Mục tiêu nghiên cứu của bài viết nhằm chuẩn hóa kỹ thuật và xác định tính chính xác của xét nghiệm đột biến gen EGFR bằng kỹ thuật Strip Assay đang thực hiện tại Đơn vị Gen Trị liệu, Bệnh viện Bạch Mai. Phương pháp: 29 mẫu bệnh phẩm do Mạng lưới Kiểm soát Chất lượng Di truyền học Phân tử châu Âu.
Trang 1KẾT QUẢ NGOẠI KIỂM CHUẨN XÉT NGHIỆM ĐỘT BIẾN GEN EGFR
NĂM 2014 VÀ 2015 TẠI BỆNH VIỆN BẠCH MAI
Ph m C m Ph ơng*; Mai Tr ng Khoa*; Nguy n Ti n Lung*
TÓM TẮT
Mục tiêu: chu ẩn hóa kỹ thuật và xác định tính chính xác của xét nghiệm đột biến gen EGFR bằng kỹ thuật Strip Assay đang thực hiện tại Đơn vị Gen Trị liệu, Bệnh viện Bạch Mai Phương pháp: 29 mẫu bệnh phẩm do Mạng lưới Kiểm soát Chất lượng Di truyền học Phân tử châu Âu (The European Molecular Genetics Quality Network - EMQN) và Hệ thống Ngoại kiểm Chất lượng Vương quốc Anh (UK National External Quality Assessment Schemes - UK NEQAS)
cung cấp năm 2014, 2015 để xác định đột biến gen EGFR bằng kít EGFR StripAssay®
(ViennaLab) Các kết quả này sẽ được gửi trả trực tuyến và các tổ chức này đánh giá, công bố
kết quả Kết quả: cả 29 mẫu kiểm chuẩn thực hiện đều cho kết quả chính xác với công bố của EMQN và UK NEQAS (đạt 100%) Kết luận: kỹ thuật xét nghiệm sử dụng kít EGFR StripAssay®
và thiết bị hiện có tại Đơn vị Gen Trị liệu, Bệnh viện Bạch Mai đảm bảo tiêu chuẩn để phát hiện
đột biến gen EGFR Các xét nghiệm này có độ chính xác cao, ổn định, từ đó cung cấp thông tin
chính xác cho bác sỹ lâm sàng chẩn đoán và lập điều trị cho bệnh nhân (BN) ung thư phổi (UTP) không tế bào nhỏ
* Từ khóa: Ung thư phổi không tế bào nhỏ; Đột biến gen EGFR; Ngoại kiểm kiểm tra chất lượng xét nghiệm
The Results of External Quality Assessment of EGFR Mutations Testing at Bachmai Hospital
Summary
Objectives: To standardize the technique and assess the realibility of EGFR mutations tests
by Strip Assay technique at the Gene Therapy Unit, Bachmai Hospital Methods: 29 samples for external quality assessment which obtained from the European Molecular Genetics Quality Network (EMQN) and UK National External Quality Assessment Schemes (UK NEQAS) from
2014 to 2015 were detected EGFR mutations by EGFR StripAssay® (ViennaLab), these results were submited online and compared with validated results Results: All of samples had same results with publication of EMQN and UK NEQAS (100% efficiency) Conclusion: EGFR mutations tests with EGFR StripAssay® kit and equipment available at the Gene Therapy Unit, Bachmai Hospital ensure the quality to detect EGFR mutations These tests have high accuracy, providing more details for clinicians in diagnosis and treatment of non-small lung cancer management
* Key words: Non-small cell lung cancer; EGFR mutation; External quality assessment
* Bệnh viện Bạch Mai
Ngày nh n bài: 04/07/2016; Ngày ph n bi n đánh giá bài báo: 13/12/2016
Trang 2ĐẶT VẤN ĐỀ
Ung thư phổi là bệnh ung thư phổ biến
trên thế giới và ở Việt Nam Hiện nay, có
nhiều tiến bộ trong chẩn đoán (sinh học
phân tử, tế bào…) và điều trị bệnh UTP
(phẫu thuật, xạ trị, hóa trị, điều trị đích…),
