Xây dựng và thẩm định phương pháp xác định đồng thời Hypoglycin a và (Methylencyclopropyl) Glycin trong quả vải tại Cao Bằng bằng Sắc ký lỏng khối phổ hai lần

Sau đó, một kỹ thuật phân tích phù hợp được sử dụng để xác định hàm lượng HGA và MCPG trong dịch chiết từ đó tính được hàm lượng trong mẫu ban đầu.. HGA và MCPG có bản chất là acid amin

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

BẠCH THÚY ANH

XÂY DỰNG VÀ THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH ĐỒNG THỜI HYPOGLYCIN A VÀ (METHYLENCYCLOPROPYL)GLYCIN

SẮC KÝ LỎNG KHỐI PHỔ HAI LẦN

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

BẠCH THÚY ANH

XÂY DỰNG VÀ THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH ĐỒNG THỜI HYPOGLYCIN A VÀ (METHYLENCYCLOPROPYL)GLYCIN

SẮC KÝ LỎNG KHỐI PHỔ HAI LẦN

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

CHUYÊN NGÀNH: KIỂM NGHIỆM THUỐC – ĐỘC CHẤT

MÃ SỐ: 8720210

Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Lê Thị Hồng Hảo PGS.TS Phạm Thị Thanh Hà

LỜI CẢM ƠN

Trong thời gian thực hiện luận văn này, tôi đã rất may mắn khi nhận được sự giúp đỡ tận tình của các thầy cô giáo, các chuyên gia, các nghiên cứu viên, các anh chị kỹ thuật viên cùng tình cảm và sự khích lệ mà gia đình và bạn bè đã dành cho tôi

Tôi xin được bày tỏ sự kính trọng và lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS

Lê Thị Hồng Hảo, PGS.TS Phạm Thị Thanh Hà đã luôn tâm huyết và tận

tình hướng dẫn, chỉ bảo tôi trong suốt thời gian thực hiện và hoàn thành luận văn

Tôi xin được gửi lời cảm ơn sâu sắc và chân thành tới TS Trần Cao

Sơn đã cho tôi những lời khuyên quý báu, dành nhiều thời gian và tạo điều

kiện tối đa giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn này

Tôi xin chân thành cảm ơn các anh chị khoa Độc học & dị nguyên –

Viện kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia đã tạo điều kiện và

nhiệt tình giúp đỡ tôi trong thời gian thực hiện luận văn

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Ban Giám Hiệu, phòng Sau đại học, bộ môn Hóa phân tích và độc chất – trường Đại học Dược Hà Nội, cùng các thầy cô đã giảng dạy và giúp đỡ tôi trong quá trình học tập tại trường

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình và bạn bè – những người đồng hành không thể thiếu trong học tập và cuộc sống đã luôn động viên và khích lệ tôi những ngày qua

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày…tháng 03 năm 2019

Học viên

MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC BẢNG BIỂU

DANH MỤC HÌNH

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 2

1.1 Tổng quan về cây vải 2

1.1.1 Đặc điểm thực vật 2

1.1.2 Phân bố, sinh thái và bộ phận dùng 2

1.1.3 Thành phần hóa học 3

1.2 Tổng quan về Hypoglycin A và (Methylencyclopropyl)glycin 4

1.2.1 Nguồn gốc của HGA và MCPG từ thực phẩm 4

1.2.2 Độc tính của HGA và MCPG 4

1.2.3 Quy định hiện hành về HGA và MCPG 6

1.2.4 Cấu tạo và tính chất của Hypoglycin A và (Methylencyclopropyl)glycin 7

1.3 Phương pháp xác định HGA và MCPG 8

1.3.1 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao 9

1.3.2 Phương pháp sắc ký khí khối phổ 10

1.4 Tổng quan về phương pháp sắc ký lỏng khối phổ hai lần

(LC – MS/MS) 15

1.4.1 Nguyên lý hoạt động 15

1.4.2 Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao 16

1.4.3 Khối phổ (Mass Spectrometry) 18

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19

2.1 Đối tượng nghiên cứu 19

2.2 Phương tiện nghiên cứu 19

2.2.1 Thiết bị, dụng cụ 19

2.2.2 Dung môi, hóa chất 20

2.2.3 Chất chuẩn 20

2.2.4 Chuẩn bị dung dịch chuẩn 20

2.3 Nội dung nghiên cứu 22

2.3.1 Khảo sát các điều kiện xác định bằng LC-MS/MS 22

2.3.2 Khảo sát các điều kiện xử lý mẫu 22

2.3.3 Khảo sát ảnh hưởng nền 23

2.3.4 Xác nhận giá trị sử dụng 23

2.3.5 Đánh giá hàm lượng HGA và MCPG trong mẫu thực tế 23

2.4 Phương pháp nghiên cứu 23

2.4.1 Phương pháp lấy mẫu 23

2.4.2 Phươngphápxử lý mẫu 24

2.4.3.Phương phápsắc ký lỏng khối phổ hai lần (LC-MS/MS) 25

2.4.4 Phương pháp thẩm định 25

2.4.5 Phương pháp xử lý số liệu 27

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 28

3.1 Nghiên cứu phương pháp xác định đồng thời HGA và MCPG trong quả vải 28

3.1.1.Khảo sát điều kiện LC-MS/MS 28

3.1.2 Khảo sát quy trình xử lý mẫu 33

3.1.3 Khảo sát ảnh hưởng nền 40

3.2 Thẩm định phương pháp 41

3.2.1 Độ đặc hiệu 41

3.2.2 Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) 43

3.2.5 Độ tái lặp nội bộ 48

3.3 Ứng dụng phương pháp để phân tích mẫu quả vải 48

CHƯƠNG 4 BÀN LUẬN 50

KẾT LUẬN 52

Kết luận 52

Kiến nghị 52

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

FDA Cục quản lý thực phẩm và dược phẩm Hoa Kỳ

(United States Food and Drug Administration)

LC-MS/MS Sắc ký lỏng khối phổ hai lần

(Liquid chromatography tandem mass spectrometry)

