởng của hàm lượng gelatin và nhiệt độ ở dịch ép quả điều đến hiệu suất tách loại tanin 28

2.4.5 Khảo sát môi trường nuôi cấy và xác định chủng nấm men thích hợp cho quá trình lên men dịch ép quả điều 29

2.4.6 Xác định điều kiện tối ưu hóa trong quá trình lên men rượu vang điều 30

2.4.7 Xây dựng quy trình lên men rượu vang điều 32

2.5 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 32

2.5.1 Xác định hàm lượng tanin theo phương pháp Lowenthal 32

2.5.2 Xác định hàm lượng polyphenol 33

2.5.3 Khả năng bắt gốc tự do theo DPPH (2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl) 34

2.4.4 Xác định năng lực khử 34

2.5.5 Xác định hiệu suất tách loại tanin 35

2.5.6 Xác định hàm lượng chất khô hòa tan (oBrix) 35

2.5.7 Xác định pH 35

2.5.8 Xác định hàm lượng axit tổng số 35

2.5.9 Xác định tế bào nấm men bằng buồng đếm hồng cầu 36

2.5.10 Xác định độ cồn trong rượu 36

2.5.11 Đánh giá cảm quan 37

2.5.12 Xử lí số liệu 38

Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 39

3.1 MỘT SỐ CHỈ TIÊU DINH DƯỠNG TRONG DỊCH ÉP QUẢ ĐIỀU BAN ĐẦU 39

3.2 KHẢO SÁT THỦY PHÂN TANIN BẰNG ENZYM TANASE 41

3.3 KẾT QUẢ KHẢO SÁT TÁCH LOẠI TANIN BẰNG GELATIN 45

3.4 MỘT SỐ THÀNH PHẦN DINH DƯỠNG TRONG DỊCH ÉP QUẢ ĐIỀU SAU XỬ LÝ 47

3.5 KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY VÀ NẤM MEN THÍCH HỢP CHO QUÁ TRÌNH LÊN MEN 48

3.5.1 Kết quả xác định môi trường và thời điểm dừng ở quá trình nhân giống nấm men 48

3.5.2 Kết quả lựa chọn nấm men để lên men rượu vang điều 50

3.6 TỐI ƯU HÓA ĐIỀU KIỆN LÊN MEN 54

3.7 XÂY DỰNG QUY TRÌNH SẢN XUẤT RƯỢU VANG ĐIỀU 59

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGH 61

KẾT LUẬN 62

KIẾN NGHỊ 63

TÀI LIỆU THAM KHẢO 64

PHỤ LỤC 71

MỞ ĐẦU

Cây điều (đào lộn hột) có tên khoa học Anacardium occidentale, là cây

trồng sinh trưởng và phát triển tốt ở những quốc gia thuộc khu vực cận xích đạo, nơi có nhiệt độ và độ ẩm cao Ở Việt Nam, điều là cây kinh tế vườn quan trọng trong cơ cấu cây trồng của các tỉnh phía Nam như: Bình Phước, Đồng Nai, Bà Rịa - Vũng Tàu, Bình Thuận, Gia Lai, Bình Định với tổng diện tích thu hoạch hơn 300 nghìn hecta [1] Theo ước tính năm 2017, lần đầu tiên nước

ta vươn lên là nước xuất khẩu hạt điều đứng đầu thế giới với tổng sản lượng xuất khẩu đạt hơn 360 nghìn tấn hạt điều và giá trị đạt hơn 3 tỷ đô la Mỹ [2]

Quả điều gồm hạt điều và cuống điều (hay còn gọi là quả điều giả, trong dân gian gọi là quả điều, ở đề tài này cũng gọi là quả điều) Theo các nghiên cứu tại Ấn Độ, Brasil, Nigeria hàm lượng vitamin C trong dịch ép quả điều đạt tới

219 mg/100mL cao gấp 5 lần cam, 12 lần so với dứa [3,4] Dịch ép quả điều còn chứa hàm lượng cao các hợp chất tanin, polyphenol là các hợp chất kháng oxy hóa tự nhiên rất có lợi cho sức khỏe giúp ngăn ngừa ung thư và phòng chống các vi khuẩn gây viêm dạ dày [3] Thế nhưng khi đến mùa thu hoạch hạt điều được giữ lại để chế biến, quả điều bị vứt bỏ, nguyên nhân do chứa hàm lượng tanin (250-470 mg/100mL) cao gây chát, sít lưỡi và khô rát vòm họng khi sử dụng Theo thống kê, cứ khoảng 8-10 tấn quả điều sẽ thu về khoảng 1 tấn hạt điều thô, như vậy lượng quả điều đang bị bỏ hiện nay của nước ta ước khoảng 2,5-3 triệu tấn [5]

Quả điều rất giàu dinh dưỡng, có khả năng kháng oxy hóa cao là bạn của sức khỏe, nhưng đang bị vứt bỏ vừa gây ô nhiễm môi trường, vừa lãng phí Nếu loại bỏ được vị chát tận dụng được nguồn nguyên liệu quả điều, mang nhiều ý nghĩa to lớn Theo các nghiên cứu trước đây, để tách loại hàm lượng tanin thường sử dụng gelatin, casein, lòng trắng trứng, tinh bột gạo, tinh bột sắn… nhằm tạo kết tủa protein-tanin loại ra khỏi dung dịch [4] Phương pháp truyền

vitamin B, C có trong dịch quả điều Đồng thời tanin cũng là một polyphenol hữu ích bị loại hẳn ra khỏi dịch ép, làm giảm hàm lượng polyphenol hữu ích và

khả năng kháng oxy hóa của dịch ép quả điều ban đầu Dịch ép sau xử lý thu được chế biến các loại đồ uống như: nước giải khát, nước lên men, vẫn còn vị quá chát và sít lưỡi Do vậy, ở nước ta vẫn chưa có nơi nào sản xuất rượu/nước uống dinh dưỡng từ dịch ép quả điều Ngược lại các loại nước uống được lên men từ các loại quả cho độ cồn nhẹ, hương vị thơm tự nhiên, tốt cho sức khỏe như: kích thích tiêu hóa, giảm stress…thì đang được ưa chuộng và mang lại nhiều giá trị kinh tế

Từ lý do trên đề tài: “Nghiên cứu ứng dụng enzym tanase để thủy phân tanin và thử nghiệm lên men rượu vang từ dịch ép quả điều” được thực hiện

nhằm mục đích nghiên cứu sử dụng kết hợp giữa enzym tanase và gelatin để

xử lý tách loại tanin hiệu quả, giảm vị quá chát và tăng hàm lượng polyphenol

ở dịch sau xử lý, nhằm làm nguồn nguyên liệu bổ dưỡng tạo ra đặc sản của địa phương, giảm ô nhiễm môi trường và tăng thu nhập cho người nông dân

* Mục tiêu đề tài

Xác định điều kiện tối ưu của enzym tanase và gelatin trong quá trình thủy phân và tách loại tanin đạt hiệu suất cao nhất nhưng vẫn giữ được dinh

dưỡng trong dịch ép quả điều

Xây dựng quy trình sản xuất rượu vang điều từ dịch ép quả điều sau khi tách loại tanin

