Bài viết có nội dung giới thiệu về: Rễ nhàu (radix morindae citrifoliae) là một cây thuốc cổ truyền được dùng cho bệnh nhân ung thư đau lưng, cao huyết áp, đau lưng và antrquinon trong rễ cây này chủ yếu là damnacanthal và nor-damnacanthal.
Trang 1ĐIỀU CHẾ CHẤT ĐỐI CHIẾU DAMNACANTHAL VÀ
NOR-DAMNACANTHAL
TỪ RỄ NHÀU (RADIX MORINDAE CITRIFOLIAE) PHỤC VỤ CÔNG TÁC
NGHIÊN CỨU VÀ KIỂM NGHIỆM
Dương Hồng Tố Quyên*, Nguyễn Minh Đức**
TÓM TẮT
Đặt vấn đề - Mục đích nghiên cứu: Rễ Nhàu (Radix Morindae citrifoliae) là một cây thuốc cổ truyền được
dùng cho bệnh nhân ung thư đau lưng, cao huyết áp, đau lưng Antrquinon trong rễ cây này chủ yếu là damnacanthal và nor-damnacanthal
Đối tượng – Phương pháp nghiên cứu: Dùng sắc ký cột chân không và sắc ký cột cổ điển, chúng tôi phân
lập chất nor - damnacanthal và damnacanthal từ cao chiết rễ Nhàu Dùng HPLC xác định độ tinh khiết và phổ cộng hưởng từ hạt nhân để xác định cấu trúc hóa học của chất phân lập
Kết quả: Thu được nor - damnancanthal tinh khiết 99,59% (HPLC) và damnacanthal 99,79% (HPLC)
dùng làm chất chuẩn đối chiếu
Kết luận: Kết quả của đề tài là cơ sở để điều chế chất đối chiếu nor-damnacanthal và damnacanthal với qui
mô lớn, phục vụ cho công tác nghiên cứu và kiểm nghiệm
Từ khóa: Điều chế, sắc ký lỏng hiệu năng cao, damnacanthal, nor-damnacanthal
ABTRACT
PREPARATION OF DAMNACANTHAL AND NOR – DAMNACANTHAL REFERENCE STANDARD
FROM ROOTS OF MORINDA CITRIFOLIA L., (RUBIACEAE)
Duong Hong To Quyen, Nguyen Minh Duc * Y Hoc TP Ho Chi Minh
* Vol 16 - Supplement of No 1 – 2012 : 230 – 234
Background - Objectives: Radix Morindae citrifoliae is a medicinal plant traditionally used to treat
cancer, hypertension., and back pain The most medicinally valuable antraquinones in the roots this plant is
damnacanthal and nor-damnacanthal
Methods: In this study, we prepatated damnacanthal and nor – damnacanthal from the root of Morinda
citrifolia By the regular methods as vacuum liquid chromatography (VLC) and colum chromatography (CC), we
obtained damnacanthal and nor-damnacanthal of high purity which can be used as references standar Chemical
structure and purity of damnacanthal and nor- damnacanthal were determined by conventional methods (analytical HPLC and NMR)
Results: Nor – damnacanthal 99 59% (HPLC) and damnacanthal 99 79% (HPLC) , which can be used as
reference standards, were obtained
Conclusion: Damnacanthal and nor–damnacanthal can be produced from the roots of Morinda citrifolia by
VLC and CC
Key words: Preparation, analytical HPLC, damnacanthal, nor-damnacanthal
Bệnh viện Y học cổ truyền Tp HCM
** Khoa Y học cổ truyền - Đại học Y Dược Tp HCM
Tác giả liên lạc: DS.