LOD Giới hạn phát hiện

DANH MỤC BẢNG BIỂU

Bảng 1.1 Danh sách các trường hợp ngộ độc độc HGA xảy ra trên toàn cầu 5

Bảng 1.2 Một số nghiên cứu về HGA và MCPG 12

Bảng 2.1 Pha dung dịch chuẩn trung gian 21

Bảng 2.2 Pha dung dịch chuẩn làm việc 21

Bảng 3.1 Các điều kiện MS dùng để phân tích HGA và MCPG 28

Bảng 3.2 Các thông số tối ưu của MS 30

Bảng 3.3 Điều kiện gradient 32

Bảng 3.4 Ảnh hưởng của nền mẫu đối với HGA 40

Bảng 3.5 Tỷ lệ ion của HGA và MCPG 42

Bảng 3.6 Độ lặp lại, độ thu hồi của HGA 46

Bảng 3.7 Độ lặp lại, độ thu hồi của MCPG 47

Bảng 3.8 Độ tái lặp nội bộ 48

Bảng 3.9 Kết quả phân tích mẫu thực tế 49

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Cây vải (Litchi chinensis Sonn) 2

Hình 1.2 Quá trình chuyển hóa của Hypoglycin A 6

Hình 1.3 Công thức cấu tạo của HGA 7

Hình 1.4 Công thức cấu tạo của MCPG 7

Hình 1.5 Mô hình hệ thống LC-ESI-MS/MS 16

Hình 1.6 Sơ đồ cấu trúc của thiết bị khối phổ MS 18

Hình 2.1 Công thức cấu tạo của Phenylalanin 22

Hình 3.1 Phổ khối của các chất phân tích 29

Hình 3.2 Sắc đồ Dns-HGA, Dns-MCPG và Dns-PhA sử dụng cột C18 31

Hình 3.3 Sắc đồ tổng của HGA và MCPG 32

Hình 3.4 Sắc đồ MRM của HGA và MCPG 33

Hình 3.5 Biểu đồ kết quả khảo sát dung môi chiết 34

Hình 3.6 Biểu đồ kết quả khảo sát nồng độ dung môi 35

Hình 3.7 Biểu đồ kết quả khảo sát SPE 36

Hình 3.8 Sắc ký đồ khảo sát dung môi rửa tạp, rửa giải 37

Hình 3.9 Sắc đồ khảo sát thể tích dung môi rửa giải 38

Hình 3.10 Quy trình xử lý mẫu tối ưu 39

Hình 3.11 Đường chuẩn trên nền dung môi và nền mẫu thực 40

Hình 3.12 Sắc đồ mẫu trắng, mẫu chuẩn và mẫu trắng thêm chuẩn của HGA 42

Hình 3.13 Sắc đồ mẫu trắng, mẫu chuẩn và mẫu trắng thêm chuẩn của MCPG 43

Hình 3.14 Sắc đồ mẫu trắng thêm chuẩn tại mức nồng độ 0,05 mg/kg 44

Hình 3.15 Sắc ký đồ và đường chuẩn phân tích HGA 45

Hình 3.16 Sắc ký đồ và đường chuẩn phân tích MCPG 45

ĐẶT VẤN ĐỀ

Việt Nam là quốc gia nằm trong khu vực nhiệt đới gió mùa, có hệ thực vật vô cùng phong phú và đa dạng Do đó nước ta rất có thế mạnh về các loài cây ăn quả, nhiều loài đặc sản nổi tiếng được thế giới biết đến như bưởi, thanh long, vú sữa, xoài,… Trong đó, vải cũng là loại trái cây được nhiều người ưu thích và được xuất khẩu ngày càng nhiều sang các thị trường quốc tế

Tuy nhiên, một số trường hợp ngộ độc sau khi ăn quả vải chưa chín đã xảy ra ở nhiều quốc gia như Ấn Độ, Bangladesh, Jamaica,…[8] Năm 2017 ở Việt Nam đã xảy ra vụ ngộ độc với 4 cháu nhỏ, nghi do ăn quả vải rừng ở tỉnh Cao Bằng Theo các nghiên cứu, trong thịt quả và hạt quả vải nói riêng và một

số loại quả thuộc họ Bồ hòn nói chung (chôm chôm, ackee…) có thể chứa độc chất Hypoglycin A (HGA) và (Methylencyclopropyl)glycin (MCPG) [6], [9]

Do đó các nghiên cứu về hai độc chất HGA và MCPG cũng được quan tâm đến Hiện nay, trên thế giới đã có một số nghiên cứu về các phương pháp xác định HGA và MCPG trong quả vải Tuy nhiên, tại Việt Nam cho đến nay chưa có một phương pháp tiêu chuẩn nào đã và đang được áp dụng Do đó, đề

tài “Xây dựng và thẩm định phương pháp xác định đồng thời Hypoglycin A

và( Methylencyclopropyl)glycin trong quả vải tại Cao Bằng bằng sắc ký lỏng khối phổ hai lần” được thực hiện không chỉ có ý nghĩa về mặt khoa học

mà còn có ý nghĩa thực tiễn trong việc tìm hiểu, ngăn ngừa và hỗ trợ điều trị các ca nhiễm độc liên quan đến các chất này Mục tiêu của đề tài bao gồm:

1 Xây dựng và thẩm định phương pháp xác định đồng thời HGA và

MCPG trong quả vải bằng sắc ký lỏng khối phổ hai lần

2 Ứng dụng phương pháp để xác định hàm lượng HGA và MCPG trong một số mẫu quả vải tại tỉnh Cao Bằng

Chương 1 TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về cây vải

1.1.1 Đặc điểm thực vật

Cây vải có tên khoa học là Litchi chinensis Sonn., họ Bồ hòn (Sapindaceae) Tên khác là Nephelium litchi Cambess [3], [4]

Cây gỗ cao 8 - 15m Cành tròn, màu gụ Tán lá rộng Lá kép lông chim,

2 - 4 đôi lá chét cứng dai, đầu nhọn, gốc hơi tù, mặt trên sáng, mặt dưới thẫm Hoa xếp thành hình chùy ở ngọn cành, có lông nâu, cuống hoa có đốt Đài hình đầu phân thùy nhẵn, có lông cả 2 mặt Không có tràng Đĩa vòng, phân thùy, nhẵn Nhị 7 - 10 Bầu 2 ô, có lông Quả hình trứng, vỏ sù xì, áo hạt dày bao gần hoàn toàn hạt, hạt màu nâu Hoa tháng 2 - 3, quả chín từ tháng 5 - 7 [3], [4]

Hình 1.1 Cây vải (Litchi chinensis Sonn.)