* Ý nghĩa khoa học

Sử dụng enzym tanase để thủy phân tanin thủy phân trong dịch ép quả điều là nghiên cứu rất mới, vẫn chưa có công trình nghiên cứu nào ở Việt Nam

và thế giới sử dụng enzym này cho dịch ép điều

Sử dụng kết hợp phương pháp sinh hóa (enzym tanase và gelatin) đã xử

lý tanin hiệu quả cao, giảm vị chát nhưng vẫn giữ được hàm lượng dinh dưỡng trong dịch quả điều

Chi: Đào lộn hột (Anacardium)

Loài: Đào lộn hột (Anacardium occidental)

Cây điều (hình 1.1) có tên khoa học là Anacardium occidentale Linn.,

còn được gọi là cây đào lộn hột có nguồn gốc từ Brasil-khu vực Nam Mỹ Cây

có đặc tính gỗ tốt, gây hiệu ứng cảnh quan Quả có chứa các thành phần dinh dưỡng tốt cho sức khỏe con người (vitamin, khoáng, hàm lượng polyphenol, )

và có thể ăn được nên nhanh chóng được phổ biến rộng rãi trên khắp thế giới

Điều là cây công nghiệp lâu năm có tuổi thọ lên tới 40 năm tuổi; cây thường cho năng suất ổn định trong giai đoạn từ 10 đến 20 năm sau khi trồng Cây điều có thể sinh trưởng và phát triển từ vĩ độ 25o Bắc đến 25o Nam nhưng vùng sản xuất chủ yếu từ vĩ độ 15o Bắc đến 15o Nam Độ cao so với mặt nước biển của vùng đất trồng phụ thuộc vào vĩ độ, địa hình và vùng khí hậu nhưng thích hợp nhất là dưới 600 m so với mặt nước biển Độ dài ngày và thời gian chiếu sáng không ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển, cây có thể sống

từ 5-45oC nhưng nhiệt độ trung bình thích hợp nhất là khoảng 27oC Đồng thời cây điều thích nghi với lượng mưa hàng năm biến động từ 400-5000 mm, thích hợp nhất là 1000-2000 mm và ở cây cần ít nhất 2 tháng khô hạn hoàn toàn để phân hóa mầm hoa Độ ẩm tương đối ít ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển ở cây điều, tuy nhiên nếu độ ẩm quá cao trong thời kỳ ra hoa có thể làm gia tăng bệnh thán thư ở cây do bọ xít và muỗi gây ra Trong khi đó độ ẩm

tương đối thấp kết hợp với gió nóng sẽ gây khô bông và rụng quả non Đất trồng cây điều thích hợp nhất là các loại đất giàu chất hữu cơ, pH từ 6,3-7,3 không thích hợp với các loại đất ngập úng, nhiễm phèn, mặn, hay đất có tầng canh tác mỏng [6]

Cây điều phát triển tốt ở những nơi có ánh sáng mạnh, thân cao khoảng

từ 3-8 m, trong điều kiện sinh trưởng tốt cây có thể cao tới 10 m Thân và cành cây thường có nhiều mủ, cành thường phát sinh theo chiều ngang, tán cây có dạng hình dù Rễ cây điều thuộc loại rễ cọc, các rễ ngang phát triển mạnh, ăn sâu vào trong đất để tìm kiếm chất dinh dưỡng Khi trồng nơi đất tơi xốp thì chỉ cần sau 2 đến 3 tháng, cây có thể cắm sâu xuống 80 cm, sau khi trồng được

5 tháng, rễ cây ăn sâu vào đất tới 2 m Tùy vào loại đất và khả năng sinh trưởng của cây, bộ rễ có thể ăn sâu hàng chục mét Vì vậy mà cây có khả năng chịu hạn rất tốt, có thể sinh trưởng bình thường trong mùa khô từ 5-6 tháng Bộ lá ở cây thường tập trung ở đầu cành, lá thường có chiều dài từ 10-20 cm, chiều rộng từ 5-10 cm, cuống lá ngắn Phiến lá khá dày với những đường gân nổi rõ đặc biệt là mặt dưới, khi còn non lá điều thường có màu đỏ hoặc hơi xanh nhạt, khi già lá chuyển sang màu xanh đậm Bộ tán của cây điều thường rất rộng, khi

cây trưởng thành thì bộ tán có thể rộng đến 5 m tính từ gốc [6]

Cây điều thường ra hoa vào lúc kết thúc mùa mưa chuẩn bị chuyển sang mùa khô Hoa điều có cả hoa đơn tính và hoa lưỡng tính, mọc thành từng chùm,

số lượng hoa mỗi chùm có khoảng từ vài chục hoặc hàng trăm Hoa điều thường

có màu vàng hoặc trắng có 5 cánh, đối với hoa đực chỉ có nhị đực còn hoa lưỡng tính thì có tới 8 đến 10 nhị đực và 1 nhụy cái Thông thường thì chỉ có 1 nhị đực ở hoa lưỡng tính phát triển đầy đủ các chức năng và có khả năng tung phấn Hoa điều thường mọc ở đầu cành, bao gồm cả hoa đực lẫn hoa lưỡng tính Hoa thường chỉ thụ phấn bằng côn trùng hoặc gió, nở vào buổi sáng nhưng trong lúc hoa đang nở có xuất hiện mưa thì bao phấn sẽ không thể nứt ra để phấn rớt vào nên quá trình thụ phấn sẽ không xảy ra khiến mất mùa Cây điều sau 2-3 năm trồng mới thì bắt đầu trổ hoa, thời gian ra hoa thường kéo dài khoảng 3 tháng [6]

1.1.2 Tình hình sản xuất, chế biến và tiêu thụ hạt điều

+ Trên thế giới [7]:

Hình 1.2: Khu vực trồng điều trên thế giới

(Nguồn: Various trade and government, 2016)

Trong những năm gần đây, hạt điều đã qua chế biến trở thành mặt hàng cao cấp ngày càng được ưa chuộng và tiêu thụ mạnh trên khắp thế giới như:

Mỹ, Anh, Pháp, Nhật Bản, Theo thống kê của FAO, hiện nay có 32 quốc gia trồng điều với tổng sản lượng hạt điều thô trên toàn thế giới từ 1.500-1.600 ngàn tấn Nhưng cây điều sinh trưởng và phát triển tốt ở những quốc gia thuộc khu vực nhiệt đới và cận nhiệt đới - nơi có nhiệt độ và độ ẩm cao, do vậy việc canh tác cây điều được phân bố chủ yếu ở các nước (hình 1.2): Ấn Độ, Brasil, Việt Nam, Thái Lan, Indonesia, Philippin, các nước ở Tây Phi và Đông Phi…

