Nghiên cứu xây dựng qui trình phát hiện và định lượng một số kháng sinh trong mỹ phẩm

Xây dựng được quy trình phân tích các kháng sinh Lincomycin hydroclorid, Clindamycin hydroclorid, Clindamycin phosphat và Tetracyclin hydroclorid trong nền mẫu kem và sữa rửa mặt trị mụn

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUI TRÌNH PHÁT HIỆN

VÀ ĐỊNH LƯỢNG MỘT SỐ KHÁNG SINH TRONG

Người hướng dẫn khoa học: TS Lê Thị Hường Hoa

GS TS Thái Nguyễn Hùng Thu

(chữ in thường thẳng, in thường và đậm cỡ 16)

HÀ NỘI 2019

(chữ in hoa thẳng, cỡ 16)

LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên tôi muốn gửi lời cảm ơn chân thành nhất đến TS Lê Thị Hường Hoa

và GS.TS Thái Nguyễn Hùng Thu - những người thầy đã hướng dẫn, chỉ bảo tận tình

và truyền đạt những kinh nghiệm quý báu cho tôi trong suốt thời gian thực hiện đề tài này

Tôi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Viện kiểm nghiệm thuốc Trung ương, Khoa kiểm nghiệm Mỹ phẩm đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành việc học và làm đề tài

Tôi xin chân thành cảm ơn trường Đại học Dược Hà Nội, Bộ môn Hóa phân tích

đã cho tôi một môi trường học tập nghiêm túc, giúp tôi bồi đắp kiến thức và hoàn thiện bản thân

Cuối cùng tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình đã luôn yêu thương, động viên để tôi có thể hoàn thành cuốn luận văn này

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 08 tháng 03 năm 2019

Học viên

Đới Hải Linh

MỤC LỤC

Lơ ̀ i cảm ơn

Danh mu ̣c các kí hiê ̣u, các từ viết tắt

Danh mu ̣c các bảng

Danh mu ̣c các hình

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 3

TỔNG QUAN 3

1.1 ĐẶC ĐIỂM MỘT SỐ KHÁNG SINH NGHIÊN CỨU 3

1.1.1 Clindamycin 3

1.1.1.1 Tên khoa học, công thức cấu tạo và một số đặc điểm 3

1.1.1.2 Dược lí và cơ chế tác dụng 4

1.1.1.3 Chỉ định 4

1.1.1.4 Độc tính và tác dụng phụ 5

1.1.1.5 Một số nghiên cứu phân tích kháng sinh Clindamycin 5

1.1.2 Lincomycin hydroclorid 6

1.1.2.1 Tên khoa học và công thức cấu tạo 6

1.1.2.2 Dược lý và cơ chế tác dụng 6

1.1.2.3 Chỉ định 7

1.1.2.4 Độc tính và tác dụng phụ 7

1.1.2.5 Một số nghiên cứu phân tích kháng sinh Lincomycin 7

1.1.3 Tetracyclin hydroclorid 8

1.1.3.1 Tên khoa học và công thức cấu tạo 8

1.1.3.2 Dược lý và cơ chế tác dụng 8

1.1.3.3 Chỉ định 9

1.1.3.4 Độc tính và tác dụng phụ 10

1.1.3.5 Một số nghiên cứu phân tích kháng sinh Tetracyclin 10

1.2 PHƯƠNG PHÁP HPLC 11

1.2.1 Nguyên tắc 11

1.2.2 Cấu tạo 11

1.2.3 Detector và bộ phận ghi tín hiệu 11

1.2.4 Các thông số đặc trưng của quá trình sắc kí 12

1.2.5 Ứng dụng 13

1.2.6 Kĩ thuật HPLC với detector DAD 15

CHƯƠNG 2 16

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 16

2.2.THIẾT BỊ VÀ HÓA CHẤT 16

2.2.1 Thiết bị và dụng cụ 16

2.2.2 Dung môi và hóa chất 17

2.3 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 17

2.4 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18

2.5 XỬ LÝ THỐNG KÊ KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM 21

CHƯƠNG 3 22

THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 22

3.1 Khảo sát điều kiện xây dựng quy trình 22

3.1.1 Khảo sát điều kiện sắc kí 22

3.1.2 Khảo sát điều kiện xử lí mẫu 25

3.2 XÂY DỰNG VÀ THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ĐỒNG THỜI LINCOMYCIN VÀ TETRACYCLIN 26

3.2.1 Điều kiện sắc kí 26

3.2.2 Điều kiện xử lí mẫu 26

3.2.3 Thẩm định phương pháp 1 27

3.3 XÂY DỰNG VÀ THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ĐỒNG THỜI CÁC DẠNG MUỐI CỦA CLINDAMYCIN 41

3.3.1 Điều kiện sắc kí 41

3.3.2 Điều kiện xử lí mẫu 41

3.3.3 Thẩm định phương pháp 2 42

3.4 ÁP DỤNG KIỂM TRA MẪU TRÊN THỊ TRƯỜNG 54

CHƯƠNG 4 59

BÀN LUẬN 59

4.1 VỀ CÁC KHÁNG SINH NGHIÊN CỨU 59

4.2 VỀ XÂY DỰNG VÀ THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH 59

4.2.1 Về phương pháp xử lí mẫu 59

4.2.2 Về xây dựng các phương pháp phân tích và thẩm định 60

4.3 VỀ KIỂM TRA CÁC MẪU MỸ PHẨM 61

KẾT LUẬN 62

KIẾN NGHỊ 62

Ta ̀i liê ̣u tham khảo

Phu ̣ lu ̣c 1: Một số sắc kí đồ điển hình phân tích đồng thời kháng sinh Lincomycin hydroclorid, Tetracyclin hydroclorid

Phu ̣ lu ̣c 2: Một số sắc kí đồ điển hình phân tích đồng thời kháng sinh Clindamycin hydroclorid, Clindamycin phosphat

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

ACN Acetonitril

AOAC Hiệp hội các nhà hóa học phân tích chính thức (Association of Official

Analytical Chemists)

Linco HCl Lincomycin hydroclorid

Clinda HCl Clindamycin hydroclorid

Clinda PO 4 Clindamycin phosphat

DMPM Dung môi pha mẫu

HPLC Sắc kí lỏng hiệu năng cao (High performance liquid chromatography)

LOD Giới hạn phát hiện (Limit of Detection)

LOQ Giới hạn định lượng (Limit of Quantification)

Mẫu M1 Kem tẩy trang chiết xuất từ Trà xanh

Mẫu M1’ Mẫu M1 thêm chuẩn

Mẫu M2 Sữa rửa mặt sạch sâu Eveline Skincare 360º

Mẫu M2’ Mẫu M2 thêm chuẩn

ppm Phần triệu (parts per million)

r Hệ số tương quan (Relative coefficient)

RSD Độ lệch chuẩn tương đối (Relative standard deviation)

Tetra HCl Tetracyclin hydroclorid

UV-VIS Tử ngoại- khả kiến (Ultraviolet-visible)

log P Hệ số phân tán octanol/nước

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Một số tính chất vật lý và hóa học của các dạng muối Clindamycin 4

