Vấn đề được đặt ra ở nghiên cứu này đó là một số bệnh lý khiếm khuyết tế bào vùng rìa giác mạc bẩm sinh hoặc mắc phải bởi các nguyên nhân như hội chứng steven johnson, phẫu thuật giác mạc nhiều lần, bỏng nhiệt hoặc hóa chất tạo sẹo giác mạc, nhiễm trùng, đeo contact lens... dẫn đến phá hủy lớp biểu mô giác mạc gây giảm thị lực của bệnh nhân. Để điều trị hiệu quả, bệnh nhân cần phải tạo được lớp biểu mô giác mạc thay thế.
Trang 1NGHIÊN CỨU NUÔI CẤY TẾ BÀO GỐC VÙNG RÌA GIÁC MẠC
VÀ NIÊM MẠC MÁ TỰ THÂN ĐIỀU TRỊ BỆNH LÝ BIỂU MÔ GIÁC MẠC
Trần Công Toại * , Trần Thị Thanh Thủy * , Phan Kim Ngọc ** , Diệp Hữu Thắng ***
TÓM TẮT
Đặt vấn đề: Một số bệnh lý khiếm khuyết tế bào vùng rìa giác mạc bẩm sinh hoặc mắc phải bởi các nguyên
nhân như hội chứng Steven Johnson, phẫu thuật giác mạc nhiều lần, bỏng nhiệt hoặc hóa chất tạo sẹo giác mạc, nhiễm trùng, đeo contact lens…dẫn đến phá hủy lớp biểu mô giác mạc gây giảm thị lực của bệnh nhân Để điều trị hiệu quả, bệnh nhân cần phải tạo được lớp biểu mô giác mạc thay thế
Vật liệu và phương pháp nghiên cứu: Thiết kế nghiên cứu: Nghiên cứu loạt ca Phương pháp nghiên
cứu: Bệnh nhân được chia làm 2 nhóm dựa theo chỉ định để tiến hành ghép tế bào gốc Nhóm 1: ghép “tấm biểu mô” được tạo thành từ niêm mạc má Nhóm: ghép “tấm biểu mô” được tạo thành từ tế bào gốc vùng rìa giác mạc Tế bào rìa giác mạc và niêm mạc má được thu nhận theo đúng tiêu chuẩn chọn mẫu và tạo tấm biểu mô theo qui trình Đánh giá: Tế bào nuôi cấy được theo dõi dưới kính hiển vi đảo ngược pha, nhuộm mô học HE và nhuộm hóa mô miễn dịch với marker p63 Kết quả ghép tấm biểu mô trên bệnh nhân được theo dõi và dựa trên khám bề mặt giác mạc, đánh giá thị lực và kết quả tạo tân mạch giác mạc
Kết quả và bàn luận: Sau khi tiến hành nghiên cứu, chúng tôi đạt được một số kết quả như sau: - Nhóm 1:
bề mặt nhãn cầu ổn định 6/7 mắt Thị lực cải thiện nhưng không quá 1 hàng - Nhóm 2: bề mặt nhãn cầu ổn định 22/23 ca Thị lực cải thiện lớn hơn 2 hàng 20/23 ca Kết quả này cho thấy tính hiệu quả của phương pháp điều trị như các tác giả khác trên thế giới
Kết luận: Chúng tôi đã sử dụng thành công kỹ thuật nuôi cấy tế bào gốc an toàn và hữu dụng, đặc biệt điều
trị bệnh lý bề mặt nhãn cầu ở chuyên khoa mắt
Từ khóa: ghép tế bào gốc, niêm mạc má, rìa giác mạc
ABSTRACT
CULTURE OF AUTOGRAFT LIMBAL CELLS AND CHEEK EPITHELIAL CELLS TO TREAT
CORNEAL EPITHELIUM DISEASE
Tran Cong Toai, Tran Thi Thu Thuy, Phan Kim Ngoc, Diep Huu Thang
* Y Hoc TP Ho Chi Minh * Vol 15 - Supplement of No 2 - 2011: 24 - 30
Introduction: Some pathologies of corneal cell edge region may be of congenital origin such as Steven
Johnson syndrome, or can be caused by mechanical or environment condition such as corneal multiple surgeries, chemicals that eventually generate infection due to different auto-immune reaction All these condition may eventually lead to the destruction of cornea epithelial layer causing either a decrease or a total loss of vision For an effective treatment, patients need to be regenerated the corneal epithelial layer