Trang 2ĐẶT VẤN ĐỀ
Cây Nhàu Núi (Morinda citrifolia L.,
Rubiaceae) được trồng và mọc hoang rất nhiều ở
nước ta(3) Rễ Nhàu được dùng chữa cao huyết
áp, nhức mỏi, đau lưng và lợi tiểu nhẹ (3) Thành
phần hóa học của rễ Nhàu được xác định chủ
yếu chứa nhóm antraquinon: Damnacanthal,
nor-damnacanthal, alizarin, alizarin-1-methyl
ether, rubiadin -1-methyl ether, morindon(2,6)
Một số nghiên cứu gần đây cho thấy
damnacanthal và nor-damnacanthal chiết xuất
từ than và rễ nhàu có tác dụng kháng khối u in
vitro trên mô hình thử nghiệm dòng tế bào
L-1210 và tế bào B-16 (2) Ngoài ra, damnacanthal
có tác dụng ức chế nhiều loại tế bào tiền ung thư
(7) Các chế phẩm từ Nhàu được sử dụng ngày
càng nhiều trên thị trường Các phương pháp
dùng kiểm nghiệm cho chế phẩm như quang
phổ, sắc ký lớp mỏng, đặc biệt là sắc ký lỏng
hiệu năng cao đã trở thành phương pháp kiểm
nghiệm tin cậy, hiệu quả Tuy nhiên, để áp dụng
các phương pháp này cần phải có chất đối
chiếu Nhưng nước ta thiếu chất chuẩn cần thiết,
đa số các chất chất chuẩn phải mua từ nước
ngoài đắt tiền, nhiều khi không có sẵn như 5 mg
chất chuẩn damnacanthal giá 1.200 USD Do đó,
đề tài được thực hiện nhằm mục đích điều chế
damnacanthal và nor- damnacanthal từ rễ Nhàu
làm chất đối chiếu phục vụ cho kiểm nghiệm và
tiêu chuẩn hóa chất lượng sản phẩm và nguyên
liệu từ Nhàu
NGUYÊN LIỆU - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN
CỨU
Nguyên liệu
Rễ nhàu (Radix Morindae citrifoliae) do công
ty TNHH ADC cung cấp Rễ nhàu đem rửa
sạch, thái phiến phơi khô rồi tán thành bột thô
Hóa chất và trang thiết bị
Hóa chất - Dung môi
Methanol, ethanol, aceton, cloroform, toluen
, ethyl acetate (Trung Quốc), methanot, nước cất
(Merck, Đức) Chất đối chiếu damnacanthal và
nor-damnacanthal 99,9% do Ban nghiên cứu khoa, khoa Dược trường Đại Học Y Dược Tp HCM cung cấp
Trang thiết bị
Cân phân tích Sartorius độ nhạy 0,1 mg (Nhật bản), bếp cách thủy Menmmert WB.14 (Đức), máy cô quay Buchi R300 (Thụy sĩ), máy siêu âm Sanorex RK510 H (Pháp), cột sắc ký bằng thủy tinh (Việt nam), máy sắc ký lỏng hiệu năng cao Waters 2695 (Mỹ), máy đo phổ hông ngoại FTIR -820 PC, máy đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân Bruker AV 500 (500MHz), máy soi UV
2 bước song 254 nm và 365 nm Vilber Lourinat (Pháp), Bảng mỏng TCL Silica gel 60 F254 và Silica gel cỡ hạt 0,040-0,063 mm, (Merck, Đức)
Phương pháp nghiên cứu
Chiết xuất
Chiết bột thô rễ nhàu bằng cách đun hồi lưu với ethanol 960 Dịch chiết được loại dung môi dưới áp suất giảm Cao lỏng thu được hòa với nước tỷ lệ 1:1 và được chiết phân bố lỏng - lỏng với ethyl acetat (EtOAc thu dịch chiết, tiến hành loại dung môi thu được cao ethyl acetat
