Nghiên cứu tác dụng và bước đầu tìm hiểu cơ chế của cây ngũ gia bì hương (Acanthopanax gracilistylus W.W. Smith) trên mô hình ruồi giấm chuyển gen Alzheimer

Vì vậy, việc nghiên cứu phát triển các loại thuốc mới không chỉ có hiệu quả trong việc ngăn chặn và điều trị sa sút trí tuệ nói chung và điều trị bệnh AD nói riêng, mà còn có thể sử dụng

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ TUYẾT MAI

NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG VÀ BƯỚC ĐẦU TÌM HIỂU

CƠ CHẾ CỦA CÂY NGŨ GIA BÌ HƯƠNG

(ACANTHOPANAX GRACILISTYLUS W W SMITH)

TRÊN MÔ HÌNH RUỒI GIẤM CHUYỂN GEN

ALZHEIMER

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

HÀ NỘI 2019

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ TUYẾT MAI

NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG VÀ BƯỚC ĐẦU TÌM HIỂU

CƠ CHẾ CỦA CÂY NGŨ GIA BÌ HƯƠNG

(ACANTHOPANAX GRACILISTYLUS W W SMITH)

TRÊN MÔ HÌNH RUỒI GIẤM CHUYỂN GEN

ALZHEIMER

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

CHUYÊN NGÀNH HÓA SINH DƯỢC

MÃ SỐ: 8720208

Người hướng dẫn khoa học: TS Phạm Thị Nguyệt Hằng

PGS.TS Nguyễn Thị Lập

LỜI CẢM ƠN

Trước hết, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc nhất đến TS Phạm Thị Nguyệt

Hằng, trưởng khoa Dược lý – Sinh hóa, Viện Dược liệu Cô là người đã trực

tiếp hướng dẫn tôi trong quá trình nghiên cứu khoa học tại khoa, luôn bên cạnh động viên cổ vũ tôi, dìu dắt tôi thực hiện tốt luận văn này

Tiếp đến, tôi cũng xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến PGS.TS Nguyễn Thị

Lập, bộ môn Hóa sinh – trường Đại học Dược Hà Nội Cô đã cho tôi cơ hội

được nghiên cứu khoa học trong một môi trường chuyên nghiệp, luôn đưa ra những lời khuyên quý báu, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn

Tôi cũng xin được gửi lời cảm ơn chân thành đến các anh chị tại khoa Dược lý – Sinh hóa, Viện Dược liệu đã giúp đỡ, hướng dẫn tôi về kỹ thuật cũng như tạo mọi điều kiện để tôi có thể hoàn thành được nghiên cứu thực nghiệm tại khoa

Nhân dịp này, tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến Ban giám hiệu cùng toàn thể các thầy cô giáo trường Đại học Dược Hà Nội, đặc biệt là những thầy cô đáng kính trong bộ môn Hóa sinh đã dạy dỗ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong thời gian học tập tại trường

Cuối cùng, tôi xin bày tỏ sự yêu thương và biết ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè và đồng nghiệp đã luôn bên cạnh tôi, ủng hộ và động viên tôi, là chỗ dựa tinh thần vững chắc khi tôi gặp khó khăn trong học tập cũng như trong đời sống

Do thời gian làm thực nghiệm cũng như kiến thức của bản thân có hạn, khóa luận này còn có nhiều thiếu sót Tôi rất mong nhận được sự góp ý của các thầy cô, bạn bè để khóa luận được hoàn thiện hơn

Hà Nội, ngày tháng năm 2019

Học viên

Nguyễn Thị Tuyết Mai

MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 4

1 Tổng quan về bệnh Alzheimer 4

1.1 Khái niệm bệnh Alzheimer 4

1.2 Đặc điểm lâm sàng 4

1.3 Dịch tễ 6

1.4 Nguyên nhân và cơ chế bệnh sinh 6

1.5 Thuốc điều trị 12

1.5.1 Nhóm thuốc điều trị tổn thương liên quan đến nhận thức 12

1.5.2 Nhóm điều chỉnh hành vi (Tăng cường hoạt tính serotonin) 15

1.5.3 Các thuốc chống oxy hóa và các nhóm khác 15

1.5.4 Hạn chế của thuốc điều trị sa sút trí tuệ hiện nay 15

1.6 Một số mô hình nghiên cứu 16

2 Cây ngũ gia bì hương 19

2.1 Vị trí phân loại và đặc điểm thực vật, phân bố của cây Ngũ gia bì hương19 2.1.1 Vị trí phân loại 19

2.1.2.Đặc điểm thực vật và phân bố của cây Ngũ gia bì hương 19

2.2 Thành phần hóa học 21

2.3 Hoạt tính sinh học 22

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24

2.1 Nguyên liệu và đối tượng nghiên cứu 24

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 24

2.1.2 Động vật nghiên cứu 24

2.1.3 Hóa chất, dụng cụ, thiết bị 25

2.2 Phương pháp nghiên cứu 27

2.2.1 Đánh giá hiệu quả cải thiện bệnh Alzheimer của cây ngũ gia bì hương trên mô hình ruồi giấm chuyển gen Alzheimer 27

2.2.2 Bước đầu tìm hiểu cơ chế của cây ngũ gia bì hương thông qua mức độ biểu hiện trên APP 32

2.3 Phương pháp xử lý số liệu 37

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 38

3.1 Đánh giá hiệu quả cải thiện bệnh Alzheimer của cây ngũ gia bì hương trên mô hình ruồi giấm chuyển gen Alzheimer 38

3.1.1 Đánh giá khả năng vận động của ruồi giấm 38

3.1.2 Đánh giá khả năng nhớ mùi ngắn hạn của ấu trùng ruồi giấm 40

3.1.3 Đánh giá khả năng sống sót của ruồi giấm trưởng thành 42

3.2 Bước đầu tìm hiểu cơ chế của cây ngũ gia bì hương thông qua mức độ biểu hiện trên APP 43

Chương 4 BÀN LUẬN 45

4.1 Về mô hình nghiên cứu 45

4.2 Về kết quả nghiên cứu 47

4.2.1 Đánh giá hiệu quả cải thiện bệnh AD của cây ngũ gia bì hương trên mô hình ruồi giấm chuyển gen AD 47

4.2.1.1 Đánh giá khả năng vận động của ruồi giấm 47

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 52

TÀI LIỆU THAM KHẢO 53

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT STT Tên viết tắt Tên đầy đủ Tên tiếng anh

epigallocatechin gallat

Flavonoid epigallocatechin gallat

dương

Decreased intellectual frontal-temporal lobe

impairment

examination

Mini–mental state examination

3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl

yl)-2,5-diphenyl

3-(4,5-dimethylthiazol-2-tetrazolium bromide tetrazolium bromide

DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU

Bảng 2.1 Bảng nguồn gốc hóa chất 26 Bảng 2.2 Bảng dụng cụ, thiết bị 26

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Hình 1.1 Sự hình thành Amyloid beta và mảng bám ngoài tế bào 9

Hình 1.2 Sự hình thành đám rối thần kinh 10

Hình 1.3 Hình ảnh cây ngũ gia bì hương 20

Hình 2.1 Nhân dòng ruồi giấm Alzheimer 25

Hình 2.2 Hình ảnh đánh giá trí nhớ ngắn hạn của ấu trùng ruồi giấm 31

Hình 2.3 Mô hình đánh giá khả năng sống sót của ruồi giấm trưởng thành 32 Hình 2.4 Hình minh họa băng điện di 37