1.1.2 Phân bố, sinh thái và bộ phận dùng

Chi Litchi Sonn chỉ có một loài trên thế giới là Litchi chinensis Sonn

với 3 loài phụ là:

 Litchi chinensis subsp chinensis: Loài phụ này có nguồn gốc ở Bắc Việt

Trung Quốc Vải trồng ở Việt Nam có nhiều giống, song đáng lưu ý nhất

là loại vải quả to, hình trứng, vỏ quả khi chín màu đỏ nâu, gai hơi nhọn Loại vải khác là loại có dáng cây nhỏ hơn, quả trong nhỏ, gần như không

rõ gai, khi chín vỏ quả màu vàng nâu, tên thường gọi là “vải thiều” [3]

 Litchi chinensis subsp philippinensis (Radlk.) Leenth.: Loài này mọc

hoang dại ở Philippin, đôi khi cũng thấy trồng [3]

 Litchi chinensis subsp javensis Leenth: Loài phụ thứ ba này mới chỉ

thấy trồng ở phía tây đảo Java (Indonesia) và Nam Đông Dương (Campuchia và Nam Việt Nam) [3]

Nhìn chung tất cả những loài phụ vải đều là cây nhiệt đới hoặc cận nhiệt đới Chúng thích nghi với điều kiện khí hậu nóng và ẩm; nhiệt độ trung bình 20 - 25oC Đối với 2 giống vải chính trồng ở các tỉnh phía bắc, giống vải quả hình trứng, to có khả năng chịu lạnh cao hơn giống vải thiều Vải ưa sống trên nhiều loại đất có thành phần sét cao và thoát nước nhanh [3]

Đặc biệt ở Cao Bằng cũng có một giống vải mọc tự nhiên, ưa những nơi ẩm ướt trong rừng hoặc ven suối Cây có quả nhỏ, hạt to hình bầu dục, khi chín có màu đỏ tươi và vị chua

Bộ phận dùng là hạt, thường gọi là Lệ chi hạch Còn áo hạt của quả vải (cùi vải), thường gọi là Lệ chi nhục [3], [4]

1.1.3 Thành phần hóa học

Quả vải gồm 8 - 15% vỏ, 70 - 86% cùi và 4 - 18% hạt [3]

Cùi vải chứa đường (chủ yếu là glucose và sacharose), đường khử, acid citric, acid ascorbic, protein, chất béo, acid nicotic riboflavin, caroten, acid amin và các nguyên tố đa vi lượng như calci, phosphor, sắt [3], [4]

Vỏ quả chứa cyanidin diglycosid và một số anthoxanthin vàng [3]

Hạt vải có chứa α-(methylenecyclopropylglycin), saponosid, tannin [3], [4]

1.2 Tổng quan về Hypoglycin A và (Methylencyclopropyl)glycin

1.2.1 Nguồn gốc của HGA và MCPG từ thực phẩm

HGA và MCPG là các độc tố tự nhiên được tìm thấy chủ yếu trong các

loại quả chưa chín của họ Bồ hòn (Sapindaceae), họ này ở Việt Nam phổ biến

có trong vải, chôm chôm, dâu da đất, … Nồng độ của HGA trong phần thịt quả dao động từ 1000 ppm trong quả non đến dưới 0,1 ppm trong quả chín [6] Đối với MCPG, trong phần hạt vải là 1,8 µg/g, cùi vải chưa chín là 0,57 µg/g và cùi vải chín là 0,18 µg/g [10] Do đó các độc tố này chỉ gây độc khi quả còn non

1.2.2 Độc tính của HGA và MCPG

Các độc tố HGA và MCPG chính là nguyên nhân dẫn đến hội chứng hạ đường huyết (THS) với các triệu chứng là buồn nôn, nôn mửa, hôn mê, động kinh, nặng nhất là hạ đường huyết sâu dẫn tới tổn thương não bộ [15] Ảnh hưởng tiêu cực của THS sẽ càng lớn nếu cơ thể đang có mức glucose thấp, điển hình là lúc đói, cơ thể suy nhược, ăn phải quá nhiều thực phẩm có chứa HGA và MCPG, hay có những bệnh lý khác, hoặc có thể trạng yếu như ở trẻ

em, đặc biệt trẻ suy dinh dưỡng

Đã có những báo cáo về hàng loạt ca ngộ độc xảy ra sau khi ăn trái cây

thuộc họ Sapindaceae, xảy ra tại nhiều quốc gia như Ấn Độ, Bangladesh,

Jamaica,… Và tại Việt Nam, cũng đã đã xảy ra vụ ngộ độc với 4 cháu nhỏ, nghi do ăn quả vải rừng ở tỉnh Cao Bằng năm 2017 Danh sách những trường hợp ngộ độc HGA sau khi ăn quả trong họ Bồ hòn được chỉ ra trong bảng 1.1

Bảng 1.1 Danh sách các trường hợp ngộ độc HGA xảy ra trên toàn cầu

Quốc gia Số ca tử vong Năm Tài liệu tham

và sau đó trải qua quá trình oxy hóa decarboxyl hóa thành MCPA-CoA [25] (theo sơ đồ hình 1.3) MCPA-CoA ức chế một số coenzym A dehydrogenase cần thiết cho quá trình tạo glucose [8], [26] Sự suy giảm trữ lượng glucose và

sự bất lực của các tế bào để tái tạo glucose dẫn đến hạ đường huyết Ngoài ra, HGA tham gia ức chế không hồi phục quá trình tạo glucose bằng cách hạn chế các cơ chất tự do là CoA và carnitin – các chất cần thiết cho quá trình oxy hóa các acid béo chuỗi dài [19]

Hình 1.2 Quá trình chuyển hóa của Hypoglycin A

Theo nghiên cứu của Klaus Melde và các cộng sự, MCPG có độc tính tương tự với HGA nhưng nhẹ hơn Khi thử invivo trên chuột, HGA và MCPG đều có sự phụ thuộc liều lượng và thời gian làm giảm glucose huyết tương [16]

