Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 4804-89 - ST SEV 4318-83

Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 4804-89 - ST SEV 4318-83 trình bày về thức ăn chăn nuôi - phương pháp xác định aflatoxin. Tiêu chuẩn này phù hợp với ST SEV 4318-83, áp dụng cho thức ăn chăn nuôi: thức ăn hỗn hợp, thức ăn chăn nuôi: dạng hạt, cám, lạc (arachis), thức ăn thô cũng như khô dầu lạc, khô dầu cải, khô dầu bông, khô dầu đậu tương, khô dầu trích ly và quy định phương pháp xác định hàm lượng aflatoxin (độc tố vi nấm ) B1, B2, G1 và G2.

(ST SEV 4318 - 83)

thức ăn chăn nuôi

Animal feeding stuffs Method for determination of aflatoxin

Tiêu chu n này phù h p v i ST SEV 4318­83, áp d ng cho th c ăn chăn nuôi: th c ăn h nẩ ợ ớ ụ ứ ứ ỗ  

h p, th c ăn chăn nuôi: d ng h t, cám, l c (arachis), th c ăn thô cũng nh  khô d u l c, khôợ ứ ạ ạ ạ ứ ư ầ ạ  

d u c i, khô d u bông, khô d u đ u tầ ả ầ ầ ậ ương, khô d u trích ly và qui đ nh phầ ị ương pháp xác 

đ nh hàm lị ượng aflatoxin (đ c t  vi n m ) B1, B2, G1 và G2.ộ ố ấ

1 B n ch t c a phả ấ ủ ương pháp

Phương pháp d a trên s  tách chi t aflatoxin t  m u th  b ng cloroform, r a ph n chi tự ự ế ừ ẫ ử ằ ử ầ ế   qua c t s c ký, sau đó xác đ nh hàm lộ ắ ị ượng các aflatoxin (đ c t  vi n m) riêng l  trên s c kýộ ố ấ ẻ ắ  

b n m ng (SKBM) trên c  s  đánh giá b ng m t hay b ng m t  đ  hu nh quang k ­ả ỏ ơ ở ằ ắ ằ ậ ộ ỳ ế   (Densitomet), kích thước và cường đ  các v t phát quang và ti n hành th  nghi m hoá h cộ ế ế ử ệ ọ  

đ  xác nh n trên s c ký b n m ng (SKBM).ể ậ ắ ả ỏ

2.  Các v n đ  chungấ ề

2.1.  Đ  ti n hành th  n u không có các ch  d n khác dùng thu c th  tinh khi t đ  phân tíchể ế ử ế ỉ ẫ ố ử ế ể  

(TKPT) và nướ ấc c t hay nước có đ  s ch tộ ạ ương  ng.ứ

2.2.  Hàm lượng t i thi u và phố ể ương pháp có th  phát hi n là 1ể ệ µg/kg

3 Thi t bế ị

3.1 Thi t b  cho SKBM : d ng c  t o l p ch t h p ph  m ng. Bu ng khai tri n trong có đ tế ị ụ ụ ạ ớ ấ ấ ụ ỏ ồ ể ặ  

máng thu  tinh, micro­pipet, dung tích 1, 2, 5 và 10mmỷ 3 hay micros ranh dung tích 10mmơ 3 các 

t m thu  tinh kích thấ ỷ ước (c ) 20 x 20 cm.ỡ

3.2 C t s c ký thu  tinh có van mài độ ắ ỷ ường kính trong 2,2 cm và dài 40 cm

3.3 Thi t b  b c h i ch m khung quay lo i rôto hay lo i Cudex­ Danhit.ế ị ố ơ ậ ạ ạ

3.4 Ngu n b c x  t  ngo i (c c tím) (OF) có bồ ứ ạ ử ạ ự ước sóng 365 mm

3.5 M t đ  hu nh quang k  có b  l c sóng đ m b o phát x  t  ngo i bậ ộ ỳ ế ộ ọ ả ả ạ ử ạ ước sóng 365 mm có bộ 

l c l n hai bọ ầ ước sóng 336 mm

3.6 Máy l c.ắ

3.7 Ph  quang k  đ m b o đo trong vùng ph  t  ngo i t  300 đ n 400 nm.ổ ế ả ả ổ ử ạ ừ ế

  Ban hành theo Quy t đ nh s  701/QĐ ngày 25 tháng 12 năm 1989 c a U  ban Khoa h c và K  thu t Nhà n ế ị ố ủ ỷ ọ ỹ ậ ướ c.