Sản lượng điều toàn cầu ở giai đoạn 2015-2016 đạt gần 3,25 triệu tấn hạt điều tươi Từ hình 1.3, có thể thấy rằng Tây Phi đứng đầu về sản lượng điều toàn cầu (45%), tiếp theo là Ấn Độ (22%), Việt Nam (12%), Đông Phi (9%) sau đó ở các nước: Brasil, Indonesia, Campuchia Trong số những quốc gia sản xuất và chế biến điều lớn nhất thế giới như: Ấn Độ, Brasil và Việt Nam… Việt Nam lần đầu tiên vươn lên là nước chế biến và xuất khẩu hạt điều đứng đầu thế giới, chiếm thị phần trên 60% tổng giá trị xuất khẩu hạt điều toàn cầu, xếp trên

cả Ấn Độ và Brasil Sản lượng chế biến đạt 1,65 triệu tấn hạt điều thô; xuất khẩu 391.000 tấn nhân điều, đạt kim ngạch xuất khẩu 3,52 tỷ USD, tăng 7,8%

về lượng so với năm 2017 Với năng lực chế biến lớn nước ta phải nhập khẩu điều thô từ các nước châu Phi, Campuchia… Trong đó các quốc gia thuộc khu vực châu Phi sản lượng điều chế biến rất ít, hơn 90% lượng điều thô của các

quốc gia thuộc khu vực này đều được xuất khẩu sang Việt Nam, Ấn Độ, Brasil Hiện nay các quốc gia châu Phi đang có nhiều nỗ lực nhằm gia tăng năng lực chế biến hạt điều

Theo số liệu của INC Global Statistics Review, nhu cầu về hạt điều nhân trên thế giới giai đoạn 2009-2016 khá cao khoảng 6,1%, trong khi sản lượng điều nhân thế giới giai đoạn 2005-2006 chỉ đáp ứng được khoảng ½ nhu cầu Nhu cầu tiêu thụ hạt điều chế biến qua nhiều thập niên ngày một gia tăng do ở hạt điều mang lại hàm lượng dinh dưỡng và năng lượng cao Cụ thể, các quốc gia có mức tăng trưởng tiêu thụ nhanh nhất gồm: Liên Bang Nga, các nước Trung Đông và Canada với lượng tiêu thụ điều nhân lần lượt là 15,6%, 8,7%

và 5,6%

Hình 1.3: Đóng góp của các nước đối với sản lượng điều thế giới năm

2015-2016 (nguồn: Various trade and government, 2016)

+ Ở Việt Nam

Hình 1.4: Thị trường xuất khẩu hạt điều của Việt Nam

(nguồn Bộ NN&PTNT, 2017)

Theo thống kê của Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn tổng diện tích trồng điều ở nước ta khoảng 337 nghìn hecta Trong đó tỉnh Bình Phước

có hơn 134 nghìn hecta đang được sử dụng canh tác điều, chiếm khoảng 40% diện tích trồng điều cả nước, cùng với đó là khoảng hơn 200 doanh nghiệp và

400 hộ kinh doanh tham gia vào khâu chế biến và xuất khẩu hạt điều Điều đó làm cho tỉnh này trở thành “thủ phủ” điều của cả nước [8]

Theo Tổng Cục Hải Quan Việt Nam, kết quả thống kê giá trị xuất khẩu hạt điều của Việt Nam tăng qua các năm Cụ thể, giá trị xuất khẩu năm 2007 đạt 654 triệu USD, năm 2008 đạt 920 triệu Đến năm 2010, nước ta xuất khẩu 80.000 tấn hạt điều, đạt 1.136 triệu USD tăng đến 26% giá trị và 6% số lượng

so các năm trước Thống kê của FAO năm 2017, cả nước chế biến hơn 1,6 triệu tấn nguyên liệu nhưng nguồn cung trong nước chỉ đáp ứng được 220 nghìn tấn, phần còn lại phải nhập khẩu và doanh thu vượt mốc 3,5 tỷ USD/năm, lần đầu tiên vươn lên là nước xuất khẩu hạt điều lớn nhất thế giới Trong các năm gần đây Mỹ trở thành thị trường xuất khẩu lớn nhất chiếm 34% lượng điều xuất khẩu, theo sau là Trung Quốc (14%), Hà Lan (13%), Úc, Anh, Canada và một

số nước khác (hình 1.4) Theo Hiệp Hội Điều Việt Nam, nước ta được dự đoán

sẽ có doanh thu xuất khẩu điều liên tục tăng trong những năm tới đây [2]

2 QUẢ ĐIỀU

Ở cây điều sau khi hoa được thụ phấn thành công thì quả thật (hạt điều)

sẽ phát triển kích thước rất nhanh trong vòng 1,5 tháng đạt kích thước tối đa

Từ đó quả ngừng phát triển chuyển sang phình to phần cuống quả tạo thành quả giả, ở quả điều thường có hai phần là quả giả và quả thật (hình 1.5)

Quả thật (gọi là hạt điều) thường chỉ chiếm 10-15% khối lượng quả Hạt điều thường có dạng hình hạt đậu lớn, lớp vỏ ngoài thường có màu xám xanh khi còn tươi và sau quá trình phơi khô sẽ chuyển sang màu nâu Hạt điều thường nhẵn có trọng lượng từ 3-5 g, để lấy được nhân hạt điều cần loại bỏ lớp vỏ hạt (lớp vỏ hạt này thường chiếm tới 70% khối lượng hạt và có vỏ dày đến 2,5-3 mm), vỏ hạt cũng được chia làm 4 phần để bao bọc lấy nhân Ngoài cùng là vỏ ngoài rất dai và cứng, tiếp đến là vỏ giữa khá xốp, vỏ giữa thường chiếm 30% trọng lượng vỏ, đây là phần chứa dầu của hạt điều Để lấy được nhân điều chúng

ta cần loại bỏ lớp vỏ này nhưng nó có chứa chất urushion rất độc với da người Cuối cùng là vỏ trong rất cứng sau đó mới đến lớp vỏ lụa mỏng bên ngoài bao bọc lấy phần nhân màu trắng Nhân điều có chứa nhiều dầu, chất béo, có hương

vị thơm ngon, vị bùi béo nên được sử dụng nhiều trong việc chế biến các loại thực phẩm giàu dinh dưỡng [9]

Quả giả (thường gọi là quả điều) chiếm trọng lượng rất lớn từ 85-90% khối lượng toàn quả, có dạng hình quả lê, khi chín thường có màu hồng hoặc màu vàng, chiều dài khoảng 3-20 cm, chiều rộng từ 3-12 cm trọng lượng thường

từ 30-50 g Ở quả điều chứa rất giàu đường (glucose, fructose), vitamin, khoáng

và một số axit amin, phenolic, axit hữu cơ, chất chống oxy hóa và được xem như nguồn cung cấp năng lượng (bảng 1.1) Tuy nhiên ở quả chứa nhiều hàm lượng tanin gây vị chát gắt, se khít vòm họng khi sử dụng nên sau thu hoạch hạt điều hầu hết quả điều bị vứt bỏ (hình 1.6) [9]

Hình 1.5: Quả điều

Hình 1.6: Quả điều bị vứt bỏ khi đến mùa thu hoạch

Bảng 1.1: Một số thành phần dinh dưỡng ở quả điều [4]

5 Axit gallic, axit protocatechuic,

lutein, zeinoxanthin, b-cryptoxanthin mg/100mL 215-412

6 Polyphenol

Tanin g/100mL 0,22-0,58 Carotene mg/100g 0,03-0,74

7 Axit tự nhiên axit mallic, axit citric, axit lactic g/100mL 0,1-0,36

9 Tổng chất khô hòa tan o Brix 7,4-12,8

Ở một số nước đã tận dụng quả điều để tạo ra các sản phẩm có ích nhưng vẫn còn vị chát, mang lại giá trị kinh tế chưa cao như:

+ Ở Venezuela, quả được dùng làm thực phẩm như: ăn tươi, sử dụng trong các tiệc cocktail quả nhiệt đới nhằm giúp làm tăng hàm lượng vitamin C [10] + Các loại mứt được chế biến từ quả điều nổi tiếng ở Brasil như: doce emcalda (trái hầm nhừ trong xiro), doce (giống doce emcalda nhưng ở dạng cô đặc), caju cristalizado (thịt trái đông lạnh tạo hình viên bi và được bao đường bên ngoài), caju ameixa (trái được nấu và cô đặc đến khô trong xiro) và thạch Ngoài ra dịch quả được bổ sung mật ong để tạo thành loại nước ép từ quả điều Theo nghiên cứu về tính ổn định của sản phẩm, cho thấy sản phẩm đáp ứng tốt các giá trị cảm quan trong suốt thời hạn sử dụng và đáp ứng thị hiếu người tiêu

dùng Tuy nhiên hàm lượng vitamin C có phần giảm mạnh ở cuối quá trình bảo quản [10]

+ Tại Nigeria, 60% dịch điều được phối trộn với 40% nước ép cam cho sản phẩm có chất lượng về hương và vị rất tốt [11]

Ngoài việc được sử dụng làm thực phẩm, người dân đã sử dụng quả điều chín để diệt lăng quăng (bọ gậy) Nhiều công trình nghiên cứu cho thấy, chất axit có trong quả đã ngăn cản quá trình sinh lý của ấu trùng muỗi làm cho chúng

bị chết Ngoài ra dư lượng bã từ các ngành công nghiệp sản xuất nước ép quả điều được sử dụng như một dạng bột trái cây thay thế cho bột mì trong các công thức chế biến bánh quy Giá trị pH, hàm lượng chất xơ và protein có sự thay đổi đáng kể khi thay thế bằng bã quả điều và nhận được sự chấp nhận tốt từ phía người tiêu dùng Do đó, bã quả điều là một nguồn nguyên liệu giúp đa dạng hóa các loại bánh và bổ sung một nguồn chất dinh dưỡng phù hợp [12] 1.3 TANIN

1.3.1 Định nghĩa

Tanin hay tannoit là một hợp chất polyphenol có trong thực vật, có khả năng tạo liên kết bền vững với các protein và các hợp chất hữu cơ cao phân tử khác như: các amino axit, alkaloit Phân tử lượng tanin phần lớn nằm trong khoảng 500-5000 Da có trong vỏ, gỗ, lá và quả của những cây như: sồi, sú, vẹt,

thông, đước, chè…[13,14]

1.3.2 Phân loại và cấu trúc [15]

Cấu trúc hóa học của tanin rất phức tạp và không đồng nhất, tanin có thể chia làm 2 loại chính: tanin thủy phân (tanin pyrogallic) và tanin ngưng tụ (tanin pyrocatechic)

Tanin thủy phân là những este của gluxit, thường là D-glucose làm lõi trung tâm với một hay nhiều axit trihiđroxibenzen cacboxylic Khi thủy phân bằng axit hoặc bằng enzym tanase thì giải phóng ra glucose, hamamelose… phần không phải đường là các axit thường gặp như: axit gallic được nối với nhau theo dây nối dipeptid để tạo thành axit digallic, axit trigallic, axit ellagic, axit luteolic… Tanin thủy phân bao gồm: Ellagitanin (hình 1.7) và Gallotanin

(hình 1.8) Gallotanin là các tanin thủy phân đơn giản nhất có năm liên kết ester giống nhau được, liên kết với lõi đường glucose

Tanin ngưng tụ được tạo thành từ sự ngưng tụ các đơn vị flavan-3-ol hoặc flavan 3,4-diol (hình 1.9), được xem là các oligomer hoặc polymer chứa các đơn vị flavonoic (có thể chứa từ 2 đến 50 đơn vị flavonoic hoặc lớn hơn) gắn với nhau bằng liên kết cacbon-cacbon nên không dễ bị thủy phân Khi đó dưới tác dụng của axit hoặc enzym thì không bị thủy phân mà tạo thành chất

đỏ tanin hay phlobaphen Phlobaphen ít tan trong nước là sản phẩm của sự trùng hợp kèm theo oxy hóa, do đó tanin pyrocatechic còn được gọi là phlobatanin

Hình 1.7: Phản ứng thủy phân ellagitanin

1.4 ENZYM TANASE

1.4.1 Định nghĩa và tính đặc hiệu [16]

Enzym tanase hay còn gọi là acyl tanin hydrolase (EC 3.1.1.20) là một enzym thủy phân hoạt động trên nguồn cơ chất là tanin, có khối lượng phân tử khoảng 150 kDa đến 300 kDa tùy thuộc vào nguồn enzym

Đặc hiệu phản ứng: enzym tanase chỉ có khả năng xúc tác cho phản ứng

phân cắt tanin thủy phân tạo thành chất chính là axit gallic

Đặc hiệu cơ chất: enzym tanase chỉ lựa chọn tanin làm cơ chất trong phản

ứng xúc tác

1.4.2 Thành phần cấu tạo và cơ chế xúc tác của enzym tanase [17]

chủ yếu là gallate Cũng như protein, enzym có thể là protein đơn giản hoặc protein phức tạp Trên cơ sở đó phân enzym thành hai nhóm: enzym một thành phần (enzym một cấu tử) và enzym hai thành phần (enzym hai cấu tử)

Phần protein của enzym hai thành phần được gọi là apoprotein hay apoenenzym, còn phần không phải protein gọi là nhóm ngoại hoặc coenzym Phần không phải protein thường là những chất hữu cơ đặc hiệu có thể gắn chặt vào protein hoặc chỉ có thể lỏng lẻo và có thể tách khỏi phần protein khi cho thẩm thấu qua màng

Một phức hợp hoàn chỉnh gồm cả apoenzym và coenzym được gọi là haloenzym Trong đó coenzym trực tiếp tham gia phản ứng xúc tác, giữ vai trò quyết định kiểu phản ứng mà enzym xúc tác và làm tăng độ bền của apoenzym đối với các yếu tố gây biến tính Còn apoenzym có tác dụng nâng hoạt tính xúc tác của coenzym quá quyết định đặc hiệu của enzym

Cơ chế xúc tác của enzym tanase dựa theo thuyết của Michaelis-Menten

Flavan-3-ol Flavol-3,4-ol Catechin

Hình 1.9: Cấu trúc của các flavonoic

phát triển vào năm 1913, được biểu diễn bằng sơ đồ sau:

E + S  ES  ES*  EP  E + P

S*: Cơ chất hoạt hóa; P: Sản phẩm phản ứng (Product) Trước hết, tạo phức trung gian ES, trong phức hợp này do ảnh hưởng của enzym nên cơ chất được hoạt hóa, cấu tạo của cơ chất bị biến đổi, phân tử của

cơ chất bị phân cực, các electron được phân phối lại, do đó điện tích của cơ chất bị biến đổi Khi đó các liên kết bên trong trở nên lỏng lẻo hơn, năng lượng hoạt hóa giảm, tốc độ phản ứng tăng lên [16]