1.2.3 Quy định hiện hành về HGA và MCPG

Hiện nay Cục quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ (FDA) đã công bố giới hạn của hàm lượng HGA trong quả ackee khô, ackee đóng hộp nhập khẩu vào nước này là 100 mg/kg [23] [24] Tuy nhiên tại Việt Nam vẫn chưa có quy định về hàm lượng HGA và MCPG trong thực phẩm Do đó đề tài nghiên cứu về HGA và MCPG vừa có tính khoa học, vừa có giá trị thực tiễn cao góp phần bảo vệ sức khỏe cho người tiêu dùng, đặc biệt là trẻ em

Hypoglycin A

1.2.4 Cấu tạo, tính chất của Hypoglycin A và (Methylencyclopropyl)glycin

Hypoglycin A và (Methylencyclopropyl)glycin là acid amin, có công thức phân tử và các tính chất sau:

Hình 1.3 Công thức cấu tạo của HGA

Hình 1.4 Công thức cấu tạo của MCPG

 (Methylencyclopropyl)glycin

 Phân tử gam: 127,14 g/mol

 Công thức phân tử: C6H9NO2

 Tên IUPAC: 2-(cyclopropylamino)prop-2-enoic acid

 MCPG là đồng đẳng của HGA, do đó có các tính chất tương tự như HGA

1.2.4.2 Tính chất hóa học

Do có cấu trúc α-amino acid, nên HGA và MCPG mang các tính chất

cơ bản của một α-amino acid, có các tính chất gây ra bởi nhóm –NH2, nhóm –COOH, trong đó có một số phản ứng quan trọng như:

 Phản ứng với tác nhân acyl hóa: phản ứng với các tác nhân acyl hóa như acetyl clorid, phthalic anhydrid

 Phản ứng với dansyl clorid (dns-Cl): phản ứng thế ái nhân tạo nên dẫn xuất dansyl, trong môi trường pH > 9,51

 Phản ứng với thuốc thử Sanger (1-floro-2,4-dinitrobenzen): trong pH kiềm nhẹ cho phản ứng với thuốc thử Sanger tạo dẫn xuất màu vàng

 Phản ứng với thuốc thử phenyl isothiocyanat (PITC)

1.3 Phương pháp xác định HGA và MCPG

Có nhiều nghiên cứu xác định HGA và MCPG trong mẫu thịt quả họ

Bồ hòn đã được công bố Về nguyên tắc, đầu tiên chất phân tích được tách ra khỏi nền mẫu vào một dịch chiết thích hợp Sau đó, một kỹ thuật phân tích phù hợp được sử dụng để xác định hàm lượng HGA và MCPG trong dịch chiết từ đó tính được hàm lượng trong mẫu ban đầu

HGA và MCPG có bản chất là acid amin đồng thời hàm lượng trong mẫu vải thường rất thấp (cỡ ppm) nên sắc ký là phương pháp được sử dụng phổ biến để xác định hàm lượng 2 độc tố này do ưu điểm về độ nhạy và tính

phân tách khi qua cột sắc ký cũng như tăng khả năng xác định của dectector Thường các dẫn xuất được sử dụng phải đảm bảo về tính ổn định, điều kiện phản ứng nhẹ nhàng, đơn giản Các thuốc thử hay được sử dụng là: fluorenylmethyloxycarbonyl clorid (Fmoc-Cl), dansyl clorid (Dns-Cl), phenyl isothiocyanat (PITC), ortho-phthalaldehyd (OPA)…

1.3.1 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

Sắc ký lỏng là quá trình tách xảy ra trên cột tách với pha tĩnh là chất rắn và pha động là chất lỏng Mẫu phân tích được chuyển lên cột tách dưới dạng dung dịch Khi tiến hành phân tích sắc ký, các chất phân tích được phân

bố liên tục giữa pha động và pha tĩnh Trong hỗn hợp các chất phân tích, do cấu trúc phân tử và tính chất lí hoá của các chất khác nhau, nên khả năng tương tác của chúng với pha tĩnh và pha động khác nhau Do vậy, chúng di chuyển với tốc độ khác nhau và tách ra khỏi nhau Trong HPLC, pha tĩnh chính là chất nhồi cột làm nhiệm vụ tách hỗn hợp chất phân tích, đó là những chất rắn, xốp và kích thước hạt rất nhỏ, từ 3 – 7 µm Tuỳ theo bản chất của pha tĩnh, trong phương pháp sắc ký lỏng thường chia làm 2 loại: sắc ký pha thường (NP-HPLC) và sắc ký pha đảo (RP-HPLC) [1]

Ware JM đã sử dụng phương pháp HPLC để xác định hàm lượng HGA trong quả ackee HGA được chiết ra khỏi nền mẫu bằng hỗn hợp dung môi ethanol 80% trong nước Dịch chiết được tạo dẫn xuất với phenylisothiocyanat và được phân tích bằng detector UV ở bước sóng 254nm Giới hạn phát hiện của phương pháp là 50μg/g [27]

Isenberg S L và các cộng sự đã sử dụng phương pháp sắc ký lỏng

LC-MS/MS để xác định HGA và MCPG trong thịt quả họ Sapindaceae Mẫu

được chiết bằng dung môi ethanol 80% trong nước Dịch chiết thu được tạo dẫn chất với dansyl clorid, sau đó làm sạch qua cột HLB với dung môi rửa tạp

và dung môi rửa giải là nước/acetonitril 98:2 và nước/acetonitril 2:98 Dịch

rửa được thổi khô, hòa tan lại trong acid formic 1% và được phân tích bằng LC-MS/MS Giới hạn phát hiện của phương pháp là 1 µg/g [14]

Ziegler và cộng sự đưa ra phương pháp phân tích các acid amin trong mẫu thực vật bằng cách chiết trong dung môi methanol 20% trong nước và tạo dẫn xuất với FMOC-Cl Dịch chiết được phân tích bằng LC-MS/MS với giới hạn phát hiện đạt được của hầu hết các acid amin là 1nM [28]

Theo nghiên cứu của Carlier, mẫu máu toàn phần sau khi ngộ độc HGA được làm sạch bằng cột chiết pha rắn HILIC Sau đó tạo dẫn xuất với dansyl clorid và định lượng bằng UHPLC-HRMS/MS [7]