Materials and methods: Research design: Case series study
Methods: Patients were divided into 2 groups to conduct stem cell transplantation: Group 1: graft
“epithelial sheets” are made up of oral mucosa Group 2: graft “epithelial sheets” are formed from stem cell of
*Trường ĐH Y Khoa Phạm Ngọc Thạch, **Trường ĐH Khoa Học Tự Nhiên- ĐH Quốc Gia Tp.HCM
***Bệnh viện Mắt Tp.HCM
Tác giả liên lạc: PGS TS BS Trần Công Toại ĐT: 0913.914.672
Trang 2corneal area (limbal stem cell) Corneal cell edge and oral mucosa were included as standard sample and generate epithelial sheets in the protocol
Evaluation: Cells were monitored by inverted phase microscopy, HE staining and immune-histochemical
staining by p63 marker Results of the epithelial sheet transplant are monitored and evaluated by the corneal surface examination, vision and corneal new vessels
Results and discussion: After conducting research, we obtained the results as follows: - Group 1: Stable
surface eyeball 6/7 eyes Vision improved, but not more than 1 row - Group 2: Stable surface eyeball 22/23 eyes Vision improved, but not more than 2 row This result shows the effectiveness of treatment in line with other international studies
Conclusion: We used a successfully technique which confirmed that cultured stem cells are safe and useful
in the treatment of few eye pathological condition
Key words: stem cell transplantation, oral mucosa, of corneal area (limbal stem cell)
ĐẶT VẤN ĐỀ
Nghiên cứu tế bào gốc là một lĩnh vực mang
tính thời sự hiện nay trên thế giới vì những tiềm
năng ứng dụng to lớn của chúng trong lĩnh vực
Y Sinh học(18,19,21,32) Tuy nhiên, tùy theo định
hướng nghiên cứu của mỗi nhóm nghiên cứu,
mỗi vùng miền và mỗi quốc gia mà khả năng
nghiên cứu được tiến hành trên những quy mô
nghiên cứu khác nhau Ở nước ta nghiên cứu tế
bào gốc đang từng bước được quan tâm bởi các
nhà khoa học, các nhà nghiên cứu, các bác sĩ lâm
sàng cũng như các nhà đầu tư chiến lược khoa
học của nhà nước và đang được đầu tư vào lĩnh
các nước trong khu vực, Việt Nam chúng ta bắt
đầu xây dựng chiến lược, đào tạo đội ngũ
chuyên gia, cơ sở hạ tầng và mức độ đầu tư
cũng như những sản phẩm công nghệ tế bào
gốc như quy trình công nghệ, công trình công
bố khoa học chuyên ngành …tuy nhiên vẫn chỉ
ở điểm xuất phát
Nhờ vào sự giúp đỡ, chuyển giao kỹ thuật
từ phòng thí nghiệm tiên tiến tại Nhật(21,22,23)
chúng tôi có thể tiếp cận, triển khai các qui trình
mới mẻ nhưng có giá trị vô cùng to lớn, thực
hiện nghiên cứu ứng dụng tế bào vùng rìa giác
mạc và niêm mạc má người tạo tấm biểu mô
điều trị các bệnh lý tổn thương biểu mô giác
mạc tự thân qua nuôi cấy(23,25,28)
Thực hiện đề tài chúng tôi cần đạt các mục