3.8 T  s y đ m b o đi u ch nh nhi t đ  đ n 200ủ ấ ả ả ề ỉ ệ ộ ế 0C.

3.9 Bình khí nit  hay khí tr  khác.ơ ơ

3.10 B p cách thu  hay cách cát đ m b o đi u ch nh nhi t đ  đ n 100ế ỷ ả ả ề ỉ ệ ộ ế 0C

3.11 Cân phân tích v i sai s  phép cân không l n h n ớ ố ớ ơ ± 0,0001g

3.12 Cân k  thu t v i sai s  phép cân không l n h n ỹ ậ ớ ố ớ ơ ± 0,1g

3.13 Máy nghi n phòng thí nghi m (máy tán) đ m b o đ  m n c a b t không quá 1mm.ề ệ ả ả ộ ị ủ ộ

3.14 B m hút b ng  ng nơ ằ ố ước

3.15 Ph u Bunhe (Buchner) đễ ường kính 10 cm

3.16 Ph u thu  tinh .ễ ỷ

3.17 Bình Eclenmaye (dung tích 500 cm3)

3.18 Bình nón nút mài dung tích 250, 400 và 750 cm3

3.19 Bình đ nh m c dung tích 10 cmị ứ 3

3.20 ống đo (hình tr ) dung tích 50, 100 và 250 cmụ 3

3.21 Pipét đ nh m c (Kor) dung tích 1, 2 và 5 cmị ứ 3

3.22 ống thu  tinh nút mài dung tích 10 cmỷ 3

3.23 Vòi phun thu  tinh.ỷ

3.24 Sàng (lưới) đường kính l  1 mm.ỗ

3.25 Đũa thu  tinh.    ỷ

4 Thu c th , dung d ch và v t li uố ử ị ậ ệ

4.1 Axeton

4.2 Metyl xyanua (Acetonitryl)

4.3 Benzen

4.4 S t cloruaắ

4.5 Axit focmic 85­90%

4.6 Axit triflo axetic

4.7 Axit axetic băng

4.8 Cacbonat đ ng ­ hyđroxit đ ng CuCOồ ồ 3, Cu(OH)2

4.9 Natri sunfat khan

4.10 Chì axetataxit

4.11 Rượu n.amylic b c 1ậ

4.12 Rượu metylic

4.13 Rượu etylic

4.14 Toluen

4.15 Clorofoc

4.16 Ete dietyl m t nấ ước không ch a peroxitứ

4.17 Ete petrol có nhi t đ  30­35ệ ộ 0C hay haxan tách t  d u hoừ ầ ả

4.18 Triclo etylen

4.19 Amoni sunfat dung d ch 40%ị

4.20 Axetenitrin, dung d ch 2% trong benzenị

4.21 Kali hyđroxit, dung d ch ch a (KOH) = 0,02 mol/dmị ứ 3

4.22 Natri hyđroxit,dung d ch ch a (NaOH) = 0,2 mol/dmị ứ 3

4.23 Axit nitric, dung d ch ch a HNOị ứ 3­ = 2 mol/dm 3

4.24 Rượu metylic, dung d ch 3% trong clorofocị

4.25 Axit sunfuric 0,05 và dung d ch 25%ị

4.26 Aflatoxin (đ c t  vi n m) dung d chộ ố ấ ị

4.26.1.  Dung d ch g c chu n b  nh  sau :ị ố ẩ ị ư

Dung d ch I ­ cho 1 mg aflatoxin vào bình đ nh m c dung tích 10 cmị ị ứ 3 hoà tan trong h n h pỗ ợ   benzen ­ axetonitrin theo t  l  th  tích và 98+ 2 và đ nh m c đ n v ch. N ng đ  dung d chỷ ệ ể ị ứ ế ạ ồ ộ ị  

ph i là 0,1ả µg/cm3

Dung d ch II ­ chuy n 1 cmị ể 3 dung d ch I vào bình đ nh m c dung tích 10 cmị ị ứ 3 và dùng h nỗ  

h p benzen axetonitrin đ nh m c đ n v ch. N ng đ  dung d ch ph i là 10ợ ị ứ ế ạ ồ ộ ị ả µg/cm3

Đ i v i m i ch t đ c aflatoxin dung d ch g c c n chu n b  riêng và b o qu n trong bình kínố ớ ỗ ấ ộ ị ố ầ ẩ ị ả ả  

 ch  t i   nhi t đ  g n 0

ở ỗ ố ở ệ ộ ầ 0C

4.26.2.  Dung d ch h n h p các ch t aflatoxin chu n b  nh  sau : l y 1cmị ỗ ợ ấ ẩ ị ư ấ 3dung d ch g c IIị ố  

c a các aflatoxin Bủ 1và G1và 0,5cm 3dung d ch g c II các aflatoxin Bị ố 2và G2 vào bình đ nh m cị ứ   dung tích 10 cm3 và đ nh m c đ n v ch b ng h n h p benzen ­ axetonitrin. N ng đ  cácị ứ ế ạ ằ ỗ ợ ồ ộ   aflatoxin trong dung d ch tiêu chu n ph i là ị ẩ ả µg/ cm3 đ i v i Bố ớ 1 và G1 và 0,5 µg/ cm3 đ i v iố ớ   B2và G2