Gray N và cộng sự đã chiết các acid amin ra khỏi nền mẫu nước tiểu của các loài động vật có vú bằng dung môi methanol và acid formic 1% Dịch chiết được phân tích bằng LC-MS/MS [13]

Nhóm nghiên cứu của Sander J sử dụng dung môi methanol để chiết chất phân tích ra khỏi nền mẫu huyết thanh và nước tiểu Dịch chiết được tạo dẫn xuất butyl ester và phân tích bằng LC-MS/MS [21]

1.3.2 Phương pháp sắc ký khí khối phổ

Sắc ký khí có pha động là chất khí, pha tĩnh là rắn hoặc lỏng Phương pháp có hiệu quả tách rất cao và thời gian phân tích nhanh, hơn nữa với những detector phù hợp, giới hạn phát hiện của phương pháp đạt tới cỡ ng/mL Tuy nhiên phương pháp có hạn chế là đối tượng phân tích hẹp, chỉ phù hợp với các chất dễ bay hơi Ngày nay, sắc ký khí là một phương pháp đã phát triển đầy đủ, đóng góp nhiều vào phân tích môi trường

Y Gaillard và các cộng sự đã sử dụng sắc ký khí kết nối khối phổ để xác định hàm lượng HGA trong quả ackee Phương pháp sử dụng chất chuẩn nội là phenylalanin Chất phân tích được dẫn xuất với N,O-

(BSTFA) trước khi phân tích Giới hạn phát hiện của phương pháp là 0,1 mg/g [12]

Bảng 1.2 thể hiện một số phương pháp đã được sử dụng để phân tích HGA và MCPG trên các nền mẫu khác nhau:

Bảng 1.2 Một số nghiên cứu về HGA và MCPG

Đối tượng thử

HPLC [27] HGA Quả ackee Detector UV, bước sóng

400 μg/g LC-

MS/MS

[14] HGA

và MCPG

Thịt quả của

họ Sapindaceae (vải, chôm

Cột sắc ký (2,1 x 50mm, 1,8µm)

Thể tích tiêm 2,5 µL Pha động: acid formic

Sử dụng chất chuẩn nội là đồng vị của HGA và MCPG

Dung môi chiết ethanol

Thời gian lưu của HGA và MCPG là 2,58 và 2,75 phút Khoảng tuyến tính

Chế độ ESI dương

Làm sạch qua cột HLB

Dung môi rửa tạp và rửa giải là nước/ACN 98:2 và 2:98 Dịch được thổi khô

và hòa lại bằng acid formic 1%

là 1µg/g

[21] HGA Mẫu huyết

thanh và nước tiểu

Cột C18 (2,1mm x 50

mm, 1,7µm) Thể tích tiêm 5µL Chế độ ESI dương

Sử dụng chất chuẩn nội là d3-leucine

Dung môi chiết methanol

Thổi khô dịch chiết và tạo dẫn xuất với butanolic HCl Dịch thu được hòa trong hỗn hợp methanol:nước (80:20)

Cột Nucleoshell RP 18 (50 x3mm; 2,7 µm)

Pha động: ammonium format 10mM, pH 4,5 và ACN

Dung môi chiết methanol 20% trong nước

Sử dụng nội chuẩn là norvalin

Tạo dẫn xuất với Fmoc-Cl

Phân tích đồng thời

21 acid amin Giới hạn phát hiện của hầu hết các acid amin là 1nM

Tốc độ dòng 0,9mL/phút Chế độ ESI âm

[13] Acid

amin

Mẫu nước tiểu của động vật có

vú

Cột Acquity UPLC HSS T3 (150 x 2,1 mm; 1,8 µm)

Thể tích tiêm 2 µL Tốc độ dòng 0,6mL/phút Pha động là acid formic 0,1% trong nước và acid formic 0,1% trong ACN Chế độ ESI dương

Dung môi chiết methanol

và acid formic 1%

Tạo dẫn xuất với aminoquinolyl-N-

6-hydroxy-succinimidyl carbamat

Phân tích đồng thời

20 acid amin Thời gian phân tích

là 7,5 phút Khoảng tuyến tính

từ 0,2 – 200 µM

GC-MS [12] HGA Quả ackee Khí mang Helium

Tốc độ khí mang 1 mL/phút

Nhiệt độ interface 280oC, nhiệt độ source 200oC

Sử dụng phenylalanin làm nội chuẩn

Tạo dẫn xuất với bis(trimethylsilyl)tri-

N,O-fluoroacetamid có chứa 1% trimethyl chlorosilan (BSTFA)

Thời gian phân tích

là 25 phút Giới hạn phát hiện

là 0,1 mg/g Khoảng tuyến tính

từ 1 - 20 mg/g

Như vậy, các nghiên cứu chủ yếu sử dụng sắc ký lỏng khối phổ 2 lần để phân tích HGA và MCPG, do đây là phương pháp có độ nhạy cao, đáp ứng chọn lọc Các loại dẫn xuất thường được sử dụng như Fmoc-Cl, dansyl clorid, PITC… cũng khá phổ biến, điều kiện tạo dẫn xuất đơn giản Trong nghiên cứu này, chúng tôi lựa chọn phương pháp phân tích bằng sắc ký lỏng kết nối khối phổ hai lần để xác định HGA và MCPG trong nền mẫu thịt quả vải, có

sử dụng chuẩn nội, lựa chọn chiết bằng dung môi và làm sạch qua SPE

1.4 Tổng quan về phương pháp sắc ký lỏng khối phổ hai lần

(LC – MS/MS)

1.4.1 Nguyên lý hoạt động

Về cơ bản, sắc ký lỏng khối phổ là phương pháp sắc ký lỏng sử dụng

bộ phận phát hiện là detector khối phổ

Sắc ký lỏng là quá trình tách xảy ra trên cột tách với pha tĩnh là chất rắn và pha động là chất lỏng (sắc ký lỏng - rắn) [1]