Bảng 2.1 Các mẫu nền được sử dụng để xác định phương pháp phân tích 16

Bảng 2.2 Giá trị độ chính xác và độ thu hồi yêu cầu theo AOAC 20

Bảng 3.1 Độ thích hợp của hệ thống sắc kí củ a Linco HCl và Tetra HCl 27

Bảng 3.2 Chuẩn bị các dung dịch chuẩn hỗn hợp Linco HCl và Tetra HCl 32

Bảng 3.3 Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính của Linco HCl và Tetra HCl 33

Bảng 3.4 Kết quả khảo sát độ lặp lại của phương pháp đối với Linco HCl và Tetra HCl trên nền kem 35

Bảng 3.5 Kết quả khảo sát độ lặp lại của phương pháp đối với Linco HCl và Tetra HCl trên nền sữa rửa mặt 35

Bảng 3.6 Kết quả khảo sát độ chính xác trung gian của phương pháp đối với Linco HCl và Tetra HCl trên nền kem 37

Bảng 3.7 Kết quả khảo sát độ chính xác trung gian của phương pháp đối với Linco HCl và Tetra HCl trên nền sữa rửa mặt 37

Bảng 3.8 Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp đối với Linco HCl và Tetra HCl trên nền kem 39

Bảng 3.9 Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp đối với Linco HCl và Tetra HCl trên nền sữa rửa mặt 40

Bảng 3.10 LOD và LOQ của Linco HCl và Tetra HCl 41

Bảng 3.11 Độ thích hợp hệ thống sắc kí của Clinda HCl và Clinda PO 4 43

Bảng 3.12 Chuẩn bị các dung dịch chuẩn hỗn hợp Clinda HCl và Clinda PO4 46

Bảng 3.13 Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính của Clinda HCl và Clinda PO4 46

Bảng 3.14 Kết quả khảo sát độ lặp lại của phương pháp đối với Clinda HCl và Clinda PO4 trên nền kem 48

Bảng 3.15 Kết quả khảo sát độ lặp lại của phương pháp đối với Clinda HCl và Clinda PO4 trên nền sữa rửa mặt 49

Bảng 3.16 Kết quả khảo sát độ chính xác trung gian của phương pháp đối với Clinda HCl và Clinda PO4 trên nền kem 50

Bảng 3.17 Kết quả khảo sát độ chính xác trung gian của phương pháp đối với Clinda HCl và Clinda PO4 trên nền sữa rửa mặt 51

Bảng 3.18 Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp đối với Clinda HCl và Clinda PO4 trên nền kem 53 Bảng 3.19 Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp đối với Clinda HCl và Clinda PO4 trên nền sữa rửa mặt 53 Bảng 3.20 LOD và LOQ của Clinda HCl và Clinda PO4 54 Bảng 3.21 Kết quả phân tích các kháng sinh của các mẫu mỹ phẩm trên thị trường 56

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Công thức cấu tạo của Clinda HCl 3

Hình 1.2 Công thức cấu tạo của Clinda PO4 3

Hình 1.3 Công thức cấu tạo của Linco HCl 6

Hình 1.4 Công thức cấu tạo của Tetra HCl 8

Hình 1.5 Sơ đồ nguyên lý của máy HPLC 11

Hình 1.6 Cấu tạo detector mảng diod (DAD) 15

Hình 3.1 SKĐ phân tích hỗn hơ ̣p chuẩn 4 kháng sinh nghiên cứu sử dụng pha động MeOH - đệm pH 3,0 với tỉ lệ 40 : 60 (a), tỉ lệ 35 : 65 (b) và tỉ lệ 30 : 70 (c) 22

Hình 3.2 SKĐ phân tích hỗn hơ ̣p chuẩn 2 kháng sinh Linco HCl và Tetra HCl sử dụng pha động MeOH - đệm pH 3,0 với tỉ lệ 27 : 73 23

Hình 3.3 SKĐ phân tích hỗn hơ ̣p chuẩn 2 kháng sinh Clinda HCl và Clinda PO4 sử dụng pha động ACN - đệm pH 2,5 với tỉ lệ 23 : 77 23

Hình 3.4 Phổ hấp thụ UV-VIS của Linco HCl (a), Clinda HCl (b), Clinda PO4 (c) và Tetra HCl (d) 24

Hình 3.5 Sắc ký đồ mẫu hỗn hợp chuẩn với dung môi pha mẫu là Methanol 25

Hình 3.6 Sắc ký đồ mẫu hỗn hợp chuẩn với dung môi pha mẫu là hỗn hợp MeOH : đệm amoni dihydrophosphat pH 3,0 (30 : 70) 25

Hình 3.7 Sắc kí đồ đánh giá độ đặc hiệu của Linco HCl trên 2 nền mẫu nghiên cứu so với mẫu chuẩn 29

Hình 3.8 So sánh phổ UV – VIS của Linco HCl trên 2 nền mẫu nghiên cứu so với mẫu chuẩn 30

Hình 3.9 Sắc kí đồ đánh giá độ đặc hiệu của Tetra HCl trên 2 nền mẫu nghiên cứu so với mẫu chuẩn 31

Hình 3.10 So sánh phổ UV - VIS của Tetra HCl trên 2 nền mẫu nghiên cứu so với mẫu chuẩn 31

Hình 3.11 Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa diện tích píc và nồng độ của Linco HCl 33

Hình 3.12 Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa diện tích píc và nồng độ của Tetra HCl 34

Hình 3.13 Sắc kí đồ đánh giá độ đặc hiệu của Clinda HCl và Clinda PO4 trên 2 nền mẫu nghiên cứu so với mẫu chuẩn 44

Hình 3.14 So sánh phổ UV – VIS của Clinda HCl trên 2 nền mẫu nghiên cứu so với mẫu chuẩn 45 Hình 3.15 So sánh phổ UV - VIS của Clinda PO4 trên 2 nền mẫu nghiên cứu so với mẫu chuẩn 45 Hình 3.16 Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa diện tích píc và nồng độ của Clinda HCl 47 Hình 3.17 Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa diện tích píc và nồng độ của Clinda PO4 47 Hình 3.18 Khảo sát thời gian lưu của Linco HCl và Tetra HCl trong điều kiện sắc ký của phương pháp 2. 55 Hình 3.19 So sánh phổ UV – VIS của píc Clinda HCl trên mẫu “Kem mụn Elza” 57

- 1 -

ĐẶT VẤN ĐỀ

Kinh tế phát triển, chất lượng cuộc sống của người dân được nâng cao, nhu cầu chăm sóc cho bản thân càng trở nên thiết yếu, do đó mỹ phẩm trở thành sản phẩm tiêu dùng quen thuộc “Sản phẩm mỹ phẩm” theo định nghĩa của ASEAN là

“bất kỳ một chất hoặc một chế phẩm được dùng tiếp xúc với những bộ phận bên ngoài cơ thể con người (biểu bì, hệ thống lông tóc, móng tay/chân, môi và các bộ phận sinh dục ngoài) hoặc tiếp xúc với răng và niêm mạc miệng, với mục đích duy nhất hay chủ yêu là làm sạch, làm thơm, thay đổi diện mạo và/ hoặc cải thiện mùi

cơ thể và/hoặc bảo vệ hay duy trì chúng trong điều kiện tốt” [1], [5], [14], [22] Do