4.26.3.  Xác đ nh n ng đ  aflatoxin trong dung d ch II b ng phị ồ ộ ị ằ ương pháp quang ph  b ngổ ằ  

cách đo s  h p th  trong ph  t  ngo i (UF) t  330 đ n 370 mm đ i v i h n h p benzen ­ự ấ ụ ổ ử ạ ừ ế ố ớ ỗ ợ   axetonitrin

N ng đ  aflatoxin (C) tính ra microgam trên cmồ ộ 3, theo công th c :ứ

k m

A

C c.1000 Trong đó :

A ­ H p th    bấ ụ ở ước sóng 350 nm

mc ­ Phân t  lử ượng, c  th  đ i v i các aflatoxin ụ ể ố ớ B1 ­ 312, B2 ­ 314, G1 ­ 328, G2 ­ 330

ε ­ H  s  h p th  phân t  c  th  đ i v i các aflatoxin ệ ố ấ ụ ử ụ ể ố ớ B1 ­ 19.800, B2 ­ 20.900, G1 ­ 17.100, G2 ­ 18.200

k ­ H  s  hi u ch nh quang ph  k  s  d ng, n m trong kho ng t  0,95  đ n 1,05.ệ ố ệ ỉ ổ ế ử ụ ằ ả ừ ế 4.27.  H n h p các h  dung môi tri n khai tách tri t cho SKBM (các pha di đ ng).ỗ ợ ệ ể ế ộ

4.27.1.  H n h p clorofoc ­ triclo etylen rỗ ợ ượu n­emylic axit foemic theo t  l  th  tích là 80 +ỷ ệ ể  

15 + 4 + 1

4.27.2.  H n h p clorofoc ­ axeton t  l  th  tích 90 + 10.ỗ ợ ỷ ệ ể

4.27.3.  H n h p Toluen ­ etyl ­ axetic  ­ axit formic theo t  l  th  tích 60 + 30 + 10.ỗ ợ ỷ ệ ể

4.28.  Silicagen ­ H theo Stan dùng cho s c ký b n m ng (SKBM) hay Adsorbosil ­ 1 hay lo i khácắ ả ỏ ạ  

có tính ch t tấ ương đương

4.29.  Các tiêu chu n dùng cho SKBM, chu n b  nh  sau :ẩ ẩ ị ư

R a các t m kính trong dung d ch ch t kh  b n, tráng b ng tia nử ấ ị ấ ử ả ằ ước và tráng k  b ng nỹ ằ ướ  c

c t, s y khô và r a b ng rấ ấ ử ằ ượu etylic. Cho 70g silicagen ­ H hay 50g Adsorbosil ­ 1 vào bình  nón, đ  vào 60 cmổ 3 nướ ấc c t và tr n k ; chuy n v a này vào d ng c  t o l p ch t h p phộ ỹ ể ữ ụ ụ ạ ớ ấ ấ ụ 

m ng và đ  lên các t m có đ  dày 0,25mm (kh i lỏ ể ấ ộ ố ượng ch t h p th  đã nêu đ  đ  chu n bấ ấ ụ ủ ể ẩ ị 

10 t m có kích thấ ước 20 x 20 cm); s y các t m   nhi t đ  phòng sau đó cho vào t  s y, tăngấ ấ ở ệ ộ ủ ấ  

d n nhi t đ  đ n 110ầ ệ ộ ế 0C và đ    nhi t đ  này trong 2h.ể ở ệ ộ

       Ng ng s y, làm ngu i   nhi t đ  phòng và cho vào bình hút  m. Nh ng t m chu n này b oừ ấ ộ ở ệ ộ ẩ ữ ấ ẩ ả  

qu n   trong bình hút  m đ n 4 tu n.ả ở ẩ ế ầ

4.30.  Silicagen viên (h t) có đạ ường kính h t 0,05 ­ 0,2 mm dùng cho c t s c ký, đạ ộ ắ ược đ    nhi tể ở ệ  

đ  105ộ 0C trong 1 gi  Sau khi làm ngu i cho nờ ộ ước c t  theo 1% kh i lấ ố ượng silicagen và l cắ   trong 2 gi  B o qu n   bình đ y kín.ờ ả ả ở ậ

4.31.  Gi y l c lo i nhanh .ấ ọ ạ

4.32.  Bông đã t y m  b ng ête d u ho  hay bông th y tinh.ẩ ỡ ằ ầ ả ủ

4.33.  Điatomit (đá t o cát) mác xelit ­ 545 hay Hyflosuper ­ cel hay lo i khác có tính ch t tả ạ ấ ương t ự