tiêu sau:
Tạo tấm biểu mô giác mạc từ tế bào gốc vùng rìa và tế bào niêm mạc má
Đánh giá kết quả điều trị bệnh nhân tổn thương biểu mô giác mạc bằng ghép tấm biểu
mô tự thân qua nuôi cấy tế bào gốc
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Thiết kết nghiên cứu: nghiên cứu loạt ca Các phương pháp nghiên cứu:
Tạo màng collagen từ màng ối người(2,4,10,11,16,17,20,30)
- Sản phụ phải được xét nghiệm âm tính với HIV, HBV, HCV, VDRL… Mẫu được lấy ngay sau sanh, trữ trong lọ vô trùng có chứa dung dịch PBS (Phosphat Buffer Salin), kháng sinh, chuyển nhanh về phòng thí nghiệm
- Rửa màng ối trong dung dịch PBS cho đến khi sạch máu, sạch các mô sống không cần thiết
- Cắt màng ối thành từng mảnh khoảng 50cm2 và xử lý với dung dịch trypsin 0,25% -
- Cạo bỏ lớp tế bào biểu mô màng ối, tránh làm vỡ màng đáy
- Đánh giá hiệu quả bóc tách lớp tế bào biểu
mô màng ối bằng phương pháp nhuộm hematoxylin và eosin (nhuộm H&E)
- Màng collagen được bảo quản 12 tháng sau khi để khô tự nhiên và khử trùng bằng tia gamma
- Trải mẫu màng ối trên đĩa insert, để khô tự nhiên 2 giờ trong buồng cấy, ở nhiệt độ phòng
Trang 3- Khảo sát màng ối sau xử lý bằng cách
quan sát mô học và phân tích độc chất
Phương pháp trải màng collagen trên đĩa
nuôi(1,14,26,31)
Cắt màng collagen thành những mảnh có
diện tích tương ứng bề mặt đĩa nuôi
Trải căng và áp sát màng collagen trên bề
mặt đĩa nuôi (đĩa lồng - insert) sao cho mặt biểu
mô hướng lên trên
Để khô tự nhiên trong tủ cấy
Đóng gói và khử trùng bằng chiếu xạ tia từ
nguồn Co60, suất liều 25 kGy(3,8,15)
Các phương pháp nuôi cấy tế bào 3T3, tế
bào vùng rìa giác mạc và tế bào niêm mạc má
theo đúng qui trình ĐH Tokyo Dental College
Ichikawa(5,7,23)
Tạo tấm biểu mô giác mạc từ TBG vùng rìa
giác mạc
Thu nhận mẫu tế bào vùng rìa giác mạc tại
phòng mổ (Bệnh viện Mắt TP.HCM), cho vào
dung dịch bảo quản Optisol GS, đặt trong hộp
thí nghiệm
Rửa 2 lần bằng dung dịch PBS
Cắt lọc mẫu mô
Nuôi trên đĩa insert đã trảii màng collagen
từ màng ối và có feeder tế bào 3T3 trong môi
Streptomycine, 100U/ml Penicillin, 10ng/ml
EGF, 5 µ/ml Insulin, 0,1 µ/ml Cholera toxin, 5%
FBS)
Mẫu mô có bờ biểu mô áp trên màng, nhỏ 2
giọt môi trường SHEM, ngày tiếp theo thêm
0,5ml môi trường, 2 ngày tiếp theo thay môi
trường 1ml/đĩa insert và 1,5ml/đĩa 3T3
Từ 14-21 ngày tạo được tấm biểu mô có
nhiều lớp tế bào có thể ghép lại cho bệnh nhân
Một phần mẫu giữ lại sau ghép đánh giá mô
học và thực hiện hóa miễn dịch mô
Tạo tấm biểu mô giác mạc từ TBG niêm mạc
má
Niêm mạc má được lấy từ BV Mắt trên người tình nguyện d=0,8 cm đựng trong
thí nghiệm
Cắt lọc mẫu bớt phần mô dưới niêm mạc Tạo ra thành các phần 2mm
sao cho Dipase có nồng độ 0,8UI/ml
Tách tế bào,đếm tế bào sống cấy trên đĩa insert (0,1 – 1 x 105 cells/ml)
Thay môi trường SHEM mỗi 2 ngày, 1ml/đĩa insert và 1,5ml/đĩa tế bào 3T3 Mẫu được tiếp xúc không khí (airlifting) 3 ngày trước khi ghép