do đó đã nâng cao hiệu quả điều trị và cải
thiện chất lượng sống cho người bệnh
Một trong những tiến bộ trong chẩn
đoán là xét nghiệm đột biến gen EGFR
(Epidermal Growth Factor Receptor: thụ
thể yếu tố phát triển biểu mô) Gen EGFR
này đóng vai trò quan trọng trong hoạt
động chức năng phát triển và biệt hóa
của tế bào Đột biến EGFR dẫn đến tăng
biểu hiện hoặc tăng cường hoạt động của
EGFR được phát hiện trong nhiều loại
bệnh ung thư trong đó có UTP
Hiện nay, đã có nhiều bước tiến quan
trọng trong điều trị, như sự ra đời của các
thuốc điều trị đích (kháng thể đơn dòng,
thuốc phân tử nhỏ, ức chế vùng tyrosine
kinase [tyrosine kinase inhibitor - TKI] của
thụ thể yếu tố tăng trưởng biểu mô) đã
được sử dụng để điều trị cho BN UTP
không tế bào nhỏ Các nghiên cứu trên
thế giới và tại Việt Nam đã cho thấy BN
có đột biến EGFR có thời gian sống thêm
không bệnh tiến triển (progression-free
survival - PFS) và thời gian sống thêm
toàn bộ (overall survival - OS) cao hơn
BN không có đột biến EGFR khi được
điều trị bằng các thuốc TKI [1, 2] Vì vậy,
xét nghiệm đột biến gen EGFR cho BN
UTP không tế bào nhỏ thực sự cần thiết
để các bác sỹ lâm sàng lựa chọn phương
án điều trị tối ưu nhất cho người bệnh
Hiện nay, có nhiều phương pháp khác
nhau để xét nghiệm đột biến gen EGFR
như giải trình tự gen (giải trình tự Sanger hoặc pyrosequencing), real time PCR (ví dụ kít therascreen - Qiagen), lai đầu dò (Strip Assay - ViennaLab)… Mỗi phương pháp đều có những ưu nhược điểm riêng: các kít therascreen, Strip Assay có độ nhạy cao, nhưng chỉ phát hiện được số lượng đột biến giới hạn theo thiết kế kít; trong khi các phương pháp giải trình tự có khả năng phát hiện đột biến mới, hiếm gặp, nhưng đòi hỏi số lượng tế bào mang đột biến trong mẫu phân tích lớn [3] Do vậy, các phương pháp xét nghiệm này có thể cho kết quả khác nhau trên cùng một mẫu phân tích Vì vậy, việc ngoại kiểm tra chất lượng xét nghiệm có vai trò đặc biệt quan trọng trong đánh giá khả năng phát
hiện đột biến gen EGFR
Nhằm chuẩn hóa kỹ thuật, đồng thời xác định tính chính xác và tính ổn định
của xét nghiệm đột biến gen EGFR, Đơn
vị Gen Trị liệu, Bệnh viện Bạch Mai đã tham gia các đợt ngoại kiểm chuẩn chất lượng xét nghiệm của Mạng lưới EMQN
và Hệ thống UK NEQAS, đều có trụ sở tại Thành phố Manchester, Anh
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU
1 Đối tượng nghiên cứu
29 mẫu bệnh phẩm UTP không tế bào nhỏ nhận được từ EMQN (10 mẫu năm
2014, 10 mẫu năm 2015) và UK NEQAS (9 mẫu năm 2015) Các mẫu này đều được cố định bằng formalin và đúc paraffin (formalin-fixed, paraffin-embedded - FFPE)
Trang 3để làm tiêu bản HE và phân tích đột biến
gen EGFR Đây là các mẫu mù, gửi cho
tất cả các phòng thí nghiệm đăng ký tham
gia ngoại kiểm, trong đó tình trạng đột
biến gen EGFR xác định trước đó từ một
phòng thí nghiệm chuẩn
2 Phương pháp nghiên cứu
* Địa điểm nghiên cứu: Đơn vị Gen Trị
liệu, Trung tâm Y học Hạt nhân và Ung
bướu - Bệnh viện Bạch Mai
* Thời gian nghiên cứu: năm 2014 -
2015
* Phương pháp nghiên cứu: đối chiếu