Khối phổ là thiết bị phân tích dựa trên cơ sở xác định khối lượng phân

tử của các hợp chất hóa học bằng việc phân tách các ion phân tử theo tỉ số giữa khối lượng và điện tích (m/z) của chúng Các ion có thể tạo ra bằng cách thêm hay bớt điện tích của chúng như loại bỏ electron, proton hóa, Các ion tạo thành này được tách theo tỉ số m/z và phát hiện, từ đó có thể cho thông tin

về khối lượng hoặc cấu trúc phân tử của hợp chất [1]

Một sơ đồ tóm tắt mô hình hệ thống LC-MS/MS được trình bày ở hình 1.5

 Pha động có độ phân cực cao: có thành phần chủ yếu là nước, tuy nhiên

để phân tích các chất hữu cơ, cần thêm các dung môi khác để giảm độ phân cực như MeOH, ACN Pha động loại này được dùng trong sắc ký pha liên kết ngược [1]

 Pha động có độ phân cực thấp: bao gồm các dung môi ít phân cực như cyclopentan, n-pentan, n-heptan, n-hexan, 2-chloropropan, cacbondisulfua (CS2), chlorobutan, CCl4, toluen [1]

Tuy nhiên pha động một thành phần đôi khi không đáp ứng được khả năng rửa giải, người ta thường phối hợp 2 hay 3 dung môi để có được dung môi có độ phân cực từ thấp đến cao phù hợp với phép phân tích Sự thay đổi thành phần pha động theo thời gian gọi là rửa giải gradient nồng độ [1]

Mẫu

Mảnh mẹ được sàng lọc bị phân mảnh ở Q2

Mảnh mẹ được sàng lọc ở Q1

Mảnh con được sàng lọc ở Q3

Sắc ký đồ

Cột LC

Q2

1.4.2.2 Pha tĩnh

Pha tĩnh chính là chất nhồi cột, đó là những chất rắn, xốp và kích thước hạt rất nhỏ, từ 3 – 7 µm Tuỳ theo bản chất của pha tĩnh, trong phương pháp sắc ký lỏng thường chia làm 2 loại: sắc ký pha thường (NP-HPLC) và sắc ký pha đảo (RP- HPLC)

 Sắc ký pha thường: pha tĩnh có bề mặt là các chất phân cực (đó làcác silica trần hoặc các silica được gắn các nhóm ankyl có ít cacbon mang các nhóm chức phân cực: -NH2, -CN ), pha động là các dung môi hữu

cơ không phân cực như: n-hexan, toluen Hệ này có thể tách đa dạng các chất không phân cực hay ít phân cực [1]

 Sắc ký pha đảo: pha tĩnh thường là các silica đã được ankyl hoá, không phân cực, loại thông dụng nhất là –C18H37, còn pha động phân cực: nước, methanol, axetonitril Trong rất nhiều trường hợp thì thành phần chính của pha động lại là nước nên rất kinh tế Hệ này được sử dụng để tách các chất có độ phân cực rất đa dạng: từ rất phân cực, ít phân cực tới không phân cực [1]

1.4.2.3 Detector

Detector là bộ phận quan trọng quyết định độ nhạy của phương pháp Tuỳ thuộc bản chất lí hoá của chất phân tích mà lựa chọn detector cho phù hợp Một số loại detector dùng trong HPLC như: Detector quang phổ hấp thụ phân tử (UV-VIS), detector huỳnh quang (RF), detector độ dẫn, detector mảng diot (DAD), detector khối phổ (MS) [1]

Xử lý và lưu dữ liệu

Detector Phân tích

khối Nguồn ion

Tránh ion phân tích va chạm với ion trong không khí

Phổ khối

1.4.3 Khối phổ (Mass Spectrometry)

Chân không cao

Hình 1.6 Sơ đồ cấu trúc của thiết bị khối phổ MS

Cấu tạo của một thiết bị khối phổ bao gồm 3 phần chính: nguồn ion, thiết bị phân tích và bộ phận phát hiện Trước hết, các mẫu được ion hóa trong nguồn ion, sau đó đưa vào bộ phận phân tích khối để tách các ion theo tỉ

số m/z Sau đó các ion đi vào bộ phận phát hiện (detector), sẽ được khuếch đại và chuyển thành tín hiệu Các tín hiệu thu được sẽ chuyển vào máy tính để

xử lí và lưu trữ [1]

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu của đề tài là 2 loại độc tố Hypoglycin A (HGA)

- Máy đồng nhất mẫu, Phillips

- Hệ thống chiết pha rắn SPE, Waters

- Cân phân tích (có độ chính xác 0,1 mg), Metter Toledo

- Máy lắc xoáy, IKA

- Máy ly tâm Mikro 200R, Hettich

- Máy rung siêu âm

- Máy thổi khí nitro N-EVAPTM 112, điều nhiệt OA-HEAT model 8125

- Máy đo pH Mettler Toledo 1.20.06

2.2.1.2 Dụng cụ

 Cột chiết pha rắn SPE Oasis HLB, Supelco Discovery DSC18

 Micropipet có thể tích điều chỉnh được 10-100 µL, 100-1000 µL,

1000-5000 µL và đầu côn tương ứng

 Bình định mức các loại

 Ống ly tâm 15 mL, 50 mL

 Màng lọc mẫu 0,22 µm

 Các dụng cụ thủy tinh khác đạt tiêu chuẩn dùng cho phòng thí nghiệm

2.2.2 Dung môi, hóa chất

Các loại hoá chất sử dụng đều thuộc loại tinh khiết phân tích

- Dansyl clorid, Sigma-Aldrich

2.2.3 Chất chuẩn

- Chuẩn HGA 1mg, TRC, độ tinh khiết 85%

- Chuẩn MCPG 1 mg, TRC, độ tinh khiết 98%

- Nội chuẩn Phenylalanin (PhA), Sigma-Aldrich

2.2.4 Chuẩn bị dung dịch chuẩn

- Dung dịch chuẩn gốc: chuyển toàn bộ mỗi 1 mg chất chuẩn vào bình định mức 10 mL, định mức tới vạch bằng nước cất, lắc đều, thu được các

dung dịch chuẩn gốc HGA 85 µg/mL, MCPG 98 µg/mL Bảo quản ở 2oC –8

oC, sử dụng trong 1 năm

- Dung dịch chuẩn trung gian hỗn hợp 10 µg/mL: hút mỗi dung dịch chuẩn gốc theo bảng 2.1 vào bình định mức 10 mL, định mức tới vạch bằng nước cất, lắc đều Bảo quản ở 2oC – 8oC, sử dụng trong 6 tháng