đó chất lượng mỹ phẩm là một vấn đề phải được quan tâm bởi vì mỹ phẩm được sử dụng tiếp xúc trực tiếp với những bộ phận bên ngoài của cơ thể, không qui định về thời gian và liều lượng sử dụng, có thể ảnh hưởng đến sức khỏe và vẻ đẹp của cơ thể

Theo hiệp định hệ thống hòa hợp ASEAN trong quản lý mỹ phẩm mà Việt Nam đã tham gia kí kết từ năm 2003, trong bản bổ sung mới nhất vào năm 2018 có qui định danh sách 1383 chất và nhóm chất không được phép có mặt trong các sản phẩm mỹ phẩm (phụ lục II, phần 1) cũng như 323 chất và nhóm chất được phép sử dụng nhưng phải tuân theo các giới hạn và điều kiện qui định (phụ lục III, phần 1)

[1], [13] Kháng sinh thuộc danh sách chất và nhóm chất không được phép có mặt trong các sản phẩm mỹ phẩm [1], [13] Tuy kháng sinh nằm trong danh mục chất bị cấm có mặt trong mỹ phẩm nhưng các sản phẩm mỹ phẩm trên thị trường vẫn có thể bị trộn trái phép vào để đạt được lợi ích điều trị các bệnh về da và thu lợi về kinh tế

Các sản phẩm mỹ phẩm trị mụn, tàn nhang, chống nhăn, làm trắng da, làm se

lỗ chân lông có hiệu quả tốt trong thời gian ngắn thường dễ bị thêm kháng sinh và các steroids vào mà nhà sản xuất lại không công bố trong thành phần mỹ phẩm, do

đó ảnh hưởng nghiêm trọng tới sức khỏe con người và dễ gây ra tình trạng kháng kháng sinh vì không có qui định về liều lượng và thời gian sử dụng [10], [18], [20],

- 2 -

[21] Kháng sinh clindamycin, lincomycin và tetracyclin là những kháng sinh hay được trộn vào các sản phẩm mỹ phẩm như kem, sữa rửa mặt…với mục đích trị mụn trứng cá [4], [21], [24]

Ở Việt nam hiện nay chưa có qui trình phân tích kháng sinh trong mỹ phẩm

mà mới chỉ có một số nghiên cứu phân tích các chất cấm thuộc nhóm chất màu, chất bảo quản, corticoid… [3], [11], [14] Nếu ở nước ngoài đã có các nghiên cứu tương tự thì khi triển khai trên thực tế ở Việt nam cũng cần phải được đánh giá lại bằng thực nghiệm về việc áp dụng trên các mẫu mỹ phẩm đang có mặt tại Việt nam cũng như điều kiện thực tế trang thiết bị của nước ta

Trên cơ sở đó, nghiên cứu này nhằm xây dựng quy trình phát hiện và định lượng một số kháng sinh trong mỹ phẩm với các mục tiêu:

1 Xây dựng được quy trình phân tích các kháng sinh Lincomycin hydroclorid, Clindamycin hydroclorid, Clindamycin phosphat và Tetracyclin hydroclorid trong nền mẫu kem và sữa rửa mặt trị mụn bằng phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao

2 Áp dụng phương pháp xây dựng được với một số mẫu mỹ phẩm trên thị trường để kiểm tra khả năng áp dụng của phương pháp và sơ bộ đánh giá sự có mặt các chất này trong mỹ phẩm

❖ Clindamycin phosphat:

Hình 1.2 Công thức cấu tạo của Clinda PO4

Tên khoa học:

2-carbonyl] amino]propyl]-4,5-dihydroxy-2-methylsulfanyloxan-3-yl] dihydrogen phosphate

[(2R,3R,4S,5R,6R)-6-[(1S,2S)-2-chloro-1-[[(2S,4R)-1-methyl-4-propylpyrrolidine 4 [(2R,3R,4S,5R,6R)-6-[(1S,2S)-2-chloro-1-[[(2S,4R)-1-methyl-4-propylpyrrolidine

Bảng 1.1 Một số tính chất vật lý và hóa học của các dạng muối Clindamycin

- Phổ tác dụng:

Nhạy cảm: Vi khuẩn Gram dương ưa khí: Streptococci, Staphylococci,

Bacillus anthracis và Corynebacterium diphteriae Vi khuẩn Gram dương kỵ khí: Eubacterium, Propionibacterium, Peptococcus và Peptostreptococcus spp., nhiều

chủng Clostridium perfringens và C tetani Một số chủng Actinomyces spp và

Nocardia asteroids [4], [6]

1.1.1.3 Chỉ định

Clindamycin được dùng điều trị các nhiễm khuẩn nặng do các vi khuẩn kỵ

khí, đặc biệt do Bacteroides fragilis Clindamycin cũng được dùng điều trị các bệnh do nhiễm vi khuẩn Gram dương như Streptococci, Staphylococci (gồm cả chủng đã kháng meticilin) và Pneumococci Tuy nhiên, do nguy cơ cao gây viêm

- 5 -

đại tràng giả mạc, clindamycin không phải là thuốc lựa chọn đầu tiên; chỉ nên cho dùng khi không có thuốc thay thế phù hợp

Clindamycin được dùng điều trị các bệnh nhiễm khuẩn do vi khuẩn nhạy cảm

trong những trường hợp sau: Tai mũi họng do S.pneumoniae kháng penicilin, viêm

phế quản phổi, răng hàm mặt, da, trứng cá, sinh dục, xương khớp, nhiễm khuẩn huyết (trừ viêm màng não) Nhiễm khuẩn trong ổ bụng như viêm phúc mạc và áp

Clindamycin có nguy cơ cao gây viêm đại tràng giả mạc do độc tố của

Clostridium difficile tăng quá mức Điều này xảy ra khi những vi khuẩn thường có

ở đường ruột bị clindamycin phá hủy (đặc biệt ở người cao tuổi và những người có chức năng thận giảm) Ở một số người bệnh viêm đại tràng giả mạc có thể phát triển rất nặng và dẫn đến tử vong

Các tác dụng phụ khác là rối loạn đường tiêu hóa, mày đay, phát ban…[4], [6]

- 6 -

1.1.1.5 Một số nghiên cứu phân tích kháng sinh Clindamycin

Xác định clindamycin trong “kem cuolingshuang” bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao, cột C18, pha động: ammonium dihydrogen phosphat pH 3,0 – methanol (1:1), nhiệt độ: 30°C, bước sóng: 214nm [19]

Xác định đồng thời 12 chất ( enoxacin, ciprofloxacin, ofloxacin, lincomycin, clindamycin, clindamycin phosphate, chloramphenicol, p-nitropheny-2-amino-1,3-propanediol, sulfamethoxazol, metronidazole, tindazol và acid salicylic) trong mỹ phẩm trị mụn bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao, detector DAD, cột C18 (4,6mm x 250mm, 5µm), pha động: acetonitril – triethylammoniumphosphat 0,025 mol/l, nhiệt độ: 40°C, bước sóng: 210nm và 277nm [16]