Enzym tanase xúc tác phản ứng phân cắt gallotanin tạo phản ứng xúc tác với b-1,2,3,4,6-pentagalloyl-O-D-glucopyranose tạo ra 5 phân tử axit gallic và một phân tử glucose (hình 1.10) Từ lâu, người ta đã ứng dụng tanase để thủy phân tanin giúp làm trong rượu vang, vì khi tanin bị oxy hóa bởi không khí sẽ làm tăng độ đục của rượu vang Ngoài ra sử dụng trong trà xanh tạo các axit gallic giúp tăng hoạt tính kháng oxy hóa [18]

Hình 1.10: Phản ứng xúc tác thủy phân ở enzym tanase

1.4.3 Ứng dụng và các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính enzym [17]

Enzym tanase được tìm thấy ứng dụng rộng rãi trong chế biến thực phẩm

và nước giải khát Hiện tại, hầu hết các ứng dụng thương mại của enzym tanase

là sản xuất chè hòa tan, nơi nó được sử dụng để loại bỏ các chất hòa tan trong nước, rượu vang, bia và cà phê có hương vị nước ngọt

Ngoài ra tanase có vai trò quan trọng khác trong ngành thực phẩm là

được sử dụng như chất nền để tổng hợp hóa học pyrogallol hoặc estate gallat, dùng làm chất bảo quản Axit gallic cũng được sử dụng trong tổng hợp enzym của gallit propyl, chủ yếu được sử dụng như chất chống oxy hóa trong chất béo

và dầu cũng như trong đồ uống

Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động của enzym:

Ảnh hưởng của nhiệt độ: nhiệt độ là yếu tố quan trọng nhất ảnh hưởng đến hoạt tính enzym Do bản chất hóa học của enzym là protein nên không bền

ở nhiệt độ cao bị mất hoạt tính ở nhiệt độ lớn hơn 70oC Ở nhiệt độ thấp, enzym không bị mất hoạt tính mà chỉ giảm hoạt tính, khi nâng nhiệt độ trở lại nhiệt độ tối ưu thì enzym lại hoạt động bình thường Khi tăng nhiệt độ phản ứng lên

10oC thì tốc độ phản ứng tăng lên 2 lần cho đến 50oC enzym bị giảm hoạt tính

Ảnh hưởng của pH: Hoạt tính của enzym phụ thuộc chặt chẽ vào pH của môi trường Phần lớn các enzym hoạt động khoảng pH= 4-9, trong đó trị số pH

mà tại đó enzym hoạt động mạnh nhất được gọi là pH tối ưu Các enzym khác nhau thường có pH tối thích không giống nhau, nó thay đổi tùy theo bản chất hóa học, nồng độ cơ chất, nhiệt độ phản ứng và tính chất dung dịch đệm

Ngoài ra hoạt tính xúc tác của enzym còn phụ thuộc vào sự có mặt của các chất trong môi trường: chất hoạt hóa, chất kìm hãm và thời gian…

1.5 GELATIN

1.5.1 Định nghĩa

Gelatin là một protein được tạo bởi sự liên của hai hay nhiều axit amin sắp xếp trên một chuỗi đường thẳng đây là hỗn hợp dị thể của các sợi polypeptit sợi đơn và sợi đa Mỗi sợi có cấu hình proline xoắn ốc bên trái, chứa từ 300-

400 amino axit, hầu hết gelatin thương mại có khối lượng phân tử từ 250.000 đvc [19]

15.000-1.5.2 Tính chất

Hoạt tính của gelatin phụ thuộc vào pH, nhiệt độ, nồng độ, thời gian và phương pháp chế biến Gelatin thương mại ở dạng tinh khiết, không mùi, không

vị, cứng, giòn, màu vàng rất nhạt đến hổ phách, có độ ẩm từ 9-12% và tỉ trọng 1,3-1,4

Tính chất gel-độ bền gel: đây là yếu tố quan trọng đánh giá chất lượng gelatin khi đông, khả năng tạo gel được đặc trưng bằng độ Bloom Độ Bloom

là khối lượng tính bằng gram cần thiết tác dụng lên bề mặt gel tạo bởi ống có đường kính 14,7 mm để khối gel lún xuống 4 mm Khối lượng gel có hàm lượng gelatin 6,67%, được giữ ở 10oC trong 16-18 giờ

Độ nhớt tỉ lệ nghịch với nhiệt độ và tỉ lệ thuận với nồng độ dung dịch Dưới 25oC, dung dịch sẽ tồn tại ở dạng gel (ngoại trừ nồng độ quá thấp) Trong khoảng 25-29oC, dung dịch vừa tồn tại ở dạng gel vừa tồn tại ở dạng dịch nhớt hoặc ở dạng chất lỏng Tại 40oC, ở trạng thái này mạng lưới gelatin liên kết tối

đa với các polyphenol và tạo hợp chất ngưng tụ Trên 40oC, các phân tử gelatin trở nên rời rạc, do mạng lưới rời rạc này nên khả năng ngưng tụ của gelatin với các hợp chất polyphenol bị giảm, nếu có tăng nồng độ gelatin trong dung dịch thì chúng vẫn không liên kết với nhau [19]

Tính lưỡng tính: Gelatin tồn tại trong dung dịch dưới dạng lưỡng cực có khả năng hoạt động như một axit hay một bazơ

Điểm đẳng điện: phân tử gelatin tích điện trong dung dịch kiềm hay axit, chúng sẽ di chuyển trong điện trường Ở pH mà không có sự di chuyển xảy ra gọi là điểm đẳng điện, tại pH này dung dịch gelatin kém bền nhất và dễ kết tủa

Theo nghiên cứu trên 2 loại gelatin (A và B), điểm đẳng điện của gelatin loại A nằm trong khoảng pH 8-9 và phụ thuộc vào thời gian xử lý Gelatin loại

B có điểm đẳng điện là 5,2 sau 4 tuần ngâm với nước vôi và giá trị này sẽ được giảm dần xuống 4,8 nếu thời gian ngâm kéo dài hơn 4 tuần Ngoài ra, điểm đẳng điện còn phụ thuộc vào nồng độ muối trong dung dịch Điểm đẳng điện

có thể xác định ở giá trị pH mà tại đó gelatin có độ kết tủa cực đại [19]

1.5.3 Liên kết hóa học giữa gelatin và tanin

Các tương tác giữa tanin và gelatin là đặc tính phụ thuộc vào cấu tạo của

cả hai chất đó Tương tác này thường dựa trên liên kết hydro, các nhóm phenolic của tanin đóng vai trò là chất cho hydro, tạo liên kết hydro mạnh mẽ với các nhóm carboxyl của gelatin

Để tạo liên kết mạnh với gelatin, tanin phải đủ nhỏ để xâm nhập vào phân

tử gelatin và độ dài mạch phải đủ lớn để liên kết với chuỗi peptit tại nhiều điểm

Sự liên kết và tạo phản ứng kết tủa của phức chất tanin-gelatin này đạt cực đại tại giá trị pH gần nhất với điểm đẳng điện của gelatin Khi dung dịch có độ pH cao sự liên kết không hình thành do ở các nhóm phenolic hydroxyl bị ion hóa

và các protein có điện tích âm thể hiện tính đẩy [19]

1.6 RƯỢU VANG

1.6.1 Giới thiệu chung về rượu vang

Rượu vang là loại thức uống có cồn được lên men từ dịch ép nho hay dịch ép của các loại hoa quả khác nhờ hoạt động trao đổi chất của vi sinh vật,