Hình 3.1: Tốc độ di chuyển trung bình của nhóm chứng bệnh lý và nhóm sử dụng cao toàn phần ngũ gia bì hương ở các nồng độ tương ứng2mg/ml, 4mg/ml (**p < 0,001 khi so sánhvới nhóm chứng bệnh lý) ( n=30/mẫu) 38 Hình 3.2 Tốc độ di chuyển trung bình của ruồi giấm trưởng thành nhóm chứng bệnh lý và nhóm sử dụng cao toàn phần ngũ gia bì hươngở các nồng độ tương ứng 2mg/ml, 4mg/ml sau khi nở được 3ngày và 7 ngày ( n=160/ngày) 39

Hình 3.3: Kết quả đánh giá khả năng học tập của ấu trùng ruồi giấm 41

Hình 3.4 Tỷ lệ phầm trăm sống sót của ruồi giấm trưởng thành ở nhóm chứng bệnh lý và nhóm sử dụngcao toàn phần ngũ gia bì hương ở các nồng độ 2mg/ml, 4mg/ml.( n = 224 ) 42

Hình 3.5: Băng điện di mức độ biểu hiện protein của các nhóm 43

Hình 3.6 Tỷ lệ hAPP/β-actin của các nhóm 44

ĐẶT VẤN ĐỀ

Bệnh Alzheimer (AD) là một tình trạng gây ra những thay đổi bất thường trong não ảnh hưởng đến bộ nhớ và khả năng tâm thần, là bệnh thoái hóa thần kinh, sa sút trí tuệ mạn tính và tiến triển AD là một căn bệnh, không phải là phần bình thường của sự lão hóa Mất trí nhớ là triệu chứng đầu tiên của bệnh Khi bệnh tiến triển, mất khả năng lý luận, ngôn ngữ, khả năng đưa

ra quyết định, và những kỹ năng quan trọng khác, dần dần làm cho chiều hướng cuộc sống cần phải có sự giúp đỡ của những người khác, như là thành viên trong gia đình hoặc bạn bè Thỉnh thoảng thay đổi khó khăn trong tính cách và hành vi Bệnh hiện chưa có liệu pháp chữa trị hay phòng ngừa hiệu quả

Thống kê ở châu Á cho thấy có khoảng 35 triệu người mắc bệnh AD, con số này được dự đoán sẽ tăng gấp đôi vào năm 2050, lên tới 62,8 triệu người Việt Nam có khoảng hơn 9 triệu người bị sa sút trí tuệ mà dạng bệnh điển hình là AD [3] Hội chứng sa sút trí tuệ thường có tính chất mạn tính, tiến triển dần dần và thường trở nên tồi tệ sau một vài năm Chứng sa sút trí tuệ có ý nghĩa quan trọng về mặt kinh tế và xã hội liên quan đến chi phí y tế, chi phí chăm sóc, chi phí xã hội Theo số liệu của Hội Alzheimer Hoa Kỳ hàng năm nước này chi trực tiếp điều trị hơn 200 tỷ đô la[49]

Thuốc tây điều trị bệnh AD đa phần thường gây tác dụng phụ và độc tính khi dùng lâu dài như thuốc Tacrrin (một chất ức chế cholinesterase), ở liều cao (160 mg / ngày) gây tác dụng phụ nhiễm độc gan Vì vậy, việc nghiên cứu phát triển các loại thuốc mới không chỉ có hiệu quả trong việc ngăn chặn và điều trị sa sút trí tuệ nói chung và điều trị bệnh AD nói riêng, mà còn có thể

sử dụng trong thời gian dài nhưng không gây ra các phản ứng bất lợi là rất cần thiết.Các thuốc mới đã và đang được nghiên cứu,tuy nhiên, cơ chế bệnh sinh phức tạp cũng khiến cho việc nghiên cứu các phương pháp điều trị khó khăn

nhận thức từ dược liệu là một hướng có triển vọng.Một số nghiên cứu khoa học đã được thực hiện trên các loại dược liệu Các loại dược liệu có tác dụng chống viêm và chống oxy hóa có thể được sử dụng trong điều trị AD như: nhân sâm, cam thảo, nghệ, Hay các dược liệu có tác dụng chống lão hóa và tăng cường trí nhớ: bạch quả, rau đắng biển, hồ tiêu,…

Ngũ gia bì hương (Acanthopanax gracilistylus W W Smith) (NGBH) là

loại cây thuốc quý, hiếm ở Việt được đưa vào Sách Đỏ quốc gia từ năm1996 Cây sống nhiều năm, ít phải chăm sóc, không có sâu bệnh.Cây có thể mọc hoang dã hoặc trồng ở môt số nơi của Việt Nam như Sapa và Bắc Hà (thuộc Lào Cai), Đồng Văn, Mèo Vạc, Quản Bạ - Hà Giang Vỏ rễ và vỏ thân của loài cây thuốc này đã được sử dụng từ lâu đời như một loại thuốc bổ, làm mạnh gân xương, chữa thấp khớp, thể lực yếu, kích thích thần kinh và cải thiện trí nhớ[26][4].Thời gian gần đây nghiên cứu về thành phần hóa học cũng như các tác dụng dược lý của NGBH được thực hiện ngày càng nhiều:

nghiên cứu thấy trong thành phần vỏ rễ và vỏ thân của cây A gracilistylus có

các thành phần hóa học như các saponin triterpenenoids, syringing, các triterpene acid có khung lupan, tinh dầu….[5]

Một số nghiên cứu sơ bộ cho thấy loài cây này có tác dụng tăng cường trí nhớ và cải thiện thần kinh Đã xác định cao cồn 70 % vỏ thân từ NGBH này có tác dụng: ức chế hoạt tính enzyme Acetylcholinesterase (một enzyme đóng vai trò quan trọng trong hệ thần kinh trung ương và ngoại vi, có thể làm

NGBH chống lại độc tính gây ra bởi protein amyloid β (Aβ) là do ức chế sự chết tế bào thần kinh gây bởi stress oxy hóa và sự phosphoryl hóa protein tau.[15]

Tuy nhiên, các nghiên cứu về cây ngũ gia bì hương lại chỉ tập trung vào tìm hiểu thành phần hóa học, cũng như tác dụng điều trị bệnh ung thư, mà

chưa thấy nghiên cứu sâu nàovề hiệu quả tác dụng ức chế hoạt tính enzyme Acetylcholinesterase và cơ chế bảo vệ thần kinh của NGBH chống lại độc tính gây ra bởi protein amyloid β (Aβ) Vì vậy, để có thể khẳng định thêm được hiệu quả tác dụng cải thiện bệnh AD gây ra bởi protein amyloid β của ngũ gia bì hương cần có nhiều nghiên cứu cụ thể hơn nữa, với mục đích đó

chúng tôi tham gia thực hiện đề tài ‘ Nghiên cứu tác dụng và bước đầu tìm

hiểu cơ chế của cây Ngũ gia bì hương (Acanthopanax gracilistylus W W

Smith) trên mô hình ruồi giấm chuyển gen Alzheimer” với mục tiêu:

1 Đánh giá được tác dụng cải thiện bệnh Alzheimer của cây Ngũ gia bì hương trên mô hình ruồi giấm chuyển genAlzheimer

2 Bước đầu tìm hiểu cơ chế của cây ngũ gia bì hương thông qua mức độ biểu hiện protein amyloid precusor (APP)

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.Tổng quan về bệnh Alzheimer

1.1.Khái niệm bệnh Alzheimer

Tại cuộc họp lần thứ 37 của Hiệp hội các nhà tâm thần học vùng Tây Nam nước Đức vào ngày 3 tháng 11 năm 1906 tại Turbingen, ông Alois AD

đã lần đầu tiên mô tả đặc điểm lâm sàng và giải phẫu thần kinh học của một căn bệnh sa sút trí tuệ (dementia) ở một bệnh nhân Năm 1910, Kraepelin đã lấy tên ông đặt cho tên bệnh – bệnh AD trong tái bản lần thứ 8 bài viết Tâm thần học (Psychiatrie) của mình [1]

Bệnh AD là bệnh thoái hóa thần kinh, sa sút trí tuệ mạn tính và tiến triển Là dạng phổ biến nhất của hội chứng suy giảm trí nhớ Hội chứng suy giảm trí nhớ là thuật ngữ tổng quát về việc mất trí nhớ và các khả năng tư duy nghiêm trọng đến nỗi gây trở ngại cho cuộc sống thường ngày Bệnh AD chiếm khoảng 60% đến 80% trong những bệnh làm suy giảm trí nhớ [52]

1.2.Đặc điểm lâm sàng

Bệnh AD’s trở nên trầm trọng hơn theo thời gian Các chuyên gia sử dụng thuật ngữ "giai đoạn" để mô tả mức độ biến chuyển về năng lực của người bệnh so với chức năng thông thường khi bệnh tiến triển.Điều quan trọng cần lưu ý là các giai đoạn được đưa ra chỉ là những định hướng tổng quát và các triệu chứng có thể khác biệt rất nhiều Không phải mọi người đều

có triệu chứng giống nhau hoặc tiến triển bệnh ở tốc độ như nhau

Cơ cấu 7 giai đoạn này dựa trên một hệ thống được phát triển bởi Tiến sĩ

Y khoa Barry Reisberg, giám đốc lâm sàng của New York University School

of Medicine's Silberstein Agingand Dementia Research Center.[52]

Giai đoạn 1: Không có biểu hiện suy yếu (chức năng bình thường)

Giai đoạn 2: Sự suy giảm nhận thức rất nhẹ (có thể là sự thay đổi bình thường theo tuổi tác hoặc là dấu hiệu sớm nhất của bệnh AD’s)

Giai đoạn 3: Sự suy giảm nhận thức nhẹ

- Suy giảm trí nhớ

- Giảm hiệu suất trong việc giải quyết các công việc thường ngày

Giai đoạn 4:Sự suy giảm nhận thức vừa phải(giai đoạn đầu/nhẹ của bệnh AD’s)

- Rối loạn định hướng không gian

- Có thể có các rối loạn khí sắc rõ rệt dẫn đến trạng thái bất an, bồn chồn, đứng ngồi không yên, dễ bị kích thích, hoặc ngược lại dẫn đến bàng quan, sững sờ, trầm cảm từ giai đoạn sớm của bệnh

Giai đoạn 5:Sự suy giảm nhận thức tương đối nghiêm trọng(giai đoạn giữa/vừa phải của bệnh AD's)

Các khoảng trống lớn trong trí nhớ và suy giảm chức năng nhận thức bắt đầu xuất hiện Người bệnh cần được giúp đỡ trong các hoạt động thường ngày

Giai đoạn 6:Sự suy giảm nhận thức rất nghiêm trọng (giai đoạn giữa/tương đối nghiêm trọng của bệnh AD's)

Suy giảm trí tuệ diễn ra nhanh chóng, rõ rệt Nhân cách của người bệnh cũng bắt đầu có những biến đổi:

- Thường gặp các triệu chứng biểu hiện tổn thương thùy đỉnh: rối loạn ngôn ngữ, rối loạn tri giác, rối loạn hành vi, thay đổi tính cách

- Các rối loạn ngoại tháp đặc trưng là rối loạn tư thế, dáng điệu, tăng trương lực cơ và đặc biệt là các triệu chứng giống parkinson thấy có ở gần 2/3 các bệnh nhân AD

Giai đoạn 7: Sự suy giảm nhận thức rất nghiêm trọng(giai đoạn cuối/nghiêm trọng của bệnh AD's)

Bệnh nhân có thể nằm liệt giường, rối loạn đại tiểu tiện, các triệu chứng loạn thần (hoang tưởng, ảo giác ) thường xuất hiện rõ rệt trong bệnh cảnh lâm sàng:

- Có thể xuất hiện các rối loạn thần kinh như liệt nhẹ nửa người co cứng, bệnh nhân nằm co quắp, run tay chân, có các phản xạ như nắm, mút

- Các cơn động kinh toàn thể (cơn lớn) gặp trong nhiều trường hợp

- Sút cân nhanh chóng, mặc dù vẫn duy trì ăn ngon miệng

1.3.Dịch tễ

Theo ước tính trên toàn thế giới số lượng người bị sa sút trí tuệ là 24 triệu trong năm 2005, ước tính lên đến 81 triệu trường hợp vào năm 2040 [49] Bệnh AD là nguyên nhân phổ biến nhất của chứng mất trí ở hầu hết các quốc gia, chiếm khoảng hai phần ba các trường hợp Trong nước Mỹ, ước tính

có khoảng 5,4 triệu người mắc bệnh AD Tỷ lệ mắc bệnh của bệnh AD tăng dần theo tuổi, 96% là từ 65 tuổi trở lên Chi phí cho việc chăm sóc sức khỏe, chăm sóc dài hạn, và các dịch vụ viện chăm sóc đặc biệt ở nước Mỹ được ước tính 200 tỷ USD mỗi năm [49] Việt Nam có khoảng hơn 9 triệu người bị sa sút trí tuệ mà dạng bệnh điển hình là AD [3] Yếu tố di truyền và không di truyền đều có liên quan với nguy cơ mắc bệnh AD Tăng huyết áp tâm thu và tăng cholesterol máu sẽ có nguy cơ cao bị AD hơn những người bình thường [11] Hội chứng Down: người bị chứng này sẽ bị AD khi sống đến 40 tuổi và những bà mẹ sinh con bị Down sẽ có nguy cơ cao bị AD [11]

1.4 Nguyên nhân và cơ chế bệnh sinh

Có nhiều nguyên nhân và cơ chế bệnh sinh dẫn tới suy giảm trí nhớ:

Nguyên nhân do bệnh lý thoái hóa:

Suy giảm trí nhớ gặp phổ biến trong bệnh AD AD là một bệnh lý thoái hóa thần kinh tiến triển, các rối loạn thần kinh không thể đảo ngược và được đặc trưng về mặt lâm sàng bởi mất trí nhớ và suy giảm nhận thức [49] Tuy

nhiên, nguyên nhân và cơ chế bệnh sinh của bệnh AD chưa được biết chính xác Tuổi tác và yếu tố gen di truyền là những nguy cơ quan trọng nhất.Các dấu hiệu tổn thương phổ biến trong bệnh AD là sự xuất hiện của đám rối thần kinh và cấu trúc mảng bám ở một số vùng vỏ não, teo võ não và sự thoái hóa của hệ cholinergic