- 7 -

Lincomycin hydroclorid là tinh thể, nhiệt độ nóng chảy là 156-158°C Độ tan

trong nước ở 25°C: 50 mg/l, log P = 0,56 và pKa = 7,6

1.1.2.2 Dược lý và cơ chế tác dụng

- Cơ chế tác dụng

Lincomycin, cũng như các lincosamid khác gắn vào tiểu thể 50S của ribosom

vi khuẩn giống các macrolid như erythromycin và cản trở giai đoạn đầu của tổng hợp protein Tác dụng chủ yếu của lincomycin là kìm khuẩn, tuy vậy ở nồng độ cao

có thể diệt khuẩn từ từ đối với các chủng nhạy cảm [4], [6]

- Phổ tác dụng

Thuốc có tác dụng đối với nhiều vi khuẩn ưa khí Gram dương, bao gồm các

Staphylococcus, Streptococcus, Pneumococcus, Bacillus anthracis, Corynebacterium diphtheriae Tuy nhiên, không có tác dụng với Enterococcus

Phần lớn các vi khuẩn ưa khí Gram âm, như Enterobacteriaceae kháng lincomycin; khác với erythromycin, Neisseria gonorrhoeae, N meningitidis và Haemophilus

influenzae thường kháng lincomycin [4], [6]

Lincomycin có phổ tác dụng rộng đối với các vi khuẩn kỵ khí Các vi khuẩn

kỵ khí Gram dương nhạy cảm bao gồm Eubacterium, Propionibacterium,

Peptococcus, Peptostreptococcus và nhiều chủng Clostridium perfringens và Clostridium tetani Với liều cao, lincomycin có tác dụng đối với các vi khuẩn kỵ

khí Gram âm, trong đó có Bacteroides spp

Thuốc cũng có một vài tác dụng đối với sinh vật đơn bào, nên đã được dùng

thử trong điều trị bệnh viêm phổi do Pneumocystis carinii và bệnh nhiễm

Toxoplasma

1.1.2.3 Chỉ định

Nhiễm khuẩn nặng do các vi khuẩn nhạy cảm, đặc biệt Staphylococcus,

Streptococcus, Pneumococcus ở người bệnh có dị ứng với penicilin như áp xe gan;

nhiễm khuẩn xương do Staphylococcus; nhiễm khuẩn phụ khoa như nhiễm khuẩn ở

âm đạo, viêm màng trong tử cung, viêm vùng chậu; viêm màng bụng thứ phát; áp

Các tác dụng phụ khác là rối loạn đường tiêu hóa, mày đay, phát ban…[4], [6].

1.1.2.5 Một số nghiên cứu phân tích kháng sinh Lincomycin

SINXác định đồng thời 12 chất ( enoxacin, ciprofloxacin, ofloxacin, lincomycin, clindamycin phosphate, chloramphenicol, p-nitropheny-2-amino-1,3-propanediol, sulfamethoxazol, metronidazole, tindazol và acid salicylic) trong mỹ phẩm trị mụn bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao, detector DAD, cột C18 (4,6mm x 250mm, 5µm), pha động: acetonitril – triethylammoniumphosphat 0,025 mol/l, nhiệt độ: 40°C, bước sóng: 210nm và 277nm [16]

1.1.3 Tetracyclin hydroclorid

1.1.3.1 Tên khoa học và công thức cấu tạo

Hình 1.4 Công thức cấu tạo của Tetra HCl

Công thức phân tử: C22H25ClN2O8

Khối lượng mol: 480,898

Tên khoa học:

3,12-dioxo-4,4a,5,5a-tetrahydrotetracene-2-carboxamide;hydrochloride

(4S,4aS,5aS,6S,12aR)-4-(dimethylamino)-1,6,10,11,12a-pentahydroxy-6-methyl 9 (4S,4aS,5aS,6S,12aR)-4-(dimethylamino)-1,6,10,11,12a-pentahydroxy-6-methyl

Tetracyclin hydroclorid là tinh thể, nhiệt độ nóng chảy là 170-173°C Độ tan

trong nước ở 25°C: 231 mg/l, log P = -1,37 và pKa = 3,3

1.1.3.2 Dược lý và cơ chế tác dụng

- Cơ chế tác dụng

Tetracyclin là một kháng sinh phổ rộng có tác dụng kìm khuẩn do ức chế quá trình tổng hợp protein của vi khuẩn Cơ chế tác dụng của tetracyclin là do khả năng gắn vào và ức chế chức năng ribosom của vi khuẩn Khi vào trong tế bào vi khuẩn, tetracyclin gắn vào tiểu đơn vị 30S của ribosom, ngăn cản sự gắn kết aminoacyl t-RNA làm ức chế quá trình tổng hợp protein Khi vi khuẩn kháng tetracyclin, vị trí gắn tetracyclin trên ribosom bị thay đổi Do vậy, tetracyclin không gắn được vào ribosom của vi khuẩn và mất tác dụng [4], [6]

- Phổ tác dụng

Tetracyclin cơ bản có tác dụng trên nhiều vi khuẩn gây bệnh cả Gram âm và

Gram dương, cả hiếu khí và kỵ khí; thuốc cũng có tác dụng trên Chlamydia,

Mycoplasma, Rickettsia, Spirochaete Các loại nấm, nấm men, virus không nhạy

cảm với tetracyclin

Gần đây, sử dụng tetracyclin trong điều trị phụ trợ cho các trường hợp trứng

cá viêm (trứng cá bọc, trứng cá đỏ) có hiệu quả khả quan Quá trình điều trị cần được thầy thuốc theo dõi chuyển biến lâm sàng và điều chỉnh kịp thời Thời gian điều trị thường phải bắt đầu một vài tuần, sau đó điều chỉnh hoặc duy trì cho đến khi các tình trạng bệnh được cải thiện rõ ràng [4], [6]

1.1.3.3 Chỉ định

Do mức độ kháng thuốc của vi khuẩn nghiêm trọng và hiện nay có nhiều loại thuốc kháng khuẩn khác nên hạn chế việc sử dụng tetracyclin trong điều trị Tuy nhiên, thuốc vẫn còn được chỉ định trong một số nhiễm khuẩn khi xác định vi khuẩn còn nhạy cảm như: nhiễm khuẩn do Chlamydia, trứng cá bọc, trứng cá đỏ, bệnh giang mai, bệnh dịch hạch, bệnh than…

- 10 -

Phối hợp trong một số phác đồ điều trị H pylori trong bệnh loét dạ dày tá

tràng Phối hợp với thuốc chống sốt rét như quinin để điều trị sốt rét do

Plasmodium falciparum kháng thuốc

Sợi tetracyclin được dùng trong điều trị phụ trợ bệnh nha chu để giảm chảy máu và làm sâu thêm các hốc quanh chân răng khi lấy cao răng và làm sạch chân răng

Chỉ nên dùng tetracyclin khi đã chứng minh được vi khuẩn gây bệnh còn nhạy cảm [4], [6]