kết quả phân tích đột biến EGFR tại Bệnh
viện Bạch Mai với kết quả của các tổ
chức ngoại kiểm
* Thiết bị, vật tư, hóa chất:
- Thiết bị: thiết bị cơ bản của phòng thí
nghiệm sinh học phân tử như bộ pipet
kèm giá đỡ (Eppendorf Research Plus),
máy ly tâm lạnh (Eppendorf 5424R),
máy ủ nhiệt kèm lắc rung (Eppendorf
Thermomixer comfort), máy định lượng
ADN theo nguyên tắc huỳnh quang
(Qubit® 2.0 Fluorometer), máy PCR
(Eppendorf Mastercycler pro S)…
- Hóa chất: kít tách ADN từ mô FFPE
(PureLink® Genomic DNA Mini Kit,
Invitrogen), kít định lượng ADN theo
nguyên tắc huỳnh quang (Qubit™ dsDNA
HS, Molecular Probes), kít xác định đột
biến gen EGFR (EGFR StripAssay®,
ViennaLab)…
- Vật tư tiêu hao: vật tư cần thiết được
các hãng uy tín cung cấp: ống PCR; ống
ly tâm 1,7 ml; đầu tip 10, 20, 200, 1.000 µl
(Corning); ống Qubit assay (Invitrogen)…
* Các bước tiến hành: 29 mẫu bệnh phẩm được thực hiện xét nghiệm đột biến
EGFR theo quy trình như sau: tách ADN
từ mô FFPE (sử dụng kít PureLink®
Genomic DNA Mini Kit, Hãng Invitrogen), định lượng ADN (Qubit™ dsDNA HS, Molecular Probes), khuếch đại đoạn gen quan tâm bằng phản ứng PCR và lai sản phẩm khuếch đại với đầu dò đặc hiệu (EGFR StripAssay®, ViennaLab), phân tích kết quả (sử dụng phần mềm StripAssay®
Evaluator, ViennaLab)
* Đối chiếu kết quả: kết quả phân tích được gửi trực tuyến cho EMQN và UK NEQAS Sau đó, các tổ chức này sẽ so sánh kết quả của Bệnh viện Bạch Mai với kết quả xét nghiệm đã biết trước, từ đó sẽ phân tích, đánh giá về chất lượng xét
nghiệm EGFR tại Đơn vị Gen Trị liệu,
Bệnh viện Bạch Mai
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ
BÀN LUẬN
1 Kết quả ngoại kiểm của EMQN năm 2014
Việc ngoại kiểm tra chất lượng xét nghiệm có vai trò đặc biệt quan trọng trong đánh giá khả năng phát hiện đột
biến gen EGFR Nhằm chuẩn hóa kỹ
thuật, đồng thời xác định tính chính xác
và tính ổn định của xét nghiệm đột biến
gen EGFR, Đơn vị Gen Trị liệu, Bệnh viện
Bạch Mai đã tham gia các đợt ngoại kiểm của hai tổ chức kiểm chuẩn chất lượng xét nghiệm uy tin trên thế giới: EMQN (từ năm 2014) và UK NEQAS (từ năm 2015)
Trang 4Bảng 1: K ết quả phân tích đột biến gen EGFR trên các mẫu kiểm chuẩn EMQN 2014
Mã bệnh
Kết quả phân tích tại Đơn vị Gen Trị liệu
đột biến
đột biến
đột biến
đột biến
Đột biến E746_A750del (exon 19)
Đột biến E746_A750del (exon 19)
Đột biến E746_A750del (exon 19)
Đột biến E746_A750del (exon 19)
Gen EGFR nằm ở nhiễm sắc thể 7p11.2,
dài khoảng 200 kb, chứa 28 exon Các đột
biến liên quan đến đáp ứng với TKI nằm
trên các exon từ 18 - 21, trong đó các đột
biến thay thế ở exon 18 và 21, mất đoạn
ở exon 19 (chiếm chủ yếu) làm tăng độ
nhạy với thuốc, đột biến thay thế T790M
và một số đột biến thêm đoạn trên exon
20 (chiếm tỷ lệ nhỏ) liên quan đến kháng
thuốc Tỷ lệ đột biến EGFR phụ thuộc vào
chủng tộc, tình trạng hút thuốc lá, giới…,
tỷ lệ đột biến EGFR ở người chủng tộc
châu Á cao hơn chủng tộc châu Âu, châu
Mỹ [2, 4]
Chúng tôi sử dụng kít EGFR StripAssay® (ViennaLab) để phân tích đột biến gen