Bảng 2.1 Pha dung dịch chuẩn trung gian

Vdd chuẩn gốc (µL) 1176 1020

- Dung dịch chuẩn trung gian hỗn hợp 1 µg/mL: hút 1 mL dung dịch chuẩn trung gian hỗn hợp 10 µg/mL vào bình định mức 10 mL, định mức tới vạch bằng nước cất, lắc đều Bảo quản ở 2oC – 8oC, sử dụng trong 1 tháng

- Dãy dung dịch chuẩn làm việc: pha các dung dịch chuẩn làm việc theo bảng 2.2

Bảng 2.2 Pha dung dịch chuẩn làm việc

2.3 Nội dung nghiên cứu

2.3.1 Khảo sát các điều kiện xác định bằng LC-MS/MS

- Khảo sát điều kiện khối phổ: tìm các điều kiện tối ưu của MS để xác định ion mẹ; lựa chọn các ion con phù hợp

- Khảo sát điều kiện sắc ký lỏng: khảo sát điều kiện gradient

2.3.2 Khảo sát các điều kiện xử lý mẫu

- Tham khảo các nghiên cứu trước đây và thực hiện các khảo sát:

 Khảo sát dung môi chiết

 Khảo sát bước làm sạch bằng SPE

- Trong nghiên cứu này, có sử dụng chất chuẩn nội phân tích cùng với HGA và MCPG để hạn chế sai số trong quá trình xử lý mẫu và phân tích trên thiết bị Phenylalanin (PhA) được ưu tiên lựa chọn do PhA có cùng bản chất acid amin với 2 chất phân tích, chi phí thấp, thích hợp làm chất chuẩn nội

Hình 2.1 Công thức cấu tạo của Phenylalanin

- Dansyl clorid là tác nhân dẫn xuất được lựa chọn, đây là thuốc thử được

sử dụng phổ biến trong phân tích các acid amin bằng sắc ký khối phổ Đối với phản ứng dansyl hóa, cần khống chế pH trên mức pKa của nhóm amin

để nhóm này tồn tại dưới dạng NH2, ở đây sử dụng đệm PBS đã điều

2.3.3 Khảo sát ảnh hưởng nền

Tiến hành lập các đường chuẩn ở các mức nồng độ 10, 20, 50, 100, 200ng/mL trên nền dung môi HCOOH 0,1%/ACN và trên nền mẫu trắng, thêm chuẩn ở các mức nồng độ tương ứng, tiến hành xử lý mẫu theo quy trình

đã được tối ưu Sử dụng tín hiệu diện tích pic của chuẩn thu được để dựng đường chuẩn, tính % sai khác của độ dốc của đường chuẩn trên nền mẫu và đường chuẩn trên dung môi

2.3.5 Đánh giá hàm lượng HGA và MCPG trong mẫu thực tế

- Hiện nay mới chỉ phát hiện được các ca ngộ độc vải tại Cao Bằng Do đó, nghiên cứu tập trung đối tượng mẫu quả vải thu tại tỉnh Cao Bằng

- Ứng dụng phương pháp phân tích đã khảo sát để phân tích và đánh giá kết quả

2.4 Phương pháp nghiên cứu

2.4.1 Phương pháp lấy mẫu

- Lấy mẫu theo phương pháp lấy mẫu ngẫu nhiên

- Các cây được đánh dấu cho lần lấy mẫu tiếp theo

- Địa điểm lấy mẫu: Cao Bằng

* Chuẩn bị mẫu sơ bộ:

Mỗi mẫu lấy tối thiểu 100 g, xay nghiền nhỏ bằng máy đồng nhất mẫu

* Quy trình chiết dự kiến:

- Cân 2 g mẫu thịt quả vào ống ly tâm 50 mL, thêm chất nội chuẩn

- Chiết lặp 2 lần:

 Thêm 4 mL dung môi chiết

 Rung siêu âm trong 10 phút

 Ly tâm ở 6000 vòng/phút trong 5 phút

 Chuyển toàn bộ dịch phía trên sau ly tâm vào bình định mức 10 mL

- Định mức đến 10 mL bằng dung môi chiết

- Lọc qua màng lọc 0,45 μm

- Cho vào ống ly tâm 15 mL: 500 μL dịch chiết + 75 μL đệm + 250 μL dansyl clorid 1mg/mL [14]

- Để yên tạo dẫn xuất ở 60ºC trong tủ sấy, thời gian 10 phút

- Thêm 9 mL nước cất, lắc đều, làm sạch bằng cột SPE HLB

 Hoạt hóa cột bằng 3 mL MeOH, 3 mL H2O

 Nạp mẫu, tốc độ 1 giọt/giây

 Rửa tạp bằng 3 mL nước cất

 Rửa giải bằng 3 mL methanol

- Thổi khô dịch rửa giải sau đó hòa tan lại bằng 500 μL HCOOH 1% trong

2.4.3 Phương pháp sắc ký lỏng khối phổ hai lần (LC-MS/MS)

Trong nghiên cứu này, sử dụng thiết bị LC-MS/MS gồm:

- Hệ thống sắc ký lỏng Shimadzu gồm 2 bơm cao áp LC 20AD-XR với bộ

ổn nhiệt cột CTO-20A và bộ tiêm mẫu tự động SIL 20AC-XR

Ngoài ra, tính chọn lọc còn được khẳng định bằng số điểm nhận dạng và tỷ

lệ các ion theo tiêu chuẩn EC 657/20002 của Châu Âu

2.4.4.2 Giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ)

LOD, LOQ được xác định dựa trên tỷ lệ tín hiệu nhiễu đường (S/N): Phân tích mẫu thêm chuẩn ở nồng độ thấp còn có thể xuất hiện tín hiệu của chất phân tích Xác định tỷ lệ tín hiệu chia cho nhiễu (S/N = Signal to noise ratio) [2]

LOD là nồng độ mà tại đó tín hiệu lớn gấp 3 lần nhiễu (S/N = 3)

LOQ là nồng độ mà tại đó tín hiệu lớn gấp 10 lần nhiễu (S/N = 10)