5 Chu n b  thẩ ị ử

5.1 Tách ch t aflatoxin t  th c ăn chăn nuôi ấ ừ ứ

Nghi n m u phân tích c a th c ăn chăn nuôi b ng máy nghi n, sàng qua sàng và tr n đ u.ề ẫ ủ ứ ằ ề ộ ề   Cân 50g v i sai s  cho phép cân không l n h n ớ ố ớ ơ ± 0,1g và cho vào bình nón nút mài dung tích 

750 cm3, cho thêm 25% diatomit, đ  vào 25 cmổ 3 nước, khu y k  b ng đũa thu  tinh, sau đóấ ỹ ằ ỷ   cho thêm vào 250 cm3 clorofoc. Đ y kín bình và đ t lên thi t b , l c. L c trong 30 phút, l cậ ặ ế ị ắ ắ ọ  

ph n chi t (ch t chi t) qua gi y l c ch a (5  ầ ế ấ ế ấ ọ ứ ± 0,1g) natri sunfat khan. Thu 50 cm3 ph n l cầ ọ  

d u.ầ

5.2 Chu n b  c t s c ký ẩ ị ộ ắ

Chu n b  c t r a ph n l c nh  sau :ẩ ị ộ ử ầ ọ ư

Cho vào đáy c t nút bông đã t y m  r i cho vào 5g natri sunfat khan. Đ  clorofoc đ n n aộ ẩ ỡ ồ ổ ế ử   chi u cao c a c t, cho vào 10g  silicagen đã chu n b  theo m c 4.30, và tráng thành c t b ngề ủ ộ ẩ ị ụ ộ ằ  

20 cm3 clorofoc. Tr n  gel (keo) b ng đũa thu  tinh sao cho không phá v  l p sunfat. Sau khiộ ằ ỷ ỡ ớ  

ch t hút láng (k t t a) hoàn toàn, ph  gel b ng 15g natri sunfat khan và đ  clorofoc đ n m cấ ế ủ ủ ằ ổ ế ứ  

ch t hút.ấ

5.3 Làm (r a) s ch ph n l c trên c t s c ký ử ạ ầ ọ ộ ắ

Đ  50 cmổ 3 ph n l c theo đũa thu  tinh hay theo thành vào c t đã chu n b  nh  trên, ph n nàyầ ọ ỷ ộ ẩ ị ư ầ  

ch a tứ ương đương 10g m u phân tích th c ăn chăn nuôi. M  van và tháo dung môi. Gi i h pẫ ứ ở ả ấ   (r a gi i) h p ph  trên gel l n lử ả ấ ụ ầ ượ ằt b ng 150 cm3 hexan và 150 cm3 ête dietylic khan. Bỏ 

nước gi i h p (eluent).Tách aflatoxin b ng 150 cmả ấ ằ 3 dung d ch rị ượu metylic trong clorofoc.  Làm b c h i dung môi tách (eluent) trong thi t b  b c h i chân không đ n khi còn có th  tíchố ơ ế ị ố ơ ế ể   0,5 cm3. Sau đó, dùng 3 lượng t ng 2 cmừ 3 clorofoc chuy n đ nh lể ị ượng c n vào các  ng khácặ ố  

v ch có nút mài và làm b c h i đ n khi b ng dòng khí nit  Hoà tan ph n chi t đã đạ ố ơ ế ằ ơ ầ ế ược làm 

s ch trong 0,5 cmạ 3 dung d ch axeton nitrin trong benzen và b o qu n dung d ch nh n đị ả ả ị ậ ượ  c trong t  l nh đ n khi ti n hành th ủ ạ ế ế ử

5.4 Chuy n dung d ch và dung d ch th  lên các t m s c ký b n m ng ể ị ị ử ấ ắ ả ỏ

C o s ch l p ch t hút r ng 0,5 cm   các c nh th ng đ ng c a các t m. Đánh d u các c nhạ ạ ớ ấ ộ ở ạ ẳ ứ ủ ấ ấ ạ  

th ng đ ng b ng các v ch r ng 1 ­ 1,5 cm và dùng đẳ ứ ằ ạ ộ ường th ng ngang gi i h n s  di đ ngẳ ớ ạ ự ộ  

c a các pha chuy n đ ng   kho ng cách 13 cm t  đủ ể ộ ở ả ừ ường xu t phát. Trên kho ng cách 2 cmấ ả  

t  c nh dừ ạ ướ ấi t m cho 1,2 và 5 cm3 dung d ch h n h p aflatoxin đã chu n b  theo m c 4.26.2ị ỗ ợ ẩ ị ụ  

và làm 3 l n t ng 10 mmầ ừ 3 m i dung d ch th  Trên m i v t dung d ch th  cho 1 và 2 mmỗ ị ử ỗ ế ị ử 3  dung d ch h n h p aflatoxin (chu n trong). Đ  tránh nh m l n c n đánh s  các v t c a dungị ỗ ợ ẩ ể ầ ẫ ầ ố ế ủ  

d ch chu n và dung d ch  t    phía trên t m.ị ẩ ị ứ ở ấ

5.5 Chu n b  bu ng khai tri n ẩ ị ồ ể

      Ngay trước khi ti n hành th  đ  m t trong nh ng h n h p tách chi t chu n b  theo m cế ử ể ộ ữ ỗ ợ ế ẩ ị ụ  