EGFR Đây là kít được thiết kế theo nguyên tắc PCR kết hợp lai đầu dò đặc hiệu: giai đoạn PCR sử dụng mồi (primer) đặc hiệu giúp khuếch đại chính xác với các trình tự gen quan tâm Phân tử biotin được gắn trên mồi nhờ đó cũng đưa vào sản phẩm khuếch đại Ở giai đoạn lai, những đoạn ADN được khuếch đại kết hợp chính xác với đầu dò (probe) tương ứng trên teststrip, phân tử biotin gắn trên những đoạn này được hoạt hoá bởi streptavidin thành dạng phát màu
Trang 5Nhờ đó, dễ dàng phát hiện kết quả bằng
cách so màu trên teststrip, đối chiếu với
thang chuẩn bằng mắt thường hoặc
phần mềm StripAssay® Evaluator Bộ kít
có độ nhạy cao, có khả năng phát hiện
khi số lượng tế bào mang đột biến < 1%,
đồng thời được cấp chứng chỉ tiêu
chuẩn xét nghiệm châu Âu áp dụng cho
chẩn đoán bệnh (European Conformity -
In Vitro Diagnostics, CE-IVD) Kít EGFR
StripAssay® có khả năng phát hiện
16 đột biến, chiếm tỷ lệ cao nhất trên exon 18 - 21 và có vai trò trong đáp ứng điều trị với TKI Hiện nay, chúng tôi
đã chuyển sang sử dụng kít EGFR XL StripAssay® được cải tiến từ kít EGFR StripAssay®, trong đó số lượng đột biến phát hiện cao hơn (30 đột biến trên các exon 18 - 21) để nâng cao hơn chất lượng xét nghiệm
Kết quả phân tích đột biến gen EGFR trên 10 mẫu kiểm chuẩn tại Đơn vị Gen Trị
liệu đều cho kết quả chính xác theo công bố của EMQN 2014, đạt tỷ lệ 100%
Hình 1: Phân tích kết quả trên thanh teststrip
(Trên mỗi thanh teststrip có sẵn vạch control cho phản ứng lai, PCR negative control cho từng exon [vạch 17 - 20] và PCR positive control (vạch 21) làm đối chứng Các vạch
1 - 16 tương ứng với 16 đột biến trên 4 exon 18 - 21 Mẫu 01.6127774 [trái] không phát hiện đột biến, mẫu 02.6130768 [giữa] phát hiện đột biến L858R trên exon 21,
mẫu 03.6153218 [phải] phát hiện đột biến G719S trên exon 18)
Trang 62 Kết quả ngoại kiểm của EMQN năm 2015
Bảng 2: So sánh k ết quả phân tích đột biến gen EGFR trên các mẫu kiểm chuẩn
EMQN 2015
Mã
Vị trí/phương
Kết quả phân tích tại Đơn vị Gen Trị liệu
(biểu mô tuyến)
Phế quản (sinh thiết)
Không phát hiện đột biến
Không phát hiện đột biến
(biểu mô tuyến)
U thùy trên phổi phải (phẫu thuật)
Đột biến L861Q (exon 21)
Đột biến L861Q (exon 21)
(biểu mô tuyến)
U thùy trên phổi phải (phẫu thuật)
Đột biến T790M (exon 20)
Đột biến T790M (exon 20)
cung cấp
EMQN không cung cấp
Không phát hiện đột biến
Không phát hiện đột biến
cung cấp
EMQN không cung cấp
Đột biến L858R (exon 21)
Đột biến L858R (exon 21)
cung cấp
EMQN không cung cấp
Không phát hiện đột biến
Không phát hiện đột biến
cung cấp
EMQN không cung cấp
Đột biến L858R (exon 21)
và T790M (exon 20)
Đột biến L858R (exon 21)
và T790M (exon 20)
cung cấp
EMQN không cung cấp
Không phát hiện đột biến
Không phát hiện đột biến
cung cấp
EMQN không cung cấp
Đột biến E746_S752del-insV (exon 19)
Đột biến E746_S752del-insV (exon 19)
cung cấp
EMQN không cung cấp
Đột biến E746_A750del (exon 19)
Đột biến E746_A750del (exon 19)
Tương tự EMQN 2014, kết quả phân tích đột biến gen EGFR trên 10 mẫu kiểm
chuẩn EMQN 2015 tại Đơn vị Gen Trị liệu đều cho kết quả chính xác theo công bố,
đạt tỷ lệ 100%