Các công trình nghiên cứu về lợi ích của rượu vang gần đây nhất cho thấy uống rượu vang giúp giảm bớt nguy cơ mắc các bệnh về tim mạch, huyết

áp, đồng thời làm giảm mỡ máu, giảm nguy cơ mắc bệnh tiểu đường tuýp 2 hơn là dùng bia và rượu Khi uống một (hoặc vài) ly rượu vang trong một ngày

sẽ giảm tới 50% nguy cơ mắc bệnh tai biến mạch máu não hay đột quỵ Phụ nữ

ở độ tuổi 20 trở lên nếu uống một (hoặc vài) ly rượu vang mỗi ngày thì bộ óc ít

bị nguy cơ suy thoái hơn so với những người không uống…[21]

1.6.2 Phân loại rượu vang [22]

Rượu vang là loại thức uống cực kì phong phú về nguồn gốc, tên gọi và cách thưởng thức, do đó cách phân loại rượu vang cũng trở nên đa dạng Một vài cách phân loại rượu vang cơ bản như:

phẩm rượu vang được chia thành hai nhóm lớn: nhóm rượu vang có gas và nhóm rượu vang không có gas

+ Nhóm rượu vang có gas: Rượu vang có gas tự nhiên do quá trình lên men

tạo ra Để giữ được gas (CO2) thường thực hiện quá trình lên men phụ trong các chai, thùng hoặc hệ thống thùng kín và tùy thuộc vào điều kiện lên men (nhiệt độ, thời gian) sẽ cho ra các loại rượu với mức độ chất lượng khác nhau

loại rượu vang khác nhau theo thị hiếu hoặc theo yêu cầu của thị trường tiêu dùng

+ Nhóm rượu vang không có gas: Rượu vang phổ thông được lên men tự nhiên, không bổ sung cồn etylic trong quá trình công nghệ Nhóm rượu vang cao độ là những loại rượu vang có hàm lượng etanol cao hơn so với nhóm vang phổ thông Có thể dùng cồn tinh luyện để nâng cao hàm lượng etanol trong quá trình công nghệ

Phân loại theo màu:

+ Vang trắng: là các loại vang có màu trắng, gần như trong suốt

+ Vang hồng: màu hồng nhẹ, làm từ nho giống vang đỏ nhưng tùy loại mà

Phân loại theo độ ngọt:

+ Khai vị bán ngọt: Với etanol từ 14 -16% v/v và đường từ 5-12%

+ Khai vị ngọt: Với etanol từ 15-17% v/v, đường từ 14-20%

+ Khai vị rất ngọt: Với etanol từ 12-17% v/v, đường từ 21-35%

Trong phạm của vi đề tài, mục tiêu là nghiên cứu chế biến rượu vang điều không có gas thuộc nhóm vang phổ thông, có độ cồn trung bình cao khoảng 11-14% v/v, mong muốn giữ được màu vàng nhạt của nguyên liệu

1.6.3 Tình hình sản xuất rượu vang

Trong đó, ở Italy thu hoạch nho trong niên vụ 2018 tăng 15% so với niên

vụ năm trước, giúp Italy trở thành nước sản xuất rượu vang lớn nhất thế giới Hiện nay ngành công nghiệp sản xuất rượu vang của nước Italy có 310.000 công ty và hơn 46,000 nhà sản xuất rượu vang

Tiếp theo là Pháp với tổng sản xuất năm 2018 đạt 46,4 triệu hectoliter (4,64 tỷ lít), trong đó rượu vang được làm từ nho hữu cơ đang ngày càng hấp dẫn người tiêu dùng Theo nhóm phân tích thị trường đồ uống của Anh (IWSR) thì doanh thu rượu vang Pháp được làm từ nho hữu cơ sẽ tăng lên 17,3 triệu thùng vào năm 2022, so với mức chỉ 4,6 triệu thùng năm 2012 Các vườn nho trồng bằng phương pháp hữu cơ có giá thành sản phẩm là 6,14 euro/chai (7 USD/chai), cao hơn 33% so với các loại rượu truyền thống với giá 4,62 euro/chai (5,24 USD/chai) IWSR dự báo thu nhập từ rượu vang hữu cơ tại Pháp sẽ sớm vượt mức 1 tỷ euro/năm (1,14 tỷ USD), viễn cảnh này cho thấy mức độ ưa chuộng ngày càng tăng đối với các sản phẩm hữu cơ trên toàn cầu Bên cạnh hai nhà sản xuất rượu vang hàng đầu, các nhà sản xuất ở các nước khác cũng góp phần xây dựng nền công nghiệp rượu vang như: Chi-lê, Mê-xi-

cô, Mỹ và Úc…

1.6.3.2 Ở Việt Nam

Ở Việt Nam ngành sản xuất rượu vang mới thực sự bắt đầu vào những năm 80 của thế kỷ XX và được đánh dấu bằng nhãn hiệu vang “Thăng Long”

trên thị trường nội địa với sản phẩm chủ yếu là vang ngọt từ nguyên liệu nho, vải, dứa, mơ… Khoảng cuối năm 1999, một loại vang đỏ được lên men theo công nghệ Pháp đã xuất hiện ở thị trường nội điạ, tạo tiếng vang mạnh với giá thành phù hợp và đạt tiêu chuẩn Châu Âu với thương hiệu “Vang Đà Lạt” Tên thương hiệu được ghép từ chữ “Vang” trong từ rượu vang và tên một thành phố

du lịch nổi tiếng của Việt Nam Sau đó số lượng các nhà máy sản xuất rượu vang tăng lên, các chủng loại rượu vang đa dạng hơn nhưng chất lượng vẫn còn thấp chưa cạnh tranh được với rượu vang nhập ngoại

Theo thống kê năm 2015, ở nước ta có hơn 15 doanh nghiệp sản xuất và

“đóng chai” rượu vang với sản lượng 12-13 triệu lít/năm Sản lượng đang dần tăng trong 5 năm tới, trong đó công ty cổ phần vang Thăng Long sản xuất 10 triệu lít Ngoài ra còn có các công ty cổ phần thực phẩm Lâm Đồng (Vang Đà Lạt), công ty Anh Đào (Vang Anh Đào)… sản xuất các loại vang đỏ, vang trắng

và vang chát [21]

1.6.4 Cơ chế lên men rượu vang

Trong quá trình lên men rượu dưới tác dụng của các chất xúc tác sinh học cung cấp năng lượng giúp cho tế bào vi sinh vật sinh trưởng và trao đổi chất tạo các sản phẩm Thông thường có nhiều sản phẩm được tạo ra nhưng chủ yếu có 4 loại chính đó là etanol, aldehyde, axit và ester được tạo thành với 2 hình thức lên men chính là lên men hiếu khí và kỵ khí [24] Quá trình lên men

kỵ khí, cơ chất (chủ yếu là đường) trải qua chuỗi các phản ứng rất phức tạp để chuyển hóa thành etanol dưới tác dụng của nấm men [22]

Các giai đoạn chuyển hóa đường thành rượu [25]:

+ Mục đích: để chuyển hóa đường thành rượu theo phương trình tổng quát sau: C6H12O6 2C2H5OH + 2CO2 + 27 Kcal