4.27 vào bu ng (bu ng chia bão hoà) v i lồ ồ ớ ượng đ m b o phân chia s c ký.ả ả ắ

5.6 R a ph  (làm s ch thêm) ph n chi t ử ụ ạ ầ ế

      N u dung d ch th  ch a các t p ch t c n tr  xác đ nh aflatoxin c n ti n hành làm s ch thêmế ị ử ứ ạ ấ ả ở ị ầ ế ạ  

c n khô b ng m t trong nh ng phặ ằ ộ ữ ương pháp nêu dưới đây :

5.6.1 Hoà tan c n khô trong 50 cmặ 3 axeton, cho thêm 20 cm3 dung d ch amonisunfat và 130 cmị 3 

nước; tr n và đ  l ng 2 ­5 phút sau đó cho thêm 10g xelit ­ 545, tr n và l c h n h p quaộ ể ắ ộ ọ ỗ ợ  

gi y l c cu n (g p) sóng.  Thu 120 cmấ ọ ố ấ 3 ph n l c tầ ọ ương đương v i 6g th c ăn chăn nuôiớ ứ   chuy n vào ph u tách dung tích 250 cmể ễ 3, cho thêm 10 cm3 benzen và l c trong 2 phút.ắ

      Sau khi phân l p, tách b  pha nớ ỏ ướ ởc   phía dưới, còn tr n pha benzen v i 50 cmộ ớ 3 nước và l iạ  

l c ph u. Sau đó l i tách b  pha nắ ễ ạ ỏ ước, còn l c benzen qua l p natrisunfat khan đã đọ ớ ượ ử  c r a

b ng 5 cmằ 3 benzen. G p các ph n l c và làm bay h i b ng dòng khí nit  và hoà tan c n khôộ ầ ọ ơ ằ ơ ặ   trong 0,5 cm3  dung d ch axeton nitrin trong benzen. B o qu n dung d ch th  đã làm s chị ả ả ị ử ạ   trong t  l nh đ n khi ti n hành th ủ ạ ế ế ử

5.6.2 Hoà tan ph n chi t đã đầ ế ược làm s ch trong 50 cmạ 3 h n h p nỗ ộ ước – axetonitrin (5+45) cho 

thêm 25 cm3 dung d ch chì axetat và 2g xelit­ 545. Chu n b  dung d ch chì axetat nh  sau :ị ẩ ị ị ư   hoà tan 200g chì axetaaxit Pb (CH3COO)2. 3H2O trong 100 cm3 nước và đun nóng trên b pế   cách thu  đ n khi tan cho thêm 3 cmỷ ế 3 axit axetic băng và đ  nổ ước đ n th  tích 1 dmế ể 3 ; l cọ  

ph n chi t đã đầ ế ược làm s ch qua gi y l c g p sóng vào ph u tách (chi t) dung tích 250 cmạ ấ ọ ấ ễ ế 3 

và r a phin l c b ng 50   cmử ọ ằ 3  nước; chi t 3 l n dung tích g p b ng lế ầ ộ ằ ượng t ng 50 cmừ 3  clorofoc, g p các pha dộ ưới, s y qua l p natri sunfat trên phin l c và làm b c h i trong thi tấ ớ ọ ố ơ ế  

b  b c h i chân không   nhi t đ  45ị ố ơ ở ệ ộ 0C

Dùng 3 lu ng m i lợ ỗ ượng 2 cm3 clorofoc chuy n d ch lể ị ượng c n khô vào  ng nghi m có nútặ ố ệ   mài, làm b c h i dung môi b ng dòng khí nit , còn c n thì hoà tan trong 0,5 cmố ơ ằ ơ ặ 3 dung d chị   axetonitrin trong benzen và b o qu n trong t  l nh đ n khi ti n hành th ả ả ủ ạ ế ế ử