1.1.3.4 Độc tính và tác dụng phụ

Không dùng tetracyclin cho phụ nữ mang thai và trẻ em dưới 8 tuổi, do việc

sử dụng các thuốc nhóm tetracyclin trong quá trình phát triển của răng (nửa cuối thai kỳ và trẻ dưới 8 tuổi) có thể gây biến màu răng vĩnh viễn (vàng, xám, nâu) và thuốc có thể gắn vào và ảnh hưởng tới sự phát triển của xương

Một vài trường hợp dùng tetracyclin thấy có phản ứng nhạy cảm với ánh sáng biểu hiện bằng bỏng nắng khi tiếp xúc với ánh nắng mặt trời Những người bệnh dùng tetracyclin nếu phải tiếp xúc trực tiếp với ánh nắng mặt trời hay tia tử ngoại cần được cảnh báo về nguy cơ này và cần ngừng thuốc ngay khi có những triệu chứng đầu tiên của ban đỏ

Các tác dụng phụ khác là rối loạn đường tiêu hóa, bội nhiễm nấm ở miệng, thực quản; mày đay, ban đỏ, viêm gan, tổn thương ống thận, sai lệch công thức máu do các sản phẩm chuyển hóa của thuốc gây ra…[4], [6]

1.1.3.5 Một số nghiên cứu phân tích kháng sinh Tetracyclin

Xác định đồng thời 7 kháng sinh nhóm tetracyclin bằng sắc kí lỏng hiệu năng cao, pha đảo, cột Diamonsil C18 (250mm x 4,6mm, 5µm), pha động: methanol - acetonitril - acid oxalic 0,01 mol/l (pH 2,0) (11:22:67), bước sóng 267nm [23]

Xác định đồng thời 6 kháng sinh tetracyclin (minocycline hydroclorid, oxytetracyclin, tetracyclin hydroclorid, clotetracyclin hydroclorid, doxycyclin

- 11 -

hydroclorid, chloramphenicol) trong sản phẩm mỹ phẩm trị mụn bằng phương pháp HPLC cột C18 (4,6mm x150mm, 5µm), pha động: acetonitril - methanol - acid trifluoroacetic 10mmol/l, tốc độ: 1,0ml/phút, nhiệt độ cột: 30°C, bước sóng 268nm

vì vậy phụ thuốc và các yếu tố đó

Tùy thuộc vào cơ chế của quá trình tách sắc ký mà ta có những kỹ thuật sắc

ký khác nhau: sắc ký phân bố, sắc ký hấp phụ, sắc ký trao đổi ion, sắc ký loại cỡ, sắc ký ái lực, sắc ký các đồng phân quang học [2], [3], [7], [9]

Cột s ắc ký Detector

Hệ thu nhận xử lý dữ liệu

Hệ thống cấp

Tha ̉i

- 12 -

1.2.3 Detector và bộ phận ghi tín hiệu

Detector là bộ phận quan trọng quyết định độ nhạy của phương pháp Tuỳ thuộc bản chất lí hoá của chất phân tích mà lựa chọn detector cho phù hợp

- Detector quang phổ hấp thụ phân tử UV-VIS: áp dụng cho các chất có khả năng hấp thụ ánh sáng trong vùng tử ngoại (UV) hoặc vùng khả kiến (VIS)

- Detector huỳnh quang: sử dụng để phát hiện các chất có khả năng phát huỳnh quang

- Detector điện hóa: phù hợp với các chất có hoạt tính điện hoá: Các cation, anion, các hợp chất có tính dẫn điện…

- Detector chỉ số khúc xạ: sử dụng với hầu hết chất phân tích nhưng độ nhạy kém hơn detector hấp thụ UV

- Detector tán xạ bay hơi: thường được dùng để phân tích các chất kém bay hơi hơn so với pha động của sắc kí lỏng

Bộ phận ghi tín hiệu gồm có máy ghi, máy phân tích, máy tính

Để phân tích các kháng sinh có các phương pháp phổ biến như: phương pháp sắc kí lỏng (sắc kí lỏng hiệu năng cao ghép nối detector UV-VIS; sắc kí lỏng khối phổ LC-MS/MS; sắc kí lỏng siêu hiệu năng kết hợp đầu dò khối phổ UPLC- MS/MS

Phương pháp HPLC là một phương pháp đơn giản, với độ lặp lại tốt là một

kỹ thuật phù hợp để phân tích các kháng sinh Tuy nhiên phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao với detector UV-VIS có một nhược điểm là có thể có sự chồng lấp các píc khi phân tích kháng sinh trong nền mẫu phức tạp Những hạn chế này có thể được khắc phục khi kết hợp sắc kí lỏng với đầu dò khối phổ Tuy nhiên kỹ thuật này giá thành cao hơn đáng kể và thiết bị vẫn chưa có ở nhiều phòng thí nghiệm Dựa vào tham khảo tài liệu, kết hợp với điều kiện thực tế của phòng thí nghiệm, chúng tôi lựa chọn phương pháp HPLC kết hợp với detector DAD để phân tích kháng sinh Đây là thiết bị khá phổ biến ở các phòng phân tích, kiểm nghiệm

- 13 -

Detector DAD là công cụ hữu hiệu để giúp loại trù các trường hợp dương tính giả

do xuất hiện các pic trùng thời gian lưu với các chất cần phân tích

1.2.4 Các thông số đặc trưng của quá trình sắc kí

1.2.4.1 Thời gian lưu

Khoảng thời gian từ lúc tiêm mẫu vào cột đến khi píc đến detector được gọi

là thời gian lưu tR Đối với những chất không lưu giữ thì tốc độ di chuyển của nó bằng tốc độ di chuyển trung bình của các phân tử pha động Thời gian tM của chất không lưu gọi là thời gian chết

1.2.4.2 Đô ̣ phân giải

Độ phân giải của cột đánh giá khả năng tách hai chất trong hỗn hợp trên cột sắc ký:

trong đó: RS : độ phân giải

(tR)1, (tR)2: thời gian lưu chất 1, 2

W1, W2 : lần lượt là độ rộng pic 1, 2 ở các đáy pic

RS ≥ 1,5 thì 2 pic coi như tách được hoàn toàn

1.2.4.3 Tính đối xứng của píc sắc kí

- Hệ số bất đối: AF = ba

b: nửa chiều rộng phía sau píc

a: nửa chiều rộng phía trước píc

- Hệ số kéo đuôi: As = a+b

2a

1.2.4.4 Số đĩa lý thuyết và chiều cao đĩa lý thuyết

Cột sắc kí được coi là có N lớp mỏng, ở mỗi lớp, sự phân bố chất tan vào hai pha được coi là đạt đến trạng thái cân bằng Những lớp mỏng này được gọi là đĩa lý thuyết

- 14 -

Số đĩa lý thuyết là đại lượng biểu thị hiệu năng của cột trong một điều kiện sắc kí nhất định Cột có số đĩa lý thuyết lớn sẽ có hiệu lực cao, khi đó độ doãng píc nhỏ

Có 4 phương pháp định lượng thường được sử dụng trong sắc ký:

➢ Phương pháp chuẩn ngoại

➢ Phương pháp chuẩn nội

➢ Phuơng pháp thêm chuẩn

➢ Phương pháp chuẩn hóa diện tích Trong luận văn này phương pháp chuẩn ngoại được chọn sử dụng Đây là phương pháp định lượng cơ bản, trong đó cả 2 mẫu chuẩn và thử đều được tiến hành trong cùng điều kiện So sánh diện tích (hoặc chiều cao) pic của mẫu thử với

- 15 -

diện tích (hoặc chiều cao) của mẫu chuẩn sẽ tính được nồng độ của các chất trong mẫu thử Có thể sử dụng chuẩn hóa 1 điểm hoặc nhiều điểm

1.2.6 Kỹ thuật HPLC với detector DAD (diod array detector)

Detector mảng diod (DAD) là một loại detector hấp thụ UV – VIS, được dùng phổ biến trong sắc ký lỏng dựa trên sự hấp thụ bức xạ UV – VIS (trong khoảng 190 – 800 nm) của các chất phân tích Một chùm sáng có phổ rộng đi qua mẫu, sau đó được tách ra thành các bước sóng đơn Detector có mảng diod để nhận bức xạ đã tán sắc từ một cách tử Mỗi diod nhạy với một bước sóng nhất định,

do đó detector DAD cho phép đo nhiều bước sóng khác nhau cùng một lúc Thông thường, chỉ có một hoặc hai bước sóng được theo dõi trong quá trình chạy sắc ký Phổ DAD của các pic có thể cung cấp thông tin về độ tinh khiết của pic

Hình 1.6 Cấu tạo detector mảng diod (DAD)

Quang phổ và sắc ký đồ có thể được biểu thị trên màn hình nhờ phần mềm của hệ thống xử lý tín hiệu bằng máy tính Có thể gọi DAD là detector sóng quét bên cạnh detector đo ở bước sóng cố định hoặc thay đổi Mặt khác, hệ thống này có thể cho đồ thị 3D: độ hấp thụ, bước sóng và thời gian

Ứng dụng: Đầu dò DAD giúp lựa chọn bước sóng phù hợp cho phân tích, có khả năng vẽ phổ UV – VIS của pic chuẩn và pic thử rồi chồng hai phổ với nhau để thấy sự giống nhau về dạng phổ thông qua hệ số Match

Khi hệ số match xấp xỉ 1 chỉ ra một phổ định tính giống nhau hoàn toàn Hệ

số match trên 0,90 thì chỉ ra hai phổ tương tự Hệ số match càng gần 1 thì sự tương

tự của hai phổ càng cao Hệ số match dưới 0,90 chỉ ra hai phổ khác nhau [2],

[3],[7], [9]

- 16 -

CHƯƠNG 2

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

4 kháng sinh thuộc nhóm kháng sinh nằm trong trong danh mục các chất không được dùng trong mỹ phẩm bao gồm: Clinda HCl, Clinda PO4, Linco HCl và Tetra HCl

Quy trình phân tích được khảo sát trên 2 nền mẫu là kem và sữa rửa mặt không chứa các kháng sinh nghiên cứu như ở bảng 2.1

Bảng 2.1 Các mẫu nền được sử dụng để xác định phương pháp phân tích

1 Kem tẩy trang chiết

xuất từ Trà xanh

Nature Republic, Hàn Quốc

Không có chứa các kháng sinh nghiên cứu

2 Sữa rửa mặt sạch sâu

Eveline Skincare 360º

Eveline Cosmetics, Ba Lan

Không có chứa các kháng sinh nghiên cứu 2.2.THIẾT BỊ VÀ HÓA CHẤT

2.2.1 Thiết bị và dụngcụ

Đề tài được thực hiện từ tháng 12/2018 đến tháng 2/2019 tại Khoa Kiểm nghiệm Mỹ phẩm - Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương với các thiết bị được định kỳ hiệu chuẩn đạt yêu cầu ISO/IEC 17025

- Máy sắc kí lỏng Shimadzu LC - 2030C 3D (L21455502327) gồm module điều khiển, bơm gradient 4 kênh, bộ tiêm mẫu tự động, detector UV - UV 2600, buồng điều nhiệt, tích hợp đuổi khí

- Cân phân tích chính xác tới 0,1 mg

- Máy lắc siêu âm

- Máy đo pH

- Máy li tâm lạnh

- Dụng cụ thủy tinh: Bình định mức, pipet

- 17 -

2.2.2 Dung môi và hóa chất

- Chuẩn Clindamycin hydroclorid: Viện kiểm nghiệm thuốc TW, Lô: 0515098.03, hàm lượng: 92,90 %

- Chuẩn Clindamycin phosphat: Viện kiểm nghiệm thuốc TW, Lô: WS.0213205.03, hàm lượng: 95,29 %

- Chuẩn Lincomycin hydroclorid: Viện kiểm nghiệm thuốc TW, Lô: 0417013.03, hàm lượng: 91,17 %

- Chuẩn Tetracyclin hydroclorid: Viện kiểm nghiệm thuốc TW, Lô: 0411002.02, hàm lượng: 97,63 %

- Methanol HPLC (Merck)

- Acetonitril HPLC (Merck)

- Amoni dihydrophosphat (Merck)

- Nước tinh khiết (DĐVN IV)

2.3 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

• Xây dựng phương pháp phát hiện 4 kháng sinh: Clinda HCl, Clinda PO4, Linco HCl và Tetra HCl có mặt trái phép trong mỹ phẩm với hai quy trình:

- Quy trình phân tích, phát hiện 2 kháng sinh: Linco HCl và Tetra HCl bằng HPLC

- Quy trình phân tích, phát hiện 2 kháng sinh: Clinda HCl và Clinda PO4bằng HPLC;

• Đánh giá phương pháp đã xây dựng:

- 18 -

• Áp dụng phương pháp đã xây dựng để phát hiện 4 kháng sinh: Clinda HCl, Clinda PO4, Linco HCl và Tetra HCl trong một số chế phẩm mỹ phẩm đang lưu hành trên thị trường

2.4 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Sử dụng là 2 mẫu đại diện cho các nhóm sản phẩm: kem và sữa rửa mặt để xây dựng và thẩm định phương pháp phân tích với HPLC Tiến hành thực nghiệm

để tìm ra điều kiện sắc kí thích hợp, sau đó xử lý các kết quả thu được bằng thuật toán thống kê

❖ Xây dựng quy trình xử lý mẫu:

Chọn dung môi và phương pháp chiết sao cho chiết được hoàn toàn chất phân tích từ nền mẫu, loại bỏ tối đa ảnh hưởng của nền mẫu dựa vào 3 yếu tố chính: tính tan của chất phân tích, đặc điểm nền mẫu, phương pháp phân tích

❖ Lựa chọn điều kiện sắc kí phù hợp:

Tiến hành khảo sát chọn cột sắc kí, nhiệt độ cột, thành phần pha động, tốc độ dòng, bước sóng phân tích với detector DAD, thể tích tiêm mẫu Định tính bằng so sánh thời gian lưu, độ tinh khiết píc và chồng phổ UV-VIS, so sánh hệ số tương đồng của píc nghi ngờ thu được từ mẫu thử với píc thu được từ mẫu chuẩn Định lượng bằng cách so sánh diện tích hoặc chiều cao píc thu được từ mẫu thử với mẫu chuẩn