+ Giai đoạn 1 (giai đoạn đường phân): Qua một loạt chuỗi phản ứng phức tạp với sự tham gia của hệ thống nhiều enzym, một phân tử glucose ban đầu sẽ chuyển hóa thành hai phân tử axit pyruvic theo chu trình đường phân Embden-Meyerhof-Parnas

+ Giai đoạn 2 (Axit pyruvic bị decacboxyl hóa): Axit pyruvic dưới tác

+ Giai đoạn 3: Acetaldehyd tiếp tục nhận H2 từ NAD-H2 tạo thành etanol dưới tác dụng của enzym alcoldehydrogenaza của nấm men

1.6.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men

1.6.5.1 Nấm men

Nấm men sử dụng trong sản xuất rượu vang phải có khả năng lên men nhanh, không sinh ra các chất độc, chịu được độ cồn cao và có khả năng sinh

tổng hợp nhiều hợp chất hương đặc trưng Loài Saccharomyces được sử dụng

phổ biến nhất [26] với các chủng thường gặp như:

Saccharomyces cerevisiae: Là loại nấm men được sử dụng phổ biến

trong lên men bia rượu (hình 1.11) Tế bào có dạng hình ovan hay elip, kích thước (5-6)*(10-14) micromet, sinh sản bằng hình thức nảy chồi và sinh bào

tử Điểm nổi bật ở chủng nấm men này là chúng sử dụng được đường saccarose nhờ enzym invertase tạo thành đường nghịch đảo Tế bào nấm men chứa nhiều vitamin (đặc biệt là B1 và B6), có khả năng chịu nhiệt cao, lên men mạnh, kết lắng nhanh làm trong rượu, tạo ra các sản phẩm thứ cấp và tạo mùi vị đặc trưng cho rượu vang [27]

Saccharomyces oviformis: Hình dạng và các yếu tố sinh trưởng giống ở

nấm men Saccharomyces cerevisiae (hình 1.12) Tuy nhiên, điểm khác là

Saccharomyces oviformis có khả năng lên men được dịch quả có hàm lượng

đường cao và lên men cạn kiệt đường, hình thức lên men nổi tạo thành màng trên bề mặt dịch lên men [22]

Saccharomyces uvarum: Là một loại nấm men có ở các loại trái cây tự

nhiên, khả năng sinh bào tử khá mạnh trong môi trường thạch malt Về hình thái chúng không khác với các loài khác (hình 1.13), lên men chìm và có thể tạo ra độ cồn 12-13% (v/v) [28]

Yêu cầu đối với giống nấm men dùng để sản xuất rượu vang:

+ Có khả năng lên men cao, tạo rượu vang có hương vị thơm ngon

+ Sử dụng đường gần như hoàn toàn

+ Kết lắng tốt, làm trong dịch rượu nhanh

+ Chịu được độ cồn, axit của môi trường cũng như các chất sát trùng

1.6.5.2 Ảnh hưởng của pH [29]

nấm men Chúng có khả năng làm thay đổi điện tích các chất tham gia cấu tạo màng tế bào, làm tăng hoặc giảm mức độ thẩm thấu các chất dinh dưỡng cũng như chiều hướng của quá trình lên men Khi đó pH của môi trường lên men ảnh hưởng lớn đến hoạt động trao đổi chất, mức độ thẩm thấu cũng như điện tích của vỏ tế bào vi sinh vật Ở mỗi loài vi sinh vật thường có khả năng sinh trưởng ngoài khoảng pH tối ưu Nhưng khi tế bào vi sinh vật đột ngột thay đổi pH trong tế bào chất để phù hợp với pH môi trường bên ngoài, dẫn đến màng sinh chất bị vỡ làm ức chế hoạt tính của enzym hay protein màng

Đồng thời pH cũng ảnh hưởng trực tiếp đến quá trình lên men và hoạt động của vi khuẩn Trong lên men, điều kiện pH tối ưu để nấm men sinh etanol

là 4,5-5 Nếu pH nằm trong khoảng 3-4 thì vi khuẩn bị ức chế, ngược lại nếu

pH cao hơn (5-6) sản phẩm tạo ra bị hư hỏng hay kém chất lượng do dễ bị nhiễm khuẩn, các sản phẩm phụ sẽ được tạo ra nhiều

1.6.5.3 Ảnh hưởng của hàm lượng khí oxy

Hầu hết các chủng nấm men thuộc giống Saccharomyces trong quá trình

lên men rượu vang, thuộc nhóm vi sinh vật kỵ khí Khi trong môi trường có đầy

đủ oxy thì nấm men sẽ phân hủy đường, dùng làm nguồn năng lượng và cấu tạo tế bào tăng sinh khối Nếu thiếu oxy thì nấm men sử dụng phần oxy hòa tan trong môi trường để sinh trưởng, phát triển và chủ yếu là lên men

Trong giai đoạn đầu lên men, yêu cầu hàm lượng oxy cao nhất để nấm men sinh trưởng phát triển tăng sinh khối Ngoài ra, nếu lên men trong môi trường lớn thì người ta thường sục khí hoặc lắc để tăng lượng oxy cho nấm men sinh sản Ở giai đoạn sau, phải tạo môi trường yếm khí nhằm tránh hiện tượng

lên men giấm, đồng thời ức chế hoạt động của vi khuẩn làm hư hỏng rượu [28]

1.6.5.4 Ảnh hưởng của nhiệt độ

Trong quá trình lên men, nhiệt độ có ảnh hưởng đến hoạt động sống của

nấm men Saccharomyces cerevisiae và chất lượng sản phẩm Nhiều công trình

nghiên cứu cho rằng nhiệt độ trong khoảng:

+ Từ 15-30oC: thích hợp cho rượu vang trắng, nếu thấp hơn thì càng tốt + Tại 25oC: thích hợp cho rượu vang đỏ, nếu nhỏ hơn 15oC quá trình diễn ra rất chậm

+ Từ 28-30oC: là khoảng nhiệt độ thích hợp cho nấm men phát triển tốt nhất + Trên 30-35oC: thì nấm men dại phát triển nhanh chóng

và tạo điều kiện thuận lợi cho vi khuẩn axit axetic hoạt động [30]

1.6.5.5 Ảnh hưởng của nồng độ đường

Đường là cơ chất cần thiết cho quá trình lên men nên chịu ảnh hưởng nhiều đến hiệu suất lên men Nếu nồng độ đường trong môi trường cao hơn 30% thì sẽ kéo dài thời gian lên men dẫn đến quá trình lên men không triệt để Nguyên nhân do lượng rượu được tạo thành gây ức chế hoạt động của nấm men Bên cạnh đó, trong môi trường có nồng độ lên men quá thấp (<10%) thì lượng rượu tạo thành ít, sản phẩm rượu vang có vị nhạt và dễ bị hư hỏng do nhiễm vi sinh vật Còn đối với nước quả thì đa số các loại nấm men đều hoạt động bình thường ở môi trường có nồng độ đường từ 18-25% Ngoài ra, có một

số chủng hoạt động ở môi trường có độ đường cao hơn, nhưng khi nhân giống thường sử dụng môi trường có nồng độ đường thấp dưới 15% [31]