Giả thuyết beta amyloid:

β - amyloid peptid (βAP) là những sản phẩm tự nhiên của quá trình

biến hơn so với các βAP nhưng lại dễ bị kết tụ và hình thành mảng bám Sự mất cân bằng giữa sản xuất, thanh thải của các peptid làm cho các βAP dư thừa tích lũy và kết tụ lại gây độc cho tế bào.Giả thuyết chỉ ra sự tích tụ β-amyloid peptid (βAP) được coi là độc tố làm ngăn cản quá trình cân bằng ion calci, ức chế chức năng của một số enzyme và khả năng sử dụng glucose của

tế bào thần kinh đồng thời kích hoạt sự chết theo chương trình (apoptosis) [2], [56], [13] Người ta vẫn chưa biết chính xác sự biến đổi trong việc sản xuất βAP đến mức độ nào thì gây ra suy giảm trí nhớ

APP là protein tiền thân amyloid, gồm 770 aa, được tìm thấy trong nhiều

mô và cơ quan, bao gồm não và tủy sống (hệ thần kinh trung ương).Hơn 50 đột biến khác nhau trong gen APP có thể gây ra bệnh AD khởi phát sớm, bắt đầu trước tuổi 65 Những đột biến này chiếm 10% của tất cả các trường hợp khởi phát sớm rối loạn Biến đổi APP phổ biến nhất là thay đổi amino acids trong protein tiền thân amyloid Đột biến này thay thế amino acid valine bằng amino acid isoleucine Các đột biến trong gen APP có thể dẫn đến tăng lượng amyloid β peptide hoặc tạo ra một dạng peptit dài hơn và dính hơn Khi những mảnh protein này được giải phóng khỏi tế bào, chúng có thể tích tụ trong não và tạo thành các khối gọi là mảng amyloid Những mảng này là đặc

hại có thể dẫn đến cái chết của tế bào thần kinh và các dấu hiệu và triệu chứng tiến triển của chứng rối loạn này.[54]

Sự hình thành mảng bám amyloid

Mảng bám amyloid là sự phân giải (amyloid precursor protein – APP) một glycoprotein xuyên màng APP bị phân cắt bởi 3 enzym : α , β và γ secretase Trước hết APP bị cắt cạnh tranh bởi α và β secretase Nhiều nghiên cứu cho thấy stress oxy hóa làm giảm hoạt tính của α-secretase , làm tăng cường biểu hiện và kích hoạt β-secretase Con đường α-secretase tạo ra sAPPα , các sAPPα hòa tan này liên quan đến sự dẫn truyền thần kinh bình thường ở synap và C83 Con đường β-secretase sinh ra sAPPβ và C99 Các sản phẩm C83 và C99 này bị cắt một lần nữa nhờ ᵧ secretase (ᵧ secretase là một phức hợp đa enzyme có chứa presenilin 1,2 Đột biến presenilin được tìm thấy ở bệnh nhân AD sớm có tính chất gia đình) Riêng với C99 dưới tác dụng của ᵧ secretase sẽ tạo thành hai phân đoạn không hòa tan Amyloid β40 (Aβ40) và Amyloid β42 (Aβ 42) Aβ42 có tính chất độc hơn và nhiều hơn Aβ40 Các monomer này trải qua một sự thay đổi đáng kể về cấu hình ở nồng

độ cao để hình thành cấu trúc bậc ba của dạng tấm beta Những mảnh này sau đó kết hợp lại thành các oligomer (là dimer hoặc trimer), chúng dường như là các chất độc thần kinh, không hòa tan xung quanh các tế bào thần kinh

và dần dần thành các mảng amyloid beta.[61]

Hình 1.1 Sự hình thành Amyloid beta và mảng bám ngoài tế bào Giả thuyết đám rối thần kinh (Neurofibrilary Tangles - NFTs)

Đám rối thần kinh - NFTs thường được tìm thấy trong các tế bào vùng hải mã và vỏ não ở người bệnh AD NFTs được hình thành từ protein tau phosphoryl hóa bất thường Protein tau có vai trò ổn định cấu trúc vi ống, giúp hệ thống vi ống thực hiện chức năng nâng đỡ tế bào, chức năng vận chuyển và vận động tế bào chất Khi sợi tau bị phosphoryl hóa bất thường tại một vị trí cụ thể, chúng không thể liên kết một cách hiệu quả với các vi ống làm chức năng của chúng bị gián đoạn dẫn tới gây chết tế bào Mật độ của các NFTs tương quan với mức độ nghiêm trọng của bệnh mất trí nhớ bởi chúng là một dấu hiệu về sự chết đi của các tế bào thần kinh [19], [10], [17]

Chết tế bào thần kinh

Màng tế bào

Aβ oligomer hóa

Hình 1.2 Sự hình thành đám rối thần kinh Giả thuyết cholinergic và những bất thường về các chất dẫn truyền thần kinh khác

Rối loạn chức năng và thoái hóa tế bào lan tỏa dẫn đến một loạt các khiếm khuyết dẫn truyền thần kinh, trong đó, các bất thường trên hệ cholinergic là nổi bật nhất Sự mất hoạt động của hệ cholinergic tương quan thuận với mức độ nghiêm trọng của bệnh suy giảm trí nhớ Vào giai đoạn muộn của bệnh, số lượng các tế bào thần kinh cholinergic và số lượng các thụ thể nicotinic trong vùng hải mã và vỏ não giảm xuống Thụ thể nicotinic trước synap có vai trò kiểm soát việc giải phóng của acetylcholin, cũng như các chất dẫn truyền thần kinh quan trọng khác cho bộ nhớ và tâm trạng, bao gồm: glutamat, serotonin và norepinephrin Giả thuyết cholinergic lý giải việc mất

tế bào cholinergic là nguyên nhân suy giảm nhận thức trong bệnh AD, do đó, việc tăng cường chức năng hệ cholinergic có thể cải thiện triệu chứng mất trí nhớ[19], [10], [17]

Giả thuyết apolipoprotein E

Những nghiên cứu trước đây đã tìm thấy nhiều mối liên hệ giữa cholesterol và sự xuất hiện của bệnh AD Apolipoprotein E là một lipoprotein

có nhiệm vụ vận chuyển cholesterol trong não ApoE4 có liên quan đến tăng tính lắng đọng của βAP và được cho là đóng vai trò như một chất điều hòa

Vi ống

Protein Tau phosphoryl hóa

Vi ống mất ổn định

Đám rối thần kinh

thúc đẩy trong quá trình bệnh sa sút trí tuệ mạch máu Cholesterol được vận chuyển bằng LDL vào tế bào thần kinh và liên kết với NFTs Mức cholesterol cao trong tế bào thần kinh não có thể làm thay đổi chức năng màng tế bào, dẫn đến hình thành các βAP và các mảng bám [19], [10], [17]