Phân lập và tinh chế
Sắc ký cột chân không
Cột được dùng trong sắc ký cột chân không (VLC) là cột thuỷ tinh kích thước 5 × 30 cm, khối lượng mẫu 10 g cao ethyl acetat, pha động là hệ toluen – ethyl acetat với tỷ lệ ethyl acetat tăng từ
2 – 10 %, khai triển với tốc độ 20 ml/ 5 phút, thể tích mỗi phân đoạn 50 ml, pha tĩnh là silica gel
cỡ hạt 40 – 63 µm (250g), thể tích hứng ban đầu
là 150 ml sau đó giảm dần Các phân đoạn hứng được kiểm tra bằng sắc ký lớp mỏng với hệ dung môi benzen - cloroform (1:1) và phát hiện bằng UV bước sóng 365nm và 254nm
Sắc ký cột cổ điển (CC)
Cột được dùng là cột thủy tinh (4,5 × 50 cm), pha tĩnh là silica gel cỡ hạt 40-63 µm (100 g), nạp mẫu ướt bằng cách hòa tan mẫu trong 7 ml toluen, mẫu nạp là phân đoạn 3 của VLC (4 g) Pha động ban đầu triển khai với 250 ml EtOAc;
Trang 3sau đó triển khai bằng hệ dung môi là toluen
Thể tích hứng một lần 30 ml, tốc độ 2 ml/phút
Kiểm tra các phân đoạn bằng sắc ký lớp mỏng
với hệ dung môi benzen-cloroform (1:1), phát
hiện soi UV 254 nm và thuốc thử KOH 10%
trong methanol.Gom các phân đoạn giống nhau
rồi cô thu hồi dung môi dưới áp suất giảm.Tiếp
tục tiến hành sắc ký cột cổ điển tương tự với các
phân đoạn (4 + 5) của VLC (5,3 g) Pha động ban
đầu triển khai pha động là hệ toluen – ethyl
acetat với tỷ lệ ethyl acetat tăng từ 0 -10%
Kiểm tra độ tinh khiết: Định lượng bằng sắc ký
lỏng hiệu năng cao (HPLC)(1)
Xác định cấu trúc: Dùng phổ cộng hưởng từ hạt
nhân (NMR)(4)
KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
Bảng 1: Kết quả các phân đoạn VCL từ cao EtOAc
của rễ nhàu
Phân
đoạn
Toluen:ethy
l acetat
Khối lượng (g) Thành phần Ghi chú
1 98 : 2 0,32 C1 + C2
2 97 : 3 0,38 C1 + C2 +
C3 Chủ yếu C3
3 95 : 5 1,4 C3 + C4 +
tạp Chủ yếu C3
4 94 : 6 0,7 C3 + C4 +
tạp Chủ yếu C4
5 90 : 10 1,1 C3 + C4 +
C5 Chủ yếu C4 Kiểm tra các phân đoạn bằng sắc ký lớp
mỏng Từ phân đoạn 2, thu được chất N1 màu
vàng nghệ, kết tinh lại trong toluen nóng thu
được khối lượng 250 mg, phân đoạn 3 có khối
lượng 1,4 g, phân đoạn (4 + 5) khối lượng 1, 8
g Tiến hành tương tự như trên, dùng 2 cột
VLC phân tách 20 g cao EtOAc của rễ nhàu
Kết quả thu được chất N1 có khối lượng 400
mg, phân đoạn 3 có khối lượng 2,6 g, (4 + 5)
khối lượng 3, 5 g
Kết quả các phân đoạn từ sắc ký cột cổ điển
Dùng sắc ký cột cổ điển tiếp tục phân lập
đơn chất từ các phân đoạn 3 và (4+5)
Bảng 2: Kết quả các phân đoạn sắc ký cột từ phân
đoạn 3
Phân đoạn
Toluen (ml)