1.6.6.6 Ảnh hưởng của nồng độ etanol

Rượu là sản phẩm chính của quá trình lên men kỵ khí, thường thì nồng

độ cồn của rượu vang từ 10-14% v/v Nếu nồng độ rượu tạo thành tăng quá cao gây ức chế hoạt động của nấm men

Khả năng sống sót và lên men trong môi trường có nồng độ cồn cao là yêu cầu thiết yếu của chủng nấm men trong quá trình sản xuất rượu vang Những chủng nấm men dại thì chúng chỉ sống được trong môi trường có nồng

độ cồn thấp, thường sinh trưởng chậm dần và giảm sự nảy chồi ở nồng độ cồn 2% v/v và có thể ngừng sinh trưởng ở nồng độ cồn 5% v/v [22]

1.6.6.7 Ảnh hưởng của thời gian lên men

Thời gian lên men ảnh hưởng nhiều đến chất lượng sản phẩm tạo thành

ở rượu vang Trong hai giai đoạn lên men, nếu thời gian quá ngắn thì có thể tạo

độ cồn thấp và không đủ thời gian để hình thành hương, mùi vị đặc trưng của rượu vang Đối với đa số nấm men, thời gian lên men chính tốt nhất là 5-20 ngày, thời gian lên men phụ và tàng trữ các loại rượu phải từ vài tháng trở lên

Thời gian lên men chịu ảnh hưởng của các yếu tố như: nhiệt độ lên men, nồng độ đường, chủng nấm men,…Nếu nồng độ đường càng cao thì thời gian lên men càng dài Ngoài ra, lượng men ban đầu bổ sung cũng là một yếu tố quyết định thời gian lên men Với đa số các loại vang, lượng giống bổ sung vào khoảng 3-10% v/v dịch lên men [28] Do vậy mà việc xác định thời gian lên men là điều hết sức quan trọng để đảm bảo quá trình lên men tối ưu cho ra sản phẩm đạt chất lượng tốt nhất

1.6.6.8 Ảnh hưởng của CO2

tách làm 3 phần: một phần tồn tại trong môi trường, phần thứ hai sẽ nổi lên trên

bề mặt và phần còn lại được tích tụ thành một lớp màng có thể ngăn cách giữa không khí và môi trường Lớp màng ngăn này làm giảm khả năng sinh sản của

ức chế cho quá trình lên men nhưng lại có tác dụng tốt khi CO2 được thoát ra ngoài sẽ khuấy động môi trường và kéo dài được trạng thái lơ lửng của nấm men, giúp quá trình lên men diễn ra nhanh chóng Theo nghiên cứu của Miuler-

chế sự sinh sản của nấm men, đạt đến 1,5% trọng lượng thì nấm men không sinh sản được [31]

Chương 2: NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU

2.2 NGUYÊN VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU

2.2.1 Dịch ép quả điều

Quả điều chín vàng sau khi tuyển chọn và thu hái tại tỉnh Bình Phước (tháng 5/2018) được vận chuyển về phòng thí nghiệm, tiến hành rửa sạch để ráo, dùng máy ép trục vít để ép thu lấy dịch quả (hình 2.1) Dịch ép quả điều được cho vào chai nhựa 5 lít đóng kín và bảo quản ở nhiệt độ -10oC trong tủ đông, khi cần sử dụng dịch ép được rã đông đưa về nhiệt độ phòng (25-30oC)

2.2.3 Gelatin

Gelatin thực phẩm được sử dụng trong đề tài có màu vàng, hạt tròn được cung cấp từ công ty phụ gia thực phẩm Sài Gòn

2.2.4 Vi sinh vật

Saccharomyces uvarum 664 được cung cấp từ phòng thí nghiệm hóa thực

phẩm trường Đại học California David, Mỹ

Saccharomyces cerevisiae K1 V1116 được cung cấp từ nhà sản xuất

công ty Lalvin, Canada

2.3 MÔI TRƯỜNG, HÓA CHẤT, DỤNG CỤ VÀ THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU

2.3.1 Môi trường

- Môi trường Sabouraud (SBD): Dextrose 40 g, peptone 10 g, agar 5 g, nước vừa đủ 1 lít, pH=5,6 ± 0,2 (25 oC), tiệt trùng ở 121 oC trong15 phút dùng

để nhân giống nấm men

- Môi trường PDA: Potatoes 200 g, dextrose 20 g, agar 15 g, nước vừa

đủ 1 lít, pH=5,6 ± 0,2 (25 oC), tiệt trùng ở 121 oC trong15 phút dùng định lượng nấm men, nấm mốc

- Môi trường PCA: Casein peptone 5g, yeast extract 2,5 g, dextrose 1 g, agar 15 g, nước vừa đủ 1 lít, pH=7 ± 0,2 (25 oC), tiệt trùng ở 121 oC trong 15 phút dùng để định lượng vi khuẩn hiếu khí

- Môi Trường TSC: Tryptone 15 g, soya peptone 5 g, meat extract B 5 g, yeast extract 5 g, sodium metabisulphite 1g, ferric ammonium citrate 1g, agar 15g, nước vừa đủ 1 lít, pH=7,6 ± 0,2 (25 oC), tiệt trùng ở 121 oC trong 15 phút

dùng để định lượng vi khuẩn Clostridium

- Đĩa petrifim 3M (Mỹ) có chứa sẵn các thành phần dinh dưỡng khô và

chất tạo đông, dùng định lượng vi khuẩn Escherichia coli và Coliform

2.3.2 Hóa chất

- Hóa chất thực phẩm:

+ Đường tinh luyện thương phẩm từ nhà máy đường Biên Hòa

- Hóa chất tinh khiết:

+ Folin-ciocalteu; Potassium iodide (KI); 1,1-diphenyl-2-picryhydrazyl (DPPH); Axit gallic; Potassium ferric cyanide (K3[Fe(CN)6]); Axit tricloacetic (TCA); Iốt (I2); Monosodium phosphate (NaH2PO4); Disodium phosphate (Na2HPO4); Sulfo-indigocamine; Ferric chloride (FeCl3); Natri cacbonat (Na2CO3); Axit citric; Phenolphtalein của hãng Merck - Đức

hồ tinh bột của công ty hóa chất vật liệu điện Cemaco Việt Nam

− Thiết bị đo cường

độ màu Abs DR/2000

-2.4 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

2.4.1 Xác định thành phần dinh dưỡng ở dịch ép quả điều ban đầu

- Mục đích: Xác định một số thành phần dinh dưỡng ban đầu ở dịch ép

quả điều

- Cách thực hiện: Dịch ép quả điều sau khi được rã đông đưa về nhiệt độ

- Bố trí thí nghiệm:

+ Thí nghiệm hai yếu tố, được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với các nghiệm thức theo bảng 2.2, mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần

Bảng 2.1: Một số thành phần dinh dưỡng ở dịch ép quả điều

9 Canxi (Ca) AAS - hấp thu nguyên tử

10 Magie (Mg) AAS - hấp thu nguyên tử

11 Sắt (Fe) AAS - hấp thu nguyên tử

12 Kẽm (Zn) AAS - hấp thu nguyên tử

13 Photpho (P) AAS - hấp thu nguyên tử

14 Kali (K) AAS - hấp thu nguyên tử

Bảng 2.2: Khảo sát ảnh hưởng của pH và nhiệt độ của dịch ép quả điều đến

hoạt tính của enzym tanase