Các chất trung giangây viêm

Giả thuyết cho rằng, khi βAP tích tụ, các thực bào tiểu thần kinh đệm (microglia) được kích hoạt và tăng cường phản ứng của các tế bào hình sao với các mảng bám Các thực bào tiểu thần kinh đệm làm giảm βAP bằng cơ chế thực bào Các tế bào hình sao đưa βAP vào tế bào chất gián tiếp qua receptor và vận chuyển βAP vào tuần hoàn chung, do đó cũng làm giảm βAP Tuy nhiên, việc kích hoạt mạn tính các tiểu thần kinh đệm dẫn tới giải phóng các cytokin như interleukin-1 (IL-1), interleukin-6 (IL-6) và yếu tố hoại tử khối u (TNF-α), nitric oxid làm tổn thương các tế bào thần kinh và thúc đẩy quá trình viêm liên tục Trên thực tế, nhiều cytokin và chemokin tăng lên trong não bệnh nhân AD, và một số kiểu đa hình gen tiền viêm được báo cáo

là có liên quan với bệnh AD [19], [10], [17]

Nguyên nhân không do bệnh lý thoái hóa

Ngày càng có nhiều bằng chứng về mối quan hệ nhân - quả giữa các

bệnh lý tim mạch và những yếu tố nguy cơ tim mạch với tỷ lệ mắc bệnh sa sút trí tuệ Các yếu tố nguy cơ tim mạch cũng là những yếu tố nguy cơ sa sút trí tuệ bao gồm: tăng huyết áp, tăng lipoprotein cholesterol tỷ trọng thấp (LDL-cholesterol), giảm lipoprotein cholesterol tỷ trọng cao (HDL-cholesterol) và bệnh tiểu đường

Bệnh tiểu đường có thể làm tăng nguy cơ mất trí nhớ thông qua các yếu

tố liên quan đến “hội chứng chuyển hóa” (rối loại lipid máu và tăng huyết áp)

và thông qua bất thường insulin Rối loạn con đường tín hiệu insulin signaling pathways), cả ở ngoại vi và ở não, có sự liên quan đến bệnh sa sút

(insulin-trí tuệ Insulin cũng có vai trò trong việc điều chỉnh sự chuyển hóa của βAP

và protein tau

Các bệnh mạch máu não làm giảm cung cấp các chất dinh dưỡng cho tế bào thần kinh và giảm độ thanh thải của βAP từ não bộ, làm tăng tốc độ lắng đọng β-amyloid và tăng độc tính của β-amyloid cho tế bào thần kinh do đó làm nặng thêm sự giảm khả năng nhận thức của bệnh sa sút trí tuệ

Những giả thuyết khác được đề xuất để giải thích cơ chế bệnh sinh của suy giảm trí nhớ bao gồm sự oxy hóa, rối loạn chức năng ty thể, và những ảnh hưởng của estrogen ở phụ nữ sau mãn kinh

Cho tới nay, chưa có cơ chế bệnh sinh nào được chứng minh là cơ chế chính Nhưng tất cả các giả thuyết đều dẫn đến một hậu quả: sự thoái hóa của

tế bào thần kinh trong vùng não cao hơn, hình thành NFTs và mảng bám; sự suy giảm hoạt động nghiêm trọng hệ cholinergic và sự mất nhận thức tiến triển từ từ cho tới khi bệnh nhân tử vong [19], [10], [17]

1.5 Thuốc điều trị

1.5.1 Nhóm thuốc điều trị tổn thương liên quan đến nhận thức

Thuốc kháng enzym cholinesterase

Nhóm này được sử dụng vì có tình trạng suy giảm thụ thể acetylcholin

và nicotin trong hệ thần kinh trung ương ở các bệnh nhân sa sút trí tuệ do bệnh AD và những khiếm khuyết này gây suy giảm trí nhớ, nhận thức

Cho tới nay, thuốc kháng enzym cholinesterase được xem là nhóm thuốc chính trong điều trị AD và các bệnh sa sút trí tuệ khác, nhóm thuốc này

đã được chứng minh là có hiệu quả hơn placebo trong việc điều trị các triệu chứng của bệnh AD và các bệnh sa sút trí tuệ khác khi được sử dụng ở giai đoạn bệnh nhẹ hay nặng trung bình (10-24 điểm MMSE), tuy nhiên các thuốc này không ngăn chặn được diễn tiến tự nhiên của bệnh.Các thuốc thuộc nhóm này bào gồm: tacrin, donepezil, rivastigmin, galantamin [9], [12]

Nhóm thuốc kháng thụ thể N-methyl D aspartate (NMDA)

Nhóm này có memantin là thuốc đối kháng không cạnh tranh trên thụ thể N-methyl D aspartat (NMDA) của hệ thống glutamat với ái lực vừa phải, do

có hiện tượng tăng hoạt hóa thụ thể NMDA làm tổn thương các neuron thần kinh trong các bệnh lý thoái hóa thần kinh Việc sản xuất glutamat quá mức khiến các receptor NMDA hoạt động quá mức, gây tăng nhập calci vào tế bào, dẫn đến trạng thái kích thích do nhiễm độc (excitotoxicity) có liên quan đến suy giảm trí nhớ trong AD Do phụ thuộc vào điện thế và có động lực học nhanh nên memantin giảm ức chế receptor NMDA ở lượng glutamat sinh lý

và tăng ức chế receptor này ở lượng glutamat bệnh lý, do đó cải thiện trí nhớ

và chức năng nhận thức [2] Các bằng chứng cho thấy memantin đem lại lợi ích lâm sàng về tổng thể, chức năng nhận thức, hành vi, các hoạt động trong cuộc sống hàng ngày ở bệnh nhân AD vừa và nặng Điều trị AD vừa và nặng với memantin không cải thiện chức năng và hành vi, nhưng cải thiện ít tổng thể và tình trạng nhận thức [61], [70], [9], [23]

Chất tác dụng trên amyloid bệnh lý

Tuy dòng thác amyloid (amyloid cascade) là một trọng tâm nghiên cứu trong điều trị suy giảm trí nhớ nhưng đến nay vẫn chưa có thuốc đối kháng amyloid nào được phê duyệt, mặc dù nhiều chất đang ở pha cuối thử nghiệm lâm sàng [9]

- Giảm sản xuất Aβ:

+ Ức chế β-secretase: Amyloid được hoạt hóa bởi β-secretase hoặc

enzym β-site APP-cleaving 1 (BACE1) Nhóm thiazolidindion trong điều trị đái tháo đường typ 2 gồm rosiglitazon và pioglitazon được sử dụng chủ yếu

đề điều chỉnh chuyển hóa glucose và lipid, cũng có thể ức chế β-secretase và tiền chất amyloid (APP) thông qua kích thích peroxisom prolifrator activated

receptor γ (PPARγ) hạt nhân [19]

+ Ức chế γ-secretase: Tác động của γ-secretase lên β-secretase trong

quá trình phân cắt protein APP là bước cuối cùng trong sản xuất Aβ Semagacestat là chất ức chế γ-secretase duy nhất được nghiên cứu trong điều trị AD, có tác dụng giảm sản xuất Aβ ở hệ thần kinh trung ương phụ thuộc

liều [19]