5.6.3.  Hoà tan c n khô trong 150 cmặ 3 axeton nước (85 +15 ). Cho vào c c dung tích 500 cmố 3 l nầ  

lượt 170 cm3  natri hyđroxit và dung d ch m i chu n b  g m 20g s t clorua trong 300 cmị ớ ẩ ị ồ ắ 3 

nước  Khu y  k  h n h p  Cho  vào dung  d ch  ph n  chi t  trong  axeton  nấ ỹ ỗ ợ ị ầ ế ước   3g  đ ngồ   cacbonat baz  và chuy n vào c c ch a h n h p s t clorua và natri hyđrôxít. Cho thêm vàoơ ể ố ứ ỗ ợ ắ   100g xelit­ 545 và khu y k  L c lấ ỹ ọ ượng ch a trong c c qua ph u l c Bunhe (Buchner) vàứ ố ễ ọ   chuy n 150 cmể 3 ph n l c ch a 4,3g th c ăn chăn nuôi vào ph u tách dung tích 500 cmầ ọ ứ ứ ễ 3, cho  thêm 150 cm3  0,03% dung d ch axit sunfuric và 10 cmị 3  cloruafoc. L c ph u trong 3 phút.ắ ễ   Chuy n l p clorofoc bên dể ớ ưới vào ph u tách s ch dung d ch 250 cmễ ạ ị 3, cho thêm 100 cm3 dung 

d ch kali hyđrôxit và l c trong 30 giây. S y clorofoc b ng natri sunfat khan, làm b c h iị ắ ấ ằ ố ơ   trong dòng khí nit  và hoà tan c n khô trong 0,5 cmơ ặ 3 dung d ch axetonitrin 2% trong benzen.ị  

B o qu n dung d ch trong t  l nh đ n khi ti n hành th ả ả ị ủ ạ ế ế ử

6.  Ti n hành thế ử

6.1.  Ti n hành s c ký b n m ng ế ắ ả ỏ

Các t m ch a m u c a dung d ch chu n và dung d ch th  đấ ứ ẫ ủ ị ẩ ị ử ược đ t vào bu ng s c ký và giặ ồ ắ ữ  cho đ n khi tuy n (m t, ti p giáp) c a h  tách nâng cao đ n m c các đế ế ặ ế ủ ệ ế ứ ường gi i h nớ ạ   ngang, sau đó nh c ra kh i bu ng và s y   nhi t đ  phòng trong ch  t i.ấ ỏ ồ ấ ở ệ ộ ỗ ố

6.2.  Đánh giá đ nh tính các t m s c ký ị ấ ắ

Xem xét t m s c ký trong ánh sáng t  ngo i trong bu ng t i   kho ng cách 20cm t  ngu nấ ắ ử ạ ồ ố ở ả ừ ồ   phát x  và xác đ nh các v t hu nh quang m u xanh t i có đ i lạ ị ế ỳ ầ ố ạ ượng tương đ i c a y u tố ủ ế ố  duy trì (kh ng ch )(Rf) trong h  s c ký 4.27.1, 4.27.2 và 4.27.3 đ i v i aflatoxin Bố ế ệ ắ ố ớ 1 ằ 0,40;  0,59 và 0,35 và tương t  đ i v i aflatoxin Bự ố ớ 2 ằ 0,40; 0,43 và 0,28. Các aflatoxin G1 và G2 c nầ  

ph i phát quang b ng ánh sáng xanh lá cây, đ i lả ằ ạ ượng Rf c a chúng trong cùng h  s c kýủ ệ ắ   trên ph i là ả ằ 0,24; 0,39; 0,23 đ i v i Gố ớ 1và 0,18; 0,30; 0,19 đ i v i Gố ớ 2.

6.3.  S  nh n bi t aflatoxin  ự ậ ế

Dùng vòi phun phun các t m s c ký ch a các h n h p tách chi t c a các dung d ch chu n vàấ ắ ứ ỗ ợ ế ủ ị ẩ   dung d ch th , b ng dung d ch axit sunfuric 25% s y trong lu ng khí  m và xem xét l i trongị ử ằ ị ấ ồ ẩ ạ   ánh sáng t  ngo i.ử ạ

N u không có s  thay đ i ánh hu nh quang c a các ch t t  xanh tím sang xanh lá cây vàngế ự ổ ỳ ủ ấ ừ   thì có th  lo i tr  kh  năng có aflatoxin. N u có s  thay đ i đó, có th  k t lu n s  b  là cóể ạ ừ ả ế ự ổ ể ế ậ ơ ộ   aflatoxin hay ch t khác có th  tham gia ph n  ng v i axit sunfuric. Trong trấ ể ả ứ ớ ường h p nàyợ  

c n ti n hành s c ký l i trong hai h  s c ký khác theo m c 4.27 và th  l i b ng phầ ế ắ ạ ệ ắ ụ ử ạ ằ ươ  ng pháp hoá h c.ọ