Khối lượng (g) Thành phần Ghi chú
3.2 300 0,87 C3 + ít tạp Chủ yếu C3 3.3 300 1,7 C3 + C4 + tạp Chủ yếu C3 3.4 200 0,4 C4 + tạp Chủ yếu C4 Kiểm tra các phân đoạn bằng sắc ký lớp mỏng Gom các phân đoạn giống nhau rồi cô thu hồi dung môi dưới áp suất giảm Phân đoạn 3.1 kết tinh lại trong toluen nóng thu được tinh thể hình kim ngắn màu vàng nghệ (N1) có khối lượng 1, 2 g Phân đoạn 3.4 kết tinh lại trong toluen nóng thu được 0, 25 g tinh thể hình kim dài màu vàng tạm gọi chất N2.Tiến hành tương tự với 3, 5 g chất từ phân đoạn (4+5) thu được 5 phân đoạn kết quả sau:Phân đoạn 4.1 và 4.4 đem cô thu hồi dung môi rồi kết tinh lại trong toluen nóng Phân đoạn 4.1 thu được 0,4 g tinh thể chất N1 Phân đoạn 4.4 thu được 1,2 g tinh thể chất N2
Kiểm tra độ tinh khiết chất N1 bằng HPLC
Điều kiện sắc ký: cột Prontosil C8 (100 x 4,6
m kích thước hạt 3 m, pha động MeOH-H2O (80:20), nhiệt độ cột 250C, tốc độ dòng 0,80 ml/ phút, phát hiện UV 248 nm Cân chính xác 1mg chất N1 hòa tan hoàn toàn vào 1 ml pha động,
lọc qua màng lọc 0,45 m, thể tích bơm 10 µl
Hình 1: Sắc ký đồ HPLC chất N1 Bảng 3: Kết quả định lượng chất N1 bằng HPLC
Lần thử nghiệm
Diện tích đỉnh
Hàm lượng (%)
Các thông số thống
kê Trung bình 99,59%
SD = 0.033
2 4166903 99.58
Trang 43 4163909 99.60 RSD = 0,02%
4 4167311 99.59
5 4167706 99.55
6 4167311 99.59
Chất N1 có độ tinh khiết 99,59% dựa vào độ
tinh khiết sắc ký
Kiểm tra cấu trúc chất N1 bằng NMR
Phổ 1H-NMR (500MHz, CDCl3), 13C-NMR
(125 MHz, CDCl3 và DEPT (125 MHz, CDCl3)
cho cho các tín hiệu đặc trưng: 15 tín hiệu
carbon trong đó có 5 carbon bậc 4, tất cả đều
cộng hưởng ở vùng trường thấp, có 2 carbon
carbonuyl đặc trưng nhóm quinon(C 186,7,
181,3 ppm), 2 nhóm thế trên nhân thơm (C 169,1,
168,1 ppm) Trong 5 nhóm carbon bậc 3, có 4
carbon có dịch chuyển carbon và proton trùng
nhau thành 2 nhóm (C 134,7, H 7,84 ppm, 2H,m
và C 127,7, H 8,30 ppm, 2H, m) đặc trưng của
cấu trúc vòng thơm đối xứng
Bảng 4: Dữ liệu phổ 13 C-NMR của chất N1 (125
MHz, CDCl 3 so với 13 C-NMR của nor-damnacanthal
chuẩn theo tài liệu (5)
Vị trí C chuẩn C của N1 H chuẩn H củaN1
=C(1)-O- 168,1 168,1
>C(2)= 112,1 112,1
=C(3)-O- 169,1 169,1
=C(4)H- 109,4 109,4 7,33(s) 7,26(s)
=C(5)H- 127,8 127,7 8,30(m) 8.30(m)
=C(6)H- 127,0 127,0 8,30(m) 8.30(m)
=C(7)H- 134,8 134,7 7,84(m) 7,82(m)
=C(8)H- 134,7 134,7 7,84(m) 7,82(m)
>C(9)=O 186,7 186,8
>C(10)=O 181,3 181,3
>C(11)= 133,3 133,3
>C(12)= 133,2 133,2
>C(13)= 109,0 109,1
>C(14)= 139,5 139,4
-C(15)HO 193,9 193,8 12,67(s) 12,65(s)
Cấu trúc chất N1 là nor – damnacanthal
(C15H8O5