+ Hoạt hóa α-secretase: α-secretase là enzym cạnh tranh với

β-secretase trong phân cắt APP, hoạt hóa con đường không amyloid tạo ra các sản phẩm hòa tan có tác dụng bảo vệ thần kinh, cải thiện trí nhớ và giảm sự chết tế bào (anti-apotosis) Một số chất ảnh hưởng lên hoạt động của α-secretase thông qua các chất dẫn truyền thần kinh khác (glutamat, serotonin), hormon (estrogen, testosteron) và các statin đã được nghiên cứu Tuy nhiên, hiện tại chưa có chất tác động lên α-secretase nào được thử

nghiệm pha III [19]

- Giảm kết tập Aβ:

Gần đây, các oligome tan được (soluble oligomer) của Aβ được biết tới

có mối liên hệ chặt chẽ với độc tính trên thần kinh và synap hơn so với các sợi fibrin Aβ Các chất ức chế kết tập hoặc làm mất ổn định của oligome Aβ có thể làm thay đổi triệu chứng bệnh Một số chất ức chế kết tập khác đang được

nghiên cứu lâm sàng: PBT-2, PBT-2 [19]

- Tăng thải trừ Aβ:

Loại bỏ độc tính của Aβ thông qua đáp ứng miễn dịch làm giảm bớt những tác động có hại của AD với 4 cơ chế chính: (i) liên kết kháng thể và thực bào nhờ tế bào tiểu thần kinh đệm microglia; (ii) trực tiếp hòa tan thông qua sự gián đoạn của Aβ; (iii) chiết tách hòa tan từ hệ thần kinh trung ương bởi kháng thể trong huyết tương; (iv) liên kết kháng thể để ức chế oligome gây độc tính mà không ảnh hưởng tới amyloid Bapineuzumabvà Solanezumabđang được nghiên cứu với cơ chế tạo ra kháng thể trung gian

giải phóng Aβ [19]

1.5.2 Nhóm điều chỉnh hành vi (Tăng cường hoạt tính serotonin) Nhóm này có tác dụng tăng cường tái hấp thu serotonin chọn lọc SSRIs

có tác dụng giúp bệnh nhân điều chỉnh hành vi, chống trầm cảm, tránh kích thích hoặc lú lẫn Nhóm này gồm có fluoxetin, citalopram, escitalopram, paroxetin [23], [10], [17]

1.5.3 Các thuốc chống oxy hóa và các nhóm khác

Vitamin E: Giảm tổn thương do tế bào bị oxy hóa bởi các gốc tự do Ginkgo Biloba: Thuốc có tác dụng tăng tuần hoàn, cải thiện suy giảm trí nhớ Estrogen: Ảnh hưởng đến quá trình bảo vệ và dinh dưỡng thần kinh Kháng viêm NSAID: có một nghiên cứu cho thấy nhóm này có tác dụng giảm nguy

cơ mắc bệnh AD [10], [17]

1.5.4 Hạn chế của thuốc điều trị sa sút trí tuệ hiện nay

Sự suy giảm trí nhớ là hậu quả của sự gián đoạn dẫn truyền giữa các

neuron thần kinh trong các vùng não quan trọng đối với hệ thống bộ nhớ Các phương pháp điều trị hiện tại không có hiệu quả kéo dài tuổi thọ, chữa khỏi, hoặc tạm dừng hoặc đảo ngược quá trình sinh lý bệnh Hai nhóm thuốc chính đang sử dụng là thuốc ức chế cholinesterase và thuốc tác dụng trên hệ glutamat dựa trên hai giả thuyết cơ chế bệnh sinh của bệnh AD

Nhóm thuốc ức chế cholinesterase chỉ định cho trường hợp bệnh nhẹ đến trung bình, ổn định nhận thức tạm thời, hoặc làm giảm rất nhỏ sự suy giảm nhận thức, 20-30% bệnh nhân đã điều trị giảm được 7 điểm trong thang điểm đánh giá nhận thức ADAS-Cog (tương đương giảm được 1 năm suy giảm nhận thức) [17], [57] Memantin được dùng cho bệnh nhân ở giai đoạn trung bình đến nặng, ở những người không dùng được thuốc ức chế cholinesterase [31] Một số thử nghiệm lâm sàng cho thấy hiệu quả của memantin khi đánh giá bằng thang ADAS-Cog so với giả dược ở thời điểm 12 - 24 tuần điều trị, nhưng không cho thấy lợi ích từ 24-48 tuần [57] Tuy dòng thác amyloid

(amyloid cascade) là một trọng tâm nghiên cứu trong điều trị AD nhưng đến nay vẫn chưa có thuốc đối kháng amyloid nào được phê duyệt, mặc dù nhiều chất đang ở pha cuối thử nghiệm lâm sàng [2]

Những nhóm thuốc điều trị triệu chứng không thuộc nhận thức: các thuốc chống loạn thần, thuốc chống trầm cảm, chống co giật được sử dụng khi những triệu chứng về tâm-thần kinh ở mức độ nghiêm trọng Việc điều trị phải dựa trên sự cân bằng giữa lợi ích và nguy cơ [59] Ngoài ra, thuốc hướng thần còn có tác dụng kháng cholinergic, vì vậy, chúng có thể làm bệnh trầm trọng hơn hoặc tác động đến việc sử dụng thuốc ức chế cholinesterase [13] Các thuốc điều trị suy giảm trí nhớ hiện nay cũng gây ra nhiều tác dụng không mong muốn do tác dụng kích thích cholinergic quá mức và gây ra nhiều tương tác thuốc

1.6 Một số mô hình nghiên cứu

Dựa trên cơ chế bệnh sinh, các mô hình hiện đại nghiên cứu về thuốc điều trị suy giảm trí nhớ lần lượt ra đời

Mô hình sàng lọc đầu tiên phải kể đến là nghiên cứu các chất có tác dụng

ức chế hoạt tính enzym acetylcholinesterase Đây là mô hình đơn giản, dễ làm

và ít tốn kém Về nguyên tắc có thể định lượng acetylcholin (ACh) và acetylcholinesterase (AChE) thông qua trung gian enzym cholin oxidase xúc tác các phản ứng ACh sẽ bị enzym AChE chuyển thành cholin, sau đó nó bị

10-cetyl-3,7-dihydroxyphenoxazine tạo chất có màu hồng Đo cường độ huỳnh quang ở

563 nm Cường độ huỳnh quang của 10-cetyl-3,7-dihydroxyphenoxazine tỷ lệ thuận với nồng độ ACh và AChE Từ đó có thể định lượng được nồng độ ACh và hoạt tính của AChE [44] Hoặc có thể đánh giá khả năng ức chế hoạt

tính của enzym AChE ex vivo theo nguyên tắc của Ellman và cộng sự [49]: cơ

chất acetylthiocholin iodid (ATCI) bị thủy phân bởi AChE tạo thành

thiocholin và acid acetic Thiocholin thu được cho phản ứng với thuốc thử Ellman (DTNB) tạo ra accid 5-thio-2-nitro benzoic (RS) có màu vàng, có độ hấp thụ cực đại ở bước sóng 412 nm Chuột sẽ bị giết và tách vùng vỏ não để tiến hành định lượng hoạt tính enzym AChE theo phương pháp của tác giả Ellman và cộng sự [48] Có thể đánh giá khả năng ức chế hoạt tính của AChE

in vitro với nguyên tắc tiến hành theo phương pháp của Ellman và cộng sự

nhưng sử dụng AChE có sẵn [63], [23], [12], [14]