So sánh đ  hu nh quang c a các v t b ng m t ho c dùng m t đ  hu nh quang k ộ ỳ ủ ế ằ ắ ặ ậ ộ ỳ ế

Đ  ti n hành xác đ nh m t đ  hu nh quang k  có th  dùng các ph  thông ch a các ch t giaoể ế ị ậ ộ ỳ ế ể ổ ứ ấ   thoa l  trong vùng tách aflatoxin. N u b ng m t đã có th  phát hi n là có các ch t đó, c nạ ế ằ ắ ể ệ ấ ầ   làm s ch thêm c n khô c a nạ ặ ủ ước gi i h p (eluent) t  c t s c ký dùng m t trong nh ngả ấ ừ ộ ắ ộ ữ  

phương pháp nêu   m c 5.6.ở ụ

Đ t t m s c ký trên m t đ  hu nh quang k  Ghi ph  m t đ  hu nh quang c a aflatoxinặ ấ ắ ậ ộ ỳ ế ổ ậ ộ ỳ ủ   theo hướng s  d ng máy. Phân tích đ nh lử ụ ị ượng ch  ti n hành đ i v i các đ i lỉ ế ố ớ ạ ượng n mằ   trong gi i h n c a ch  s  tuy n tính trên m t đ  hu nh quang k ớ ạ ủ ỉ ố ế ậ ộ ỳ ế

K t qu  so sánh là giá tr  trung bình c ng c a không ít h n 3 phép đo.ế ả ị ộ ủ ơ

6.4.  Th  nghi m xác nh n b ng ph ử ệ ậ ằ ươ ng pháp hoá h c ọ

6.4.1. Xác nh n có aflatoxin Bậ 1 và G2.

Phép th  d a trên s  t o ch t d n xu t c a aflatoxin Bử ự ự ạ ấ ẫ ấ ủ 1 và G2 v i axit triflo axetat tr c ti pớ ự ế   trên t m s c ký.ấ ắ

Chia t m s c ký làm 2 ph n b ng nhau. Đ y m t n a b ng t m kính s ch, nh  lên n a kiaấ ắ ầ ằ ậ ộ ử ằ ấ ạ ỏ ử   hai v t (1 – 10 mmế 3) dung d ch th  ch a 0,5 ­5ị ử ứ µg aflatoxin B1 và G1, cũng nh  2 và 5 mmư 3  theo m c 4.26.2. Cho thêm vào m t trong các v t th  nghiên c u 2 mmụ ộ ậ ử ứ 3 dung d ch aflatoxinị   (chu n n i b ). Sau đó cho thêm vào t t c  các v t, m i v t 2 mmẩ ộ ộ ấ ả ế ỗ ế 3 h n h p m i chu n bỗ ợ ớ ẩ ị 

c a axit triflo axetic v i clorofoc (1+1). S y t m s c ký trong lu ng h i nóng (35­ủ ớ ấ ấ ắ ồ ơ 400C)  trong 10 phút sau đó m  ph n hai c a t m s c ký và cho lên m t kh i lở ầ ủ ấ ắ ộ ố ượng nh  trên dungư  

d ch aflatoxin theo m c 4.26.2 và dung d ch nghiên c u (th ). Không cho dung d ch axit trifloị ụ ị ứ ử ị   axetic. Cho vào đáy bu ng s c ký s ch m t m ng bông thu  tinh h p có nồ ắ ạ ộ ả ỷ ẹ ước, dùng pipet  cho vào ph n còn l i c a bu ng g n 50 cmầ ạ ủ ồ ầ 3 h  tách chu n b  theo m c 4.27.2. Cho t m s cệ ẩ ị ụ ấ ắ  

ký vào sao cho móng có nước n m trằ ướ ấc t m s c ký. Ti n hành s c ký đ n đ  cao 13cm vàắ ế ắ ế ộ   xem xét trong ánh sáng t  ngo i v i bử ạ ớ ước sóng 365nm. Nh ng aflatoxin không tham giaữ  

ph n  ng v i axit triflo axetic đ u ph i n m g n đả ứ ớ ề ả ằ ầ ường tuy n c a dung môi . Nh ngế ủ ữ   aflatoxin hu nh quang t o thành sau ph n  ng có ánh xanh tím Bỳ ạ ả ứ 2a  và G2a  ph i n m phíaả ằ  

dướ ấi t m và có đ i lạ ượng Rf nh  h n 4 l n so v i Bỏ ơ ầ ớ 1và G1.