2.4.4.3 Khoảng làm việc và đường chuẩn

Để xác định khoảng làm việc chúng tôi thực hiện đo các dung dịch chuẩn có nồng độ thay đổi từ 10 đến 200 ng/mL (tương đương 0,05 đến 1 mg/kg trên nền mẫu) và khảo sát sự phụ thuộc của tín hiệu vào nồng độ Sau

đó vẽ đường cong phụ thuộc giữa diện tích pic thu được vào nồng độ, quan sát sự phụ thuộc cho đến khi không còn tuyến tính [2]

Sau khi xác định được khoảng tuyến tính của các chất, chúng tôi đã xây dựng đường chuẩn trên nền mẫu thực (pha trên nền mẫu trắng), nhằm mục đích loại trừ ảnh hưởng của nền mẫu đến kết quả phân tích Vẽ đường cong phụ thuộc giữa tỷ lệ tín hiệu chất phân tích với nồng độ chất phân tích [2]

2.4.4.4 Độ lặp lại và độ thu hồi

Để xác định độ lặp lại và độ thu hồi của phương pháp phân tích, chúng tôi tiến hành thí nghiệm lặp lại trên nền mẫu trắng thêm chuẩn ở 3 mức nồng

độ khác nhau là 0,05; 0,5 và 1 mg/kg (n = 6) và tính toán kết quả theo các công thức sau:

- Độ lặp lại được biểu diễn theo độ lệch chuẩn tương đối RSD(%):

RSD% =

S =

Trong đó:

: nồng độ tính được của lần thí nghiệm thứ “i”

: nồng độ trung bình tính được của N lần thí nghiệm

S: độ lệch chuẩn

N: số lần thí nghiệm

 Độ thu hồi

Trong đó:

R: độ thu hồi (%)

C: nồng độ chất phân tích trong mẫu trắng thêm chuẩn

Cc: nồng độ chuẩn thêm theo lý thuyết

2.4.4.5 Độ tái lặp nội bộ

Thực hiện phân tích cùng một mẫu trắng, thêm chuẩn ở mức 0,5 mg/kg vào hai ngày khác nhau Tính độ tái lặp nội bộ theo độ lệch chuẩn tương đối RSD(%) như công thức ở phần độ lặp lại

2.4.5 Phương pháp xử lý số liệu

Tính hàm lượng HGA và MCPG trong mẫu bằng phần mềm của thiết

bị LC-MS/MS (Analyst 1.56) Các kết quả thẩm định phương pháp được xử

lý bằng phần mềm Microsoft Excel 2010

Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

3.1 Nghiên cứu phương pháp xác định đồng thời HGA và MCPG trong quả vải

3.1.1 Khảo sát điều kiện LC-MS/MS

Bảng 3.1 Các điều kiện MS dùng để phân tích HGA và MCPG

Dns-MCPG 361

169,8 31 Xác nhận 156,8 38 Định lượng

Dns-PhA 398,8

169,8 31 Xác nhận 156,8 38 Định lượng

Nhận xét: Qua khảo sát, điều kiện khối phổ hoàn toàn phù hợp với

công thức phân tử của các chất phân tích với ion mẹ có số khối là

[dns-dạng IP này do Hội đồng Châu Âu quy định và đối với kỹ thuật LC-MS/MS,

số điểm IP cần là 4 để khẳng định chắc chắn sự có mặt của một chất Vì vậy, phương pháp phù hợp với quy định của Châu Âu Hình 3.1 thể hiện phổ khối của các chất phân tích

Hình 3.1 Phổ khối của các chất phân tích

Để tối ưu hóa điều kiện MS cho từng chất, nhóm nghiên cứu sử dụng

kỹ thuật FIA, nghĩa là hỗn hợp chuẩn có nồng độ 1 µg/mL được bơm trực tiếp vào khối phổ cùng với dòng pha động mà không qua cột sắc ký với điều kiện như sau: Pha động là (A) dung dịch HCOOH 0,1 % trong H2O và (B) ACN Chọn chế độ khảo sát tự động đối với từng ion con định lượng và định tính của từng chất Khảo sát các thông số cho bộ phận tạo nguồn ion:

- ISV (IonSpray Voltage - Thế ion hóa)

- TEM (Temperature - Nhiệt độ của nguồn)

Dns-MCPG

Dns-HGA và Dns-PhA

- GS2 (Ion Source Gas 2 - Khí nguồn ion 2)

- CUR (Curtain Gas - Khí mang)

- CAD (Collisionally Activated Dissociation Gas - Khí va chạm ở Q2) Qua khảo sát, thu được giá trị tối ưu của từng thông số trên cho cả các chất nghiên cứu Các giá trị được liệt kê trong bảng 3.2

Bảng 3.2 Các thông số tối ưu của MS

(oC)

GS1 (psi)

GS2 (psi)

CUR (psi)

CAD (psi)

Giá trị tối

Như vậy, các điều kiện khối phổ đã được lựa chọn xác định HGA và MCPG bằng MS/MS theo chế độ ion dương với nguồn ESI

3.1.1.2 Khảo sát điều kiện LC

Pha tĩnh là C18 được ưu tiên lựa chọn do tính chất phổ biến rộng rãi và

có một số nghiên cứu trước đây cũng sử dụng các loại cột có bản chất pha tĩnh này Hình 3.2 thể hiện sắc đồ của các chất phân tích sử dụng cột C18

Hình 3.2 Sắc đồ Dns-HGA, Dns-MCPG và Dns-PhA sử dụng cột C18

Nhận xét: Các chất phân tích sau khi được dẫn xuất với dansyl clorid

sẽ tạo thành các hợp chất có độ phân cực trung bình, có thể phân tích trên cột C18 Kết quả khảo sát cũng cho thấy, pic sắc ký thu được rất nhọn, sắc nét, thời gian lưu khoảng 7 phút với các chất phân tích và nội chuẩn, do đó cột C18 đã được lựa chọn cho các khảo sát tiếp theo

Gradient rửa giải là yếu tố quan trọng ảnh hưởng tới quá trình tách Do

sử dụng cột C18 nên chương trình gradient thuận đã được lựa chọn Qua khảo sát đã đưa ra chương trình gradient để rửa giải HGA và MCPG (bảng 3.3)