Cách tiến hành:Tiêm riêng biệt dung dịch thử, dung dịch chuẩn vào hệ thống

sắc kí lỏng sử dụng các điều kiện ở trên Tiến hành sắc kí khoảng 30 - 45 phút Ghi lại sắc kí đồ

- 19 -

❖ Độ đặc hiệu:

Tiến hành sắc kí các loại mẫu: mẫu nền (mẫu mỹ phẩm không có chất cần phân tích); mẫu chuẩn; mẫu tự tạo (mẫu mỹ phẩm không có chất cần phân tích đã được thêm chuẩn chất cần phân tích và được chuẩn bị theo quy trình) và mẫu thử được chuẩn bị theo quy trình

Yêu cầu: Trên sắc kí đồ của mẫu thử/mẫu tự tạo: píc của chất cần phân tích phải tách hoàn toàn khỏi các píc khác (nếu có trong nền mẫu) và có thời gian lưu tương ứng với píc của chất chuẩn thu được từ mẫu chuẩn Sắc kí đồ của mẫu trắng, dung dịch mẫu nền không xuất hiện píc ở trong khoảng thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu của chất chuẩn Píc của chất cần phân tích trong sắc kí đồ dung dịch thử phải tinh khiết Hệ số tương đồng phổ UV-VIS của píc chất cần phân tích thu được trong sắc kí đồ của dung dịch tự tạo (hoặc mẫu thử, nếu có) với píc tương ứng trong sắc kí đồ dung dịch chuẩn phải đạt từ 0,99 trở lên

❖ Khoảng nồng độ tuyến tính:

Tiến hành sắc kí các dung dịch chuẩn (5 dung dịch) Xác định phương trình hồi quy tuyến tính, hệ số tương quan giữa nồng độ chất chuẩn có trong mẫu và đáp ứng píc thu được trên các sắc kí đồ bằng phương pháp bình phương tối thiểu Yêu cầu: Hệ số tương quan (r) phải đạt r ≥ 0,995 Trường hợp r < 0,995 phải có sự giải thích phù hợp

❖ Độ chính xác:

Độ lặp lại: có thể được đánh giá trên kết quả của tối thiểu 6 lần định lượng ở 100% nồng độ thử (đối với chất cấm, dạng vết thì đánh giá ở nồng độ LOQ dự kiến)

Độ chính xác trung gian: diễn tả mức giao động của kết quả, được thực hiện như độ lặp lại ở các ngày khác nhau

Yêu cầu: như bảng 2.2

- 20 -

Bảng 2.2 Giá trị độ chính xác và độ thu hồi yêu cầu theo AOAC [12]

3 mức nồng độ Tại mỗi mức nồng độ, thực hiện ít nhất 03 mẫu độc lập Tính kết quả thu hồi theo dung dịch chuẩn hoặc phương trình hồi quy tuyến tính Tính tỷ lệ thu hồi theo công thức:

Tỉ lệ thu hồi (%) = Lượng chất phân tích tìm lại

x100 Lượng chất chuẩn thêm vào

Yêu cầu: như bảng 2.2

❖ Xác định giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ):

Có thể dựa vào tỉ lệ đáp ứng so với nhiễu Việc xác định tỉ lệ đáp ứng trên nhiễu được tiến hành bằng cách so sánh đáp ứng đo được trên mẫu thử có nồng độ chất phân tích đã biết với đáp ứng của mẫu trắng và từ đó tính được nồng độ tối thiểu của chất phân tích có thể phát hiện (LOD) hoặc định lượng (LOQ) được

Giới hạn phát hiện: Tỉ lệ đáp ứng trên nhiễu nằm giữa 3 hoặc 2:1 có thể được chấp nhận để thiết lập giới hạn phát hiện

- 21 -

Giới hạn định lượng: Tỉ lệ đáp ứng trên nhiễu thông thường là 10:1

2.5 XỬ LÝ THỐNG KÊ KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM

Các kết quả thực nghiệm được tính toán và xử lý thống kê trên Microsoft Excel với các hàm thống kê thông dụng như:

- Hàm tính trung bình cộng AVERAGE

- Hàm tính độ lệch chuẩn STDEV

- 22 -

CHƯƠNG 3

THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ

3.1 KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN XÂY DỰNG QUI TRÌNH

3.1.1 Khảo sát điều kiện sắc kí

Qua tham khảo tài liệu được biết các kháng sinh có thể được phân tích bằng phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao, pha đảo, cột C18, pha động methanol – đệm amoni dihydrophosphat Chúng tôi tiến hành khảo sát để lựa chọn pha động, bước sóng tối ưu cho quá trình phân tích

3.1.1.1 Khảo sát lựa chọn pha động

Hình 3.1 SKĐ phân tích hỗn hợp chuẩn 4 kháng sinh nghiên cứu sử dụng pha

động MeOH - đệm pH 3,0 với tỉ lệ 40 : 60 (a), tỉ lệ 35 : 65 (b) và tỉ lệ 30 : 70 (c)

2 qui trình sắc kí riêng

Qui trình sắc kí 1: sử dụng dung môi MeOH – đệm amoni dihydrophosphat pH

3,0 tỉ lệ 27 : 73 để phân tích 2 kháng sinh Linco HCl và Tetra HCl (xem Hình 3.2)

Qui trình sắc kí 2: sử dụng dung môi ACN – đệm amoni dihydrophosphat pH

2,5 tỉ lệ 23 : 77 để phân tích 2 kháng sinh Clinda HCl và Clinda PO4 (xem Hình 3.3)

Hình 3.2 SKĐ phân tích hỗn hợp chuẩn 2 kháng sinh Linco HCl và Tetra HCl sử

dụng pha động MeOH - đệm pH 3,0 với tỉ lệ 27 : 73

Hình 3.3 SKĐ phân tích hỗn hợp chuẩn 2 kháng sinh Clinda HCl và Clinda PO 4

sử dụng pha động ACN - đệm pH 2,5 với tỉ lệ 23 : 77

- 24 -

3.1.1.2 Khảo sát lựa chọn bước sóng

Tiến hành quét phổ UV-VIS của 4 chất Linco HCl, Clinda HCl, Clinda PO4

và Tetra HCl Kết quả thu được như Hình 3.4

Dựa vào phổ UV – VIS của 4 chất thấy rằng 3 chất Linco HCl, Clinda HCl

và Clinda PO4 có 1 cực đại hấp thụ khoảng 200 nm Tetra HCl có 3 cực đại hấp thụ

là 196nm, 273nm và 357nm Do đó bước sóng phát hiện được lựa chọn cho Linco

- 25 -

HCl, Clinda HCl và Clinda PO4 là 210nm còn bước sóng phát hiện được lựa chọn cho Tetra HCl và 357nm

3.1.2 Khảo sát điều kiện xử lí mẫu

Sử dụng dung môi pha mẫu là MeOH và hỗn hợp MeOH - Đệm amoni dihydrophosphat pH 3,0 (30 : 70), tiến hành hành sắc ký hỗn hợp chuẩn Kết quả thu được như ở Hình 3.5 và Hình 3.6