Trang 73 Kết quả ngoại kiểm của UK NEQAS năm 2015
2015
Mã bệnh
Kết quả phân tích tại Đơn vị Gen Trị liệu
tuyến)
U phổi (phẫu thuật)
Không phát hiện
đột biến
Đột biến L747_P753delinsS (exon
19)
Đột biến L747_P753delinsS (exon 19)
Đột biến G746_P753delinsVS (exon 19) và T790M (exon 20)
Đột biến T790M (exon 20)
đột biến
đột biến
đột biến
Kết quả phân tích đột biến gen EGFR
trên 9 mẫu kiểm chuẩn UK NEQAS 2015
tại Đơn vị Gen Trị liệu cho kết quả chính
xác 7/9 mẫu Đối với 2 trường hợp mẫu
192L15D và 233L15C, UK NEQAS xác
nhận kết quả phân tích tại Đơn vị Gen Trị
liệu không phát hiện được các đột biến
hiếm gặp do hạn chế của kít xét nghiệm,
do đó vẫn đánh giá độ chính xác 100% về
chất lượng labo
Kết quả ngoại kiểm theo EMQN trong
năm 2014 và 2015 cho thấy Đơn vị Gen
Trị liệu cho kết quả chính xác 100% theo công bố của EMQN Đây là kết quả rất đáng khích lệ khi so sánh với kết quả tổng hợp của EMQN, tỷ lệ xét nghiệm lỗi của các phòng thí nghiệm tham gia ngoại kiểm năm 2014 là 3,8%, năm 2015 là 4,2%, nhưng tỷ lệ này ở Đơn vị Gen Trị liệu là 0% trong cả 2 năm Những vấn đề sai sót xảy ra ở các labo có thể do trường hợp đột biến hiếm gặp như G719S trên exon
18, E746_S752delinsV trên exon 19 hay L861Q trên exon 21 (được khuyến cáo không phát hiện bằng kít cobas); hoặc mẫu
Trang 8có tỷ lệ tế bào mang đột biến thấp (như mẫu
2, 3 và 7 của EMQN 2014 có tỷ lệ này
< 15%), gây nên âm tính giả khi sử dụng
các phương pháp hoặc kít xét nghiệm có
độ nhạy không cao, đặc biệt là phương pháp giải trình tự gen [5, 6]
Bảng 4: Tổng hợp xét nghiệm lỗi của các labo tham gia kiểm chuẩn EMQN năm
2014 và 2015
(%)
(Năm 2014 có 277 labo ở 39 quốc gia đang ký tham gia, trong đó 258 labo hoàn thành và báo cáo kết quả Năm 2015 có 290 labo báo cáo kết quả trong tổng số
321 labo [ở 47 quốc gia] đăng ký tham gia)
Đối với kết quả ngoại kiểm theo UK
NEQAS 2015, Đơn vị Gen Trị liệu thực
hiện trên 9 mẫu bệnh phẩm, cho kết quả
chính xác 7/9 mẫu Đối với mẫu 192, khi
sử dụng kít EGFR StripAssay®, chúng tôi
chỉ phát hiện đột biến T790M trên exon 20,
thực tế mẫu này có thêm đột biến
G746_P753delinsVS trên exon 19 (đây là
đột biến rất hiếm gặp, theo cơ sở dữ liệu
COSMIC phân tích trên 141.465 bệnh
nhân, đột biến này chỉ chiếm 0,02% tổng
số đột biến) Đột biến này có thể phát
hiện được bằng kít EGFR XL StripAssay®
mà chúng tôi đang sử dụng hiện nay Trong khi đó, mẫu 233 mang đồng thời 2 đột biến hiếm gặp trên exon 20: đột biến thêm đoạn S768_D770 (0,02%) và đột biến thay thế P772A (< 0,01%), đều là những dạng không phát hiện được bằng kít EGFR StripAssay® Trong cả 2 trường hợp này, UK NEQAS đều xác nhận do hạn chế của kít xét nghiệm và vẫn đánh giá độ chính xác 100% về chất lượng labo [7, 8]
Trang 9Bảng 5: Tổng hợp xét nghiệm lỗi của các labo tham gia kiểm chuẩn UK NEQAS năm 2015
(Có 100 labo báo cáo kết quả trong tổng số 105 labo đăng ký tham gia)
Hiện nay, có nhiều phương pháp khác
nhau để xét nghiệm đột biến gen EGFR
như giải trình tự gen (giải trình tự Sanger
hoặc pyrosequencing), real time PCR