  Phun t m kính thêm b ng dung d ch axit sunfuric  dung d ch này thay đ i hu nh quang xanhấ ằ ị ị ổ ỳ  

tím c a t t c  các aflatoxin xanh lá cây vàng.ủ ấ ả

6.4.2.  Xác nh n có aflatoxin ậ G và 1 G 2

  Phép th  này đử ược dùng khi trên các t m s c ký xu t hi n các t p ch t giao thoa (nhi u)ấ ắ ấ ệ ạ ấ ễ  

d ch chuy n cùng aflatoxin G. Ti n hành s c ký t m s c ký ch a dung d ch trong h  táchị ể ế ắ ấ ắ ứ ị ệ   benzen  ­ rượu etylic ­ nước (46+35+19). H  đệ ược chu n b  trẩ ị ước khi dùng 24 gi  b ng cáchờ ằ  

l c t t c  các ch t trong ph u tách sau khi phân l p tách t ng pha vào các bình riêng. N uắ ấ ả ấ ễ ớ ừ ế  

h n h p đang chu n b  b  đ c, c n đun nóng h n h p. Đ  50 cmỗ ợ ẩ ị ị ụ ầ ỗ ợ ể 3 l p dớ ưới cùng vào bu ngồ  

s c ký, còn 50 cmắ 3 l p trên cùng đ  vào máng thu  tinh riêng và đ t máng vào bu ng trớ ổ ỷ ặ ồ ướ  c

t m s c ký. Sau khi l y t m s c ký ch a các ch t tách đấ ắ ấ ấ ắ ứ ấ ược ra, s y t m s c ký, xem xétấ ẩ ắ   trong ánh sáng t  ngo i và xác đ nh hàm lử ạ ị ượng aflatoxin.       

7.  X  lý k t quử ế ả

7.1.  Khi so sánh đ  phát hu nh quang c a các v t b ng m t, hàm lộ ỳ ủ ế ằ ắ ượng aflatoxin trong m u thẫ ử 

th c ăn chăn nuôi (X) tính b ng microgram trên kilogram theo công th c:ứ ằ ứ

        V m

V C V X

e

K w

Trong đó:

w

V ­ Th  tích dung d ch h n h p aflatoxin theo m c 4.26.2 t ng  ng m u th  ,ể ị ỗ ợ ụ ươ ứ ẫ ử mm3

        C ­ N ng đ  aflatoxin trong dung d ch h n h p theo m c 4.26.2 ồ ộ ị ỗ ợ ụ µg/cm3

        V  ­ Th  tích cu i c a dung d ch th ,  K ể ố ủ ị ử mm3   

        V  ­ Th  tích dung d ch th  trên t m s c ký,  e ể ị ử ấ ắ mm3  

        m ­ Kh i lố ượng m u ch a trong th  tích ph n chi t, l y làm s ch, g.ẫ ứ ể ầ ế ấ ạ

7.2.  Khi so sánh đ  phát hu nh quang c a aflatoxin, b ng m t đ  k , hàm lộ ỳ ủ ằ ậ ộ ế ượng aflatoxin trong 

m u th  th c ăn chăn nuôi tính b ng micogram trên kilogram xác đ nh b ng cách so sánhẫ ử ứ ằ ị ằ  

di n tích các đ nh (pic) theo công th c :ệ ỉ ứ

           S V m

V V C S X

e w

K w e

     Trong đó :

          Se ­ Di n tích đ nh (pic) dung d ch thệ ỉ ị ử

          C ­ N ng đ  aflatoxin trong dung d ch h n h p aflatoxin theo m c 4.26.2.ồ ộ ị ỗ ợ ụ

         Vw ­ Th  tích dung d ch h n h p aflatoxin cho lên t m s c ký, mmể ị ỗ ợ ấ ắ 3

         VK ­ Th  tích cu i c a dung d ch th , mmể ố ủ ị ử 3

         Sw ­ Di n tích pic aflatoxinệ

         Ve ­ Th  tích dung d ch th  cho lên t m s c ký, mmể ị ử ấ ắ 3

         m ­ Kh i lố ượng m u ch a trong th  tích ph n chi t , l y làm s ch, g.ẫ ứ ể ầ ế ấ ạ

7.3.  K t qu  xác đ nh cu i cùng là giá tr  trung bình c ng c a ít nh t là 2 phép xác đ nh songế ả ị ố ị ộ ủ ấ ị  

song. Chênh l ch cho phép k t qu  các phép xác đ nh song song không đệ ế ả ị ược quá 20%        

8.  Biên b n thả ử

   Biên b n th  c n ghi các s  li u sau :ả ử ầ ố ệ

  1. Tên th c ăn chăn nuôi và mácứ

2. Đi u ki n thề ệ ử

3. Kh i lố ượng m u, gẫ

4. K t qu  thế ả ử

5. Ký hi u tiêu chu n SEV nàyệ ẩ

6. Th i gian th  (ngày th ).ờ ử ứ

Phụ lục

ST SEV 804 – 77 – Thu c th  – Hố ử ướng d n chung v  ti n hành thẫ ề ế ử