Hệ thống tế bào, như các dòng tế bào thần kinh (NG 108-15) hoặc tế bào thần kinh vỏ não được nuôi cấy nguyên phát cũng được sử dụng để đánh giá thuốc điều trị AD, bằng cách gây độc các tế bào này bởi protein beta-amyloid hoặc glutamat, sử dụng mẫu nghiên cứu để bảo vệ tế bào thần kinh đó, định lượng lượng tế bào sống sót [8], [71], [25], [32] Thuốc điều trị AD sẽ được

sử dụng để ngăn chặn hoặc làm giảm bớt độc tính của protein beta-amyloid hoặc glutamat trên tế bào thần kinh NG 108-15 nuôi cấy, có khả năng phục hồi tổn thương hoặc làm tăng khả năng sống sót của tế bào thần kinh

Trên mô hình động vật, người ta sử dụng một số loại chuột chuyển gen mang bệnh AD như chuột Tg2576, PSAPP (hiện nay đang được sử dụng trên thế giới) Nghiên cứu trên mô hình động vật chuyển gen mang bệnh ở người

là cần thiết để hiểu rõ về cơ chế phân tử và thúc đẩy nghiên cứu tiền lâm sàng Bệnh AD đã được gây trên mô hình chuột chuyển gen thế hệ đầu tiên (Tg), trên chuột chuyển gen này có sự biểu hiện quá mức của protein có liên quan đến bệnh AD có tính chất gia đình, hoặc sử dụng mô hình chuột chuyển gen thế hệ thứ 2 là APP mang đột biến protein tiền thân amyloid (APP), hoặc đột biến cả APP và presenilin (PS) Các chủng chuột chuyển gen này thể hiện bệnh lý AD nhưng mô hình biểu hiện quá mức có thể dẫn tới các kiểu hình bổ sung không liên quan đến AD Mô hình chuột chuyển gen thế hệ thứ 2 APP chứa các trình tự gen người và đột biến gen APP nội sinh trên lâm sàng

đến biểu hiện quá mức nhưng chưa phải là biểu hiện AD trên lâm sàng của

Mô hình ruồi giấm chuyển gen: Ruồi giấm có tên khoa học là

Drosophila melanogaster, đã được giải trình tự toàn bộ hệ gen, và nó cho thấy

có hơn 70% gen tương đồng với bộ gen của người [67],[16] Với ưu thế vòng đời ngắn, dễ nuôi trong phòng thí nghiệm và có thể cung cấp số lượng nhiều trong cùng một thời điểm, do đó ruồi giấm là nguồi gen thuận lợi cho việc nghiên cứu bệnh liên quan đến yếu tố di truyền cũng như có tiềm năng trở thành mô hình kinh tế cho những nghiên cứu thử nghiệm và sàng lọc thuốc [24],[44] Hiện nay trên thế giới có ba trung tâm lưu giữ đầy đủ nguồn gen ruồi giấm là Mỹ, Ấn Độ, và Nhật Bản, là những cơ sở luôn sẵn sàng cung cấp trao đổi nguồn gen sẵn có cho các nhà nghiên cứu ở bất kỳ đâu trên thế giới Hầu hết ở các nước này đều có phòng thí nghiệm dùng mô hình ruồi giấm chuyển gen mang bệnh trong nghiên cứu, và cho đến nay đã có rất nhiều công trình nghiên cứu và sử dụng ruồi giấm làm mô hình nghiên cứu bệnh trên người trong đó có bệnh thoái hóa thần kinh, ví dụ như công bố của nhóm nghiên cứu Parsa Kazemi-Esfarjani, Seymour Benzer trong việc ức chế độc tính của polyglutamine trên mô hình ruồi giấm [45],[41] Nhóm tác giả của John M Warrick (năm 2005) thì ứng dụng mô hình tương tự cho nghiên cứu tác dụng ức chế polyglutamine củaAtaxin-3 [42] Nhóm Botella và Cs năm

2009 và 2011 đã dùng ruồi giấm làm mô hình nghiên cứu bệnh Parkinson [69],[33] Các nhà nghiên cứu Nhật bản, nhóm tác giả Hideya Mizuno (năm 2011) cũng đã dùng mô hình ruồi giấm chuyển gen alpha-synuclein làm mô hình nghiên cứu bệnh Parkinson và các yếu tố liên quan [33] Nhóm tác giả Masamitsu Yamaguchi (2017) và một số nhóm nghiên cứu khác đã dùng mô

hình ruồi giấm đột biến gen ATP binding cassette subfamily A member 13 (ABCA13) làm mô hình nghiên cứu bệnh tự kỷ [45,46]

Ở Việt Nam, chưa có một nghiên cứu nào đi sâu vào mức độ phân tử về bệnh thoái hóa thần kinh như bệnh tự kỷ, AD, Parkinson, Huntington và cũng chưa có phòng thí nghiệm nào tạo lập được các mô hình động vật chuyển gen

để nghiên cứu và sàng lọc thuốc Các nghiên cứu chủ yếu tập trung vào tỷ lệ mắc bệnh biểu hiện lâm sàng và các biến chứng của bênh

Như mô hình chuột chuyển gen mang bệnh AD thì mô hình ruồi giấm chuyển gen mang bệnh AD cũng được áp dụng để tìm hiểu cơ chế phân tử liên quan đến AD Có một phân tử tương đồng APP trong bộ gen của ruồi giấm là APPl Theo các nghiên cứu gần đây, nhiều yếu tố nguy cơ với AD được xác định và các yếu tố nguy cơ này có sự tương tác di truyền với mô hình ruồi giấm chuyển gen[29] Chakraborty và cộng sự, đã chỉ ra rằng APP của con người với BACE của con người trong hệ thần kinh ruồi giấm (APP / BACE) tạo Aß và rút ngắn tuổi thọ Họ đã chỉ ra rằng mất trí nhớ và thoái hóa thần kinh được gây ra bởi APP / BACE trong mô hình ruồi giấm chuyển gen

Từ đấy cho thấy mô hình ruồi giấm chuyển gen có các triệu chứng liên quan của AD[62] Vì vậy mô hình ruồi giấm chuyển gen AD là một trong những

mô hình thuận lợi cho việc nghiên cứu và tìm thuốc điều trị bệnh AD ở Việt Nam

2 Cây ngũ gia bì hương

2.1 Vị trí phân loại và đặc điểm thực vật, phân bố của cây Ngũ gia

bì hương

2.1.1 Vị trí phân loại

Tên khoa học làAcanthopanax gracilistylus W W Smith Tên khác: Tế

trụ ngũ gia, ngũ hoa, tiểu ngũ trảo phong, Acanthopanax spinosusMiq.Thuộc

chi Acanthopanax Họ: Nhân sâm (Araliaceae).Là một trong các loài của chi

Acanthopanax(Decne & Planch.) Miq.[65]