Kiểm tra độ tinh khiết chất N2 bằng HPLC
Điều kiện sắc ký tương tự như của chất N1 nhưng dùng cột Supelcosil LC 18 (250 x 4,6 mm), kích thước hạt 5 m, pha động là
MeOH-H2O (60:40)
Hình 2: Sắc ký đồ HPLC chất N2 Bảng 5 : Kết quả định lượng chất N2 bằng HPLC
Lần thử nghiệm
Diện tích đỉnh
Hàm lượng (%)
Các thông số thống kê
1 3762954 99,74
Trung bình 99,79%
SD = 0,083 RSD = 0,07%
2 3771021 99,95
3 3767205 99,85
4 3762954 99,74
5 3762879 99,69
6 3762938 99,74 Chất N2 tinh khiết 99,79% dựa vào độ tinh khiết sắc ký
Kiểm tra cấu trúc chất N2 bằng NMR
Phổ 1H-NMR (500MHz, CDCl3), 13C-NMR (125 MHz, CDCl3 và DEPT (125 MHz, CDCl3) cho cho các tín hiệu đặc trưng giống với phổ NMR của chất damnacanthal chuẩn
Bảng 6: Dữ liệu phổ 13 C-NMR của chất N2 (125 MHz, CDCl 3 so với 13 C-NMR của damnacanthal chuẩn theo tài liệu (5)
Vị trí H chuẩn C chuẩn
N2 H chuẩn
H chuẩn N2
=C(1)-O- 166,7 166,7
>C(2)= 118,5 118,1
=C(3)-O- 166,6 166.6
=C(4)H- 113,1 117,4 7,66(s) 7,68(s)
=C(5)H- 127,4 127,4 8,20(m) 8,3(m)
=C(6)H- 127,1 127,1 8,20(m) 8,3(m)
=C(7)H- 134,8 134,9 7,75(m) 7,8(m)
=C(8)H- 134,0 134,8 7,75(m) 7,8(m)
>C(9)=O 187,5 181,9
>C(10)=O 180,2 180,2
>C(11)= 133,6 133,6
Trang 5Vị trí H chuẩn C chuẩn
N2 H chuẩn
H chuẩn N2
>C(12)= 133,0 132,5
>C(13)= 113,0 113,1
>C(14)= 145,0 141,7
-C(15)HO 195,5 195,5 12,26(s) 12,27(s)
-OMe(16) 64,7 64,7 4,13(s) 4,13(s)
=C(1)-O- 166,7 166.7
Cấu trúc chất N2 là damnacanthal (C16H10O5
KẾT LUẬN
Kết quả nghiên cứu đã xác định phương
pháp ổn định và qui trình chiết xuất, phân lập,
tinh khiết hóa chất damnacanthal và
nor-damnacanthal từ rễ nhàu Xác định độ tinh khiết
bằng HPLC và kiểm tra cấu trúc bằng phổ
NMR Kết quả thu được nor-damnacanthal với
độ tinh khiết 99, 5% (HPLC), damnacanthal tinh
khiết 99, 7% (HPLC) đạt tiêu chuẩn làm chất đối
chiếu Kết quả nghiên cứu cũng là cơ sở điều
chế chất đối chiếu với qui mô lớn phục vụ công tác nghiên cứu và kiểm nghiệm
TÀI LIỆU THAM KHẢO
ứng dụng vào nghiên cứu, kiểm nghiệm dược phẩm, dược liệu
và hợp chất tự nhiên, NXB Y Học, tr.150 – 155
hóa học và tác dụng sinh học cây Nhàu, khóa luận tốt nghiệp dược sĩ Đại học, ĐHYD Tp.Hồ Chí Minh
Y học, tr.306 -307
tích hữu cơ, NXB Đại học quốc gia, thành phố Hồ Chí Minh, tr 87-95
Phi, Nguyen Hai Nam, you yong jea AndByung- Zun Ahn (1999), Cytotoxicity of some antraquinones from the stem of Morinda citrifolia Growing in Viet Nam, Hoa Hoc, 3(37), pp
94-97
6 Leitsner E (1975), Planta Medica, 214-224 [in C.A., (83), pp
17545
tranformed cells by Damnacanthal from Morinda citrifolia, Cancer Letter (73), pp.161-166.