Hình 3.5 Sắc ký đồ mẫu hỗn hợp chuẩn với dung môi pha mẫu là Methanol

Hình 3.6 Sắc ký đồ mẫu hỗn hợp chuẩn với dung môi pha mẫu là hỗn hợp MeOH -

đệm amoni dihydrophosphat pH 3,0 (30 : 70)

Kết quả cho thấy:

- Với dung môi pha mẫu là Methanol (Hình 3.5), mẫu hỗn hợp 4 chuẩn thì chỉ xuất hiện có 3 pic do 2 pic Clinda HCl và Clinda PO4 trùng nhau, không tách ra được

- Với dung môi pha mẫu là hỗn hợp MeOH – đệm amoni dihydrophosphat

pH 3,0 (Hình 3.6) thì 4 pic đều tách nhau rõ ràng, pic đẹp, cân đối

Do đó hỗn hợp MeOH – đệm amoni dihydrophosphat pH 3,0 (30 : 70) được lựa chọn làm dung môi pha mẫu

- Cột sắc ký lỏng nhồi pha tĩnh C18 (4,6 x 250 mm), 5µm

- Pha động: MeOH – dung dịch amoni dihydrophosphat pH 3,0 (27:73)

- Dung môi pha mẫu: MeOH – dung dịch amoni dihydrophosphat pH 3,0 (30:70)

- Tốc độ dòng: 1ml/phút

- Bước sóng phân tích: Lincomycin HCl là 210 nm và Tetracyclin HCl là 357nm

- Thể tích tiêm: 20 µl

- Nhiệt độ cột: 30°C

3.2.2 Điều kiện xử lí mẫu

- Dung dịch chuẩn gốc Lincomycin HCl: Cân chính xác khoảng 30 mg chuẩn

Lincomycin HCl vào bình định mức 100 ml, thêm khoảng 50 ml methanol, lắc kỹ

để hòa tan, thêm methanol vừa đủ tới vạch, lắc đều

- Dung dịch chuẩn gốc Tetracyclin HCl: Cân chính xác khoảng 30 mg chuẩn

Tetracyclin HCl vào bình định mức 100 ml, thêm khoảng 50 ml methanol, lắc kỹ

để hòa tan, thêm methanol vừa đủ tới vạch, lắc đều

- Dung dịch chuẩn hỗn hợp trung gian: Hút chính xác 2,0 ml dung dịch chuẩn gốc

Lincomycin HCl và hút chính xác 1,0 ml dung dịch chuẩn gốc Tetracyclin HCl vừa pha vào bình định mức 200 ml, thêm methanol vừa đủ tới vạch, lắc đều

- Dung dịch chuẩn hỗn hợp: Hút 10,0 ml dung dịch chuẩn hỗn hợp trung gian vừa

pha vào bình định mức 50 ml, thêm DMPM vừa đủ tới vạch, lắc đều Lọc qua màng lọc 0,45 µm

- Dung dịch thử: Cân chính xác khoảng 0,5 g chế phẩm vào bình định mức 50 ml,

thêm khoảng 30 ml DMPM, lắc siêu âm 30 phút để hòa tan, để về nhiệt độ phòng,

- 27 -

thêm DMPM vừa đủ tới vạch, lắc đều Ly tâm lạnh với tốc độ 9000 vòng/phút trong 10 phút, nhiệt độ 5ºC Để về nhiệt độ phòng, lấy dịch trong lọc qua màng lọc 0,45µm

- Mẫu thử thêm chuẩn: Cân chính xác khoảng 0,5 g mẫu cho vào bình định mức 50

ml, thêm chính xác 10,0 ml dung dịch chuẩn hỗn hợp trung gian, thêm khoảng 30

ml DMPM, lắc siêu âm 30 phút để hòa tan, để về nhiệt độ phòng, thêm DMPM vừa

đủ tới vạch, lắc đều Ly tâm lạnh với tốc độ 9000 vòng/phút trong 10 phút, nhiệt độ 5ºC Để về nhiệt độ phòng, lấy dịch trong lọc qua màng lọc 0,45µm

3.2.3 Thẩm định phương pháp 1

Phương pháp phân tích dự kiến được thẩm định ở giới hạn định lượng của các chất do kháng sinh là chất cấm có mặt trong mỹ phẩm Nếu có mặt trong mỹ phẩm thì chúng chỉ ở nồng độ rất thấp do các nhà sản xuất có thể trộn trái phép nhằm thu được lợi ích về hiệu quả sử dụng và kinh tế mà không công bố thành phần trên nhãn sản phẩm

- 28 -

Tiến hành tiêm lặp lại 6 lần dung dịch chuẩn hỗn hợp trong DMPM có nồng độ Linco HCl khoảng 0,6 µg/ml, Tetra HCl khoảng 0,3 µg/ml vào hệ thống sắc ký, kết quả thể hiện ở Bảng 3.1

Kết quả cho thấy hệ thống sắc ký có độ phân tách tốt, pic cân đối, độ lặp lại tốt với RSD của diện tích pic Linco HCl và Tetra HCl lần lượt là 1,59% và 1,30% đều nhỏ hơn 2%, đáp ứng yêu cầu xác định các chất Linco HCl và Tetra HCl

3.2.3.2 Đánh giá độ đặc hiệu

Chuẩn bị các dung dịch tương ứng được mô tả ở mục 3.2.2 gồm:

- Dung dịch chuẩn hỗn hợp trung gian

- Mẫu hỗn hợp chuẩn

- Mẫu trắng: DMPM

- Mẫu thử M1 và M2

- Mẫu thử thêm chuẩn M1’ và M2’

Tiến hành lấy sắc ký theo điều kiện đã chọn và lấy sắc ký đồ ở 210 nm và

357 nm

❖Các sắc ký đồ thu được tại bước sóng 210 nm

Các sắc ký đồ thu được tại bước sóng 210 nm như ở Hình 3.7 cho thấy:

- Đối với mẫu hỗn hợp chuẩn (Hình 3.7.b): Trên sắc ký đồ xuất hiện các pic tách biệt rõ ràng, trong đó Linco HCl với thời gian lưu khoảng 6,9 phút, Tetra HCl ở 12,3 phút

- Với mẫu trắng (Hình 3.7.a): Trên sắc ký đồ không xuất hiện pic nào tương ứng với thời gian lưu của píc Linco HCl và Tetra HCl

- Với mẫu M1 và M2 (Hình 3.7.c và 3.7.d): Trên sắc ký đồ không xuất hiện pic nào tương ứng với thời gian lưu của Linco HCl và Tetra HCl

- Mẫu thử thêm chuẩn Linco HCl M1’, M2’ (Hình 3.7.e và 3.7.f): Trên sắc ký đồ xuất hiện 1 pic tách biệt rõ ràng có thời gian lưu tương ứng của Linco HCl với thời gian lưu khoảng 6,8 phút, píc này cũng tách biệt với píc có trong nền mẫu và pic Tetra HCl với thời gian lưu 12,3 phút Khi so sánh phổ UV- VIS cho độ tương