2.1.2.Đặc điểm thực vật và phân bố của cây Ngũ gia bì hương

Cây bụi trườn, vươn cao hay dài đến 2-7m, có phân cành, vỏ lúc non màu xanh, khi già màu nâu xám, có nhiều gai nhọn sắc.Lá kép chân vịt, cuống dài 2,5-3,5 cm, có gai gồm 3-5 lá chét, từ hình trứng thuôn có mép khía răng khô đến hình thuôn dài ở mép có gai nhọn (var setosus Li), lá chét giữa thường lớn hơn các lá chét bên; kích thước lá chét thường 4-8 x 1,5-3 cm Cụm hoa dạng chùm tán, mọc ở đầu cành; hoa màu vàng ngà hay trắng ngà,

có cuống mảnh, dài 0,7-1 cm Đài 5, nhỏ; cánh hoa 5 hình tam giác tròn ñầu Nhị 5, chỉ nhị dài hơn cánh hoa Bầu 2 ô, đầu nhụy chẻ đôi Quả hình cầu, hơi dẹt, khi chín màu tím đen 1-2 hạt nhỏ Vỏ thân, vỏ rễ và lá vò nát có mùi

thơm đặcbiệt.[26],[4],[5]

Hình 1.3 Hình ảnh cây ngũ gia bì hương

(Nguồn: Sách đỏ Việt Nam – 2007)

2.2 Thành phần hóa học

Ngũ gia bì hương (A gracilistylus) chứa các hợp chất senticosid

A,B,C,D,E,F,I,K,L,M; các eleutherosid E, I,K,L,M;các ciwujianosid B,C1,C3, C4,A1,A2,A3,A4,D3; các hederasaponin B và các triterpene khung lupan,

(2R,3R)-2,3-di-(3,4-metylendioxibenzyl)-butyrolactone (5 )và syringaresol

diglucosid trong đó syringin là một chất được phân lập từ vỏ thân và vỏ rễ,

các acid (-)ent-kaur-16-en-19-oic ( 3); axit ent-pimara-8(14), 15-dien-19-oic

(4), acid kauronic và acid ent-16a 17- dihydroxykauran-19-oic Lá chứa các

glycosyl ester của nhóm 3-α-hydroxy-olean, taraxerol (1), taraxeryl acetat (2)

Tinh dầu với các thành phần chính là caryophyllen oxid, trans-caryophyllen, humulen và humulen epoxid [36],[61]

2.3 Hoạt tính sinh học

Cây thuốc từ lâu đã được sử dụng để điều trị các triệu chứng thần kinh Mặc dù, các cơ chế tác dụng chưa được xác định rõ ràng, nhưng một số dược liệu đã chứng minh có tác dụng chống viêm, chống oxy hóa như nhân sâm, cam thảo, rau đắng biển,…Bây giờ, khi ngày càng có nhiều bằng chứng chỉ ra rằng các phản ứng viêm mạn tính trong hệ thần kinh trung ương gây tổn thương các tế bào não ở bệnh AD, thuốc dược liệucó các thành phần chống viêm đang được chứng minh là một chất bảo vệ thần kinh mạnh mẽ chống lại các bệnh lý về thần kinhnhư AD

Cây ngũ gia bì hương có hoạt tính kháng MAO khá cao ngay cả ở nồng

viêm rất tốt, có thể kháng vi khuẩn Gr (+) là B subtilis và chủng S aureus Đặc

biệt hợp chất phenylpropenyl glycosid mới, acantrifoside E (24) có hoạt tính kháng mạnh cả ba dòng tế bào ung thư người là tế bào ung thư biểu mô người

Ở một công bố năm 2013, một nhóm nghiên cứu đã tiến hành thử khả

năng kháng viêm, chống phù nề ở chuột với ba cao toàn phầnn-hexane,

dichloroform, methanol Kết quả cho thấy, cao toàn phần methanol có khả năng chống viêm đáng kể, ở nồng độ cao nhất 500mg/kg thì có thể kháng đến 77,24% [66]

Theo nghiên cứu trên chuột,cho thấy cao cồn 70 % vỏ thân từ Ngũ gia bì hương và syringin có tác dụng ức chế hoạt tính enzyme acetylcholinesterase (AchE - là một enzyme đóng vai trò quan trọng trong hệ thần kinh trung ương

và ngoại vi, có thể làm chậm lại tiến triển của bệnh AD) ; có khả năng phục hồi/ ngăn chặn tổn thương tế bào gây bởi protein Aβ1-42 và Aβ25-35 trên invitro, loại protein vai trò quan trọng trong tiến triển bệnh học AD [20]

Tuy nhiên, các nghiên cứu này cũng chỉ mới dừng lại ở việc thử tác dụng của cao chiết cồn vỏ thân từ ngũ gia bì hương Do đó, để phát triển cây ngũ gia bì hương làm thuốc điều trị suy nhược thần kinh nói riêng và bệnh AD nói chung cần có những nghiên cứu thêm về tác dụng cải thiện trí nhớ, nhận thức trên các mô hình bệnh AD và thành phần hợp chất có tác dụng bảo vệ tế bào thần kinh

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên liệu và đối tượng nghiên cứu

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Cao cồn 70% từ vỏ thân, rễ cây Ngũ gia bì hương (Acanthopanax

gracilistylus W W Smith) - do TS Đỗ Thị Hà, Khoa Hóa thực vật, Viện

Dược liệu cung cấp

Chuẩn bị mẫu nghiên cứu

Chiết cao cồn 70% từ vỏ thân, rễ cây ngũ gia bì hương: (10 kg) vỏ thân,

rễ cây ngũ gia bì hương được rửa sạch sấy khô, thái nhỏ và được chiết nóng với cồn 70% ở nhiệt độ 80 ̊C 3 lần mỗi lần 3h Lọc, lấy cao toàn phần trong Cao toàn phần của 3 lần được gộp lại, cô dưới áp suất giảm ở 50°C thu được cao toàn phần(948,28g)

Đối tượng nghiên cứu thử trên dải nồng độ từ 1 – 10mg/ml Dựa vào khả năng sống sót của ruồi trưởng thành với từng nồng độ trên dải thì nồng độ dự kiến sử dụng cho nghiên cứu là 2mg/ml và 4mg/ml

Nguồn gốc: Ngũ gia bì hương do Khoa Tài nguyên – Viện Dược liệu thu

hái và xác định tên khoa học Mẫu nghiên cứu hiện được lưu và bảo quản tại Phòng Tiêu bản – Khoa Tài nguyên – Viện Dược liệu

2.1.2 Động vật nghiên cứu

Nhân dòng ruồi giấm Alzheimer

Chủng ruồi giấm Alzheimer(mang gen đột biến APPl) và chủng ruồi giấm không mang gen đột biến APP được sử dụng làm chứng sinh lý và được cung cấp bởi GS Masamitsu Yamaguchi, Viện công nghệ Kyoto

Hai chủng ruồi giấm này được nuôi trong môi trường thức ăn bao gồm: bột ngô, bột gạo, bột nấm men, đường, agarose, chất bảo quản (acid propionic, natri benzoate) Thức ăn cho ruồi được thay 3 ngày/lần, đảm bảo cung cấp nguồn dinh dưỡng đầy đủ cho ruồi đến khi làm thí nghiệm

Ruồi giấm được nuôi trong phòng thí nghiệm ở nhiệt độ 25 ± 1 ̊C với chu kỳ 12h sáng – 12h tối (sáng từ 07h đến 19h) Các thí nghiệm đánh giá hành vi được thực hiện trong giai đoạn từ 9h đến 18h