(ví dụ như kít therascreen - Qiagen, cobas -
Roche), lai đầu dò (Strip Assay -
ViennaLab)… Mỗi phương pháp đều có
những ưu nhược điểm riêng: kít therascreen,
cobas, Strip Assay có độ nhạy cao, có
chứng chỉ IVD, nhưng chỉ phát hiện được
số lượng đột biến giới hạn theo thiết kế
kít (thường là các dạng đột biến phổ biến,
với tổng tỷ lệ xuất hiện chiếm > 95%);
trong khi các phương pháp giải trình tự có
khả năng phát hiện được đột biến mới,
hiếm gặp, nhưng đòi hỏi số lượng tế bào
mang đột biến trong mẫu phân tích lớn, đồng thời kết quả xét nghiệm phụ thuộc nhiều vào kỹ thuật viên (thiết kế mồi, thao tác thực hiện, nhận định kết quả) [3] Thực tế qua kết quả tổng kết của 3 đợt ngoại kiểm cho thấy: một số dạng đột biến hiếm gặp không phát hiện được bằng các kít thương mại như L861Q trên exon 21 (không phát hiện được bằng kít cobas - Roche), thêm đoạn exon 20 (đối với kít therascreen - Qiagen, Strip Assay - ViennaLab); các phương pháp giải trình
tự gen cho kết quả âm tính giả đối với mẫu có tỷ lệ tế bào mang đột biến thấp, ngoài ra chất lượng xét nghiệm không
ổn định [5, 6, 7, 8]
Trang 10Bảng 6: Ưu, nhược điểm của một số phương pháp phát hiện đột biến gen EGFR [3]
Số xét nghiệm tối thiểu
Khả năng phát hiện đột
Thiết bị chuyên dụng
cần thiết
Hệ thống giải trình tự Sanger
Hệ thống pyrosequencing
Hệ thống real
PCR
KẾT LUẬN
Qua nghiên cứu 29 mẫu bệnh phẩm
UTP không tế bào nhỏ thực hiện ngoại
kiểm xét nghiệm EGFR tại Đơn vị Gen Trị
liệu, Bệnh viện Bạch Mai năm 2014 -
2015 cho thấy:
- Kỹ thuật xét nghiệm sử dụng kít
EGFR StripAssay® và các thiết bị hiện có
tại Đơn vị Gen Trị liệu, Bệnh viện Bạch
Mai đảm bảo tiêu chuẩn để phát hiện đột
biến gen EGFR
- 27/29 mẫu ngoại kiểm cho kết quả
chính xác, 2 mẫu còn lại mang các đột
biến rất hiếm gặp và không có trong thiết
kế của bộ kít, do đó vẫn được các tổ
chức ngoại kiểm đánh giá labo Đơn vị
Gen Trị liệu cho kết quả chính xác 100%
Như vậy, xét nghiệm đột biến gen
EGFR thực hiện tại Bệnh viện Bạch Mai
có độ chính xác và ổn định cao Từ đó,
cung cấp thêm thông tin đáng tin cậy cho
bác sỹ lâm sàng trong điều trị UTP không
tế bào nhỏ
L i c m ơn: Nhóm nghiên cứu xin chân thành cảm ơn Công ty Roche và AstraZeneca đã hỗ trợ đăng ký tham gia kiểm chuẩn xét nghiệm đột biến gen
EGFR
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1 Tạ Thành Văn Nghiên cứu xác định đột biến gen quyết định tính đáp ứng thuốc trong điều trị ung thư đại trực tràng và UTP Đề tài Khoa học cấp Nhà nước KC.04.06/11-15 Bộ Khoa học và Công nghệ 2014
2 Shi Y, Au J.S, Thongprasert S, Srinivasan S, Tsai CM, Khoa M T et al A
prospective, molecular epidemiology study of EGFR mutations in Asian patients with advanced non-small-cell lung cancer of adenocarcinoma histology (PIONEER) J Thorac Oncol 2014,
9 (2), pp.154-162
3 Jancik S, Drabek J et al A comparison
of direct sequencing, pyrosequencing, high resolution melting analysis, TheraScreen DxS, and the K-ras Strip Assay for detecting KRAS
mutations in non small cell lung carcinomas
Journal of Experimental & Clinical Cancer Research 2012, 31, pp.79-91