Trang 6THE HERBAL – DRUG INTERACTION BETWEEN GINSENG (Panax ginseng) AND METFORMIN ON THE HYPOGLYCEMIC EFFECT IN ALLOXAN - INDUCED DIABETIC MICE 180 Hua Hoang Oanh * Y Hoc TP Ho Chi Minh * Vol 16 - Supplement of No 1 – 2012 : 180 – 185 180 STUDY ON THE ANDROGENIC EFFECT OF THE ALCOHOL EXTRACT OF EURYCOMA LONGIFOLIA JACK
‘S ROOTS ON MICE 186 Tran My Tien, Nguyen Thanh Hong Van,Tran Cong Luan,Nguyen Thi Thu Huong * Y Hoc TP Ho Chi Minh * Vol 16 - Supplement of No 1 – 2012: 186 – 191 186 STUDY ON THE ANDROGENIC EFFECT OF MORINDA OFFICINALIS HOW 192
Tran My Tien, Nguyen Mai Thanh Tam, Tran Cong Luan, Nguyen Thi Thu Huong * Y Hoc TP Ho Chi Minh * Vol 16 -
Supplement of No 1 – 2012 : 192– 198 192 PRELIMINARY STUDY ON BIOACTIVITIES OF BLEPHARIS MADERSPATENSIS (L.) ROTH 199 Van Đuc Thinh, Le Thi Hong Quy, Tran Cong Luan * Y Hoc TP Ho Chi Minh * Vol 16 - Supplement of No 1 – 2012 :
199 – 206 199 STANDARDIZATION OF BO DUONG HOAN NGU THANG EXTRACT AND CAPSULE 207 Truong Huu Nhan, Tran Thi Bach Tuyet, Phan Quan Chi Hieu, Nguyen Phuong Dung, Bui My Linh, Pham Thi My Nhung, Tran Phuc Vinh * Y Hoc TP Ho Chi Minh * Vol 16 - Supplement of No 1 – 2012 : 207 –212 207 STUDY OF BOTANY CHARACTERISTICS AND CHEMICAL COMPOSITION OF BLUMEA BALSAMIFERA (L.)
DC ASTERACEAE 213 Tran Thi Thuy Quynh, Nguyen Thai Linh, Nguyen Thi Nghi Trung * Y Hoc TP Ho Chi Minh * Vol 16 -
Supplement of No 1 – 2012 : 213 – 216 213 COMPARISON OF ANATOMICAL CHARATERISTICS AND CHEMICAL CONSTITUENTS OF THE RHIZOME SAMPLES OF HOMALOMENA SP COLLECTED AT CON DAO AND THE RHIZOME OF HOMALOMENA OCCULTA (LOUR.) SCHOTT 217 Dinh Thi Hai Huong, Tran Thi Thanh Tu, Duong Thi Mong Ngoc, Phan Phuoc Hien, Tran Cong Luan * Y Hoc TP Ho Chi Minh * Vol 16 - Supplement of No 1 – 2012 : 217 – 223 217 STUDY ON THE STANDARDIZATION OF BO KHI HOAT HUYET CAPSULES 224 Lam Bich Thao, Duong Thi Mong Ngoc, Nguyen Phuong Dung * Y Hoc TP Ho Chi Minh * Vol 16 - Supplement of No
1 – 2012 : 224 – 229 224 PREPARATION OF DAMNACANTHAL AND NOR – DAMNACANTHAL REFERENCE STANDARD FROM ROOTS OF MORINDA CITRIFOLIA L., (RUBIACEAE) 229 Duong Hong To Quyen, Nguyen Minh Duc * Y Hoc TP Ho Chi Minh * Vol 16 - Supplement of No 1 – 2012 : 230 – 234 229