Từ 14-21 ngày tạo được tấm biểu mô có nhiều lớp tế bào có thể chuyển lại ghép cho bệnh nhân
Một phần mẫu giữ lại sau ghép đánh giá mô học và hóa miễn dịch mô
Điều trị bệnh lý biểu mô giác mạc và kết quả ghép điều trị 30 bệnh nhân tình nguyện(24,27,29,33) Bệnh nhân đến khám tại Bệnh viện Mắt TP HCM có chỉ định ghép TBG sẽ được chuyển đến khoa Giác mạc
Bác sỹ chuyên khoa Giác mạc sẽ khám, hội chẩn để ra quyết định điều trị Bệnh nhân được bác sĩ chuyên khoa giải thích đầy đủ các nhu cầu và phương pháp điều trị bằng giải pháp nuôi cây tế bào sau nuôi cấy, cam kết đồng ý theo mẫu
Nếu bệnh nhân bị tổn thương một mắt và mắt còn lại tốt sẽ được điều trị ghép TBG vùng rìa giác mạc
Nếu bệnh nhân bị tổn thương cả hai mắt và niêm mạc má còn tốt sẽ được điều trị ghép tấm biểu mô được nuôi cấy từ tế bào niêm mạc má Bệnh nhân sẽ được làm các xét nghiệm tiền phẫu, khám nội khoa tổng quát, khám mắt (đặc biệt đánh giá tình trạng viêm, tân mạch và phim nước mắt)
Trang 4Lấy mẫu tế bào chuyển về phòng thí
nghiệm xử lý và nuôi cấy tạo tấm biểu mô,
hẹn trở lại ghép
Trong nghiên cứu này, chúng tôi:
- Đánh giá bước đầu việc ứng dụng ghép tấm biểu mô điều trị bệnh lý bề mặt nhãn cầu
- Đánh giá chất lượng tấm biểu mô được tạo thành từ nuôi cấy tế bào gốc vùng rìa giác mạc hoặc từ tế bào niêm mạc má trên màng ối
Phân loại
Bệnh nhân được chia làm 2 nhóm dựa theo chỉ định:
- Nhóm 1: ghép “tấm biểu mô” được tạo thành từ tế bào niêm mạc má
- Nhóm 2: ghép “tấm biểu mô” được tạo thành từ tế bào gốc vùng rìa giác mạc
Quy trình chọn lọc bệnh nhân
Tế bào gốc vùng rìa giác mạc: lấy từ kết mạc rìa cực trên 4x2 mm
Tế bào niêm mạc má: lấy từ niêm mạc má, đường kính 8mm
Mẫu được đặt trong môi trường chuyên chở
và gửi đến bộ Phòng thí nghiệm Vật liệu Sinh
Hình 1: Xử lý mẫu tế
bào niêm mạc má
Hình2: Đĩa insert dùng
để nuôi cấy tế bào
H ình 3.9: Tế bào niêm mạc
má sau nuôi cấy 6 ngày
Hình 3.10: Tế bào niêm mạc
má sau nuôi cấy 10 ngày
Hình 3.15: Màng ối trước cấy
tế bào, nhuộm HE x 400
Hình 3.16: Màng ối sau nuôi
cấy, nhuộm HE x400
Hình 3.17: Màng ối sau
nuôi cấy, nhuộm P63 x 400
Hình 3.18: Tấm tế bào từ
Y.Hori (Osaka, Nhật)
Trang 5học, Bộ môn Mô - Phôi, Trường Đại học Y khoa
Phạm Ngọc Thạch thực hiện qui trình nuôi cấy
- Bệnh nhân sẽ được phẫu thuật ghép tấm
biểu mô
- Bệnh nhân được điều trị ngoại trú, không
phải nằm viện
Đánh giá: Đánh giá kết quả dựa trên khám
bề mặt giác mạc, thị lực và tân mạch giác mạc
(tân mạch được chia làm 4 độ: độ 1 là tân mạch
vùng rìa, độ 2 là tân mạch vào giác mạc 3mm,
độ 3 là tân mạch vào toàn bộ giác mạc, độ 4 vào
toàn bộ giác mạc và thành bó tân mạch)
Nhóm 1: Tấm biểu mô được tạo thành từ tế
bào gốc vùng rìa giác mạc của 23 bệnh nhân (16
bệnh nhân mộng thịt tái phát, 4 bệnh nhân bỏng
kiềm,1 bệnh nhân Stevens Johnson,1 bệnh nhân
suy yếu tế bào gốc chưa rõ nguyên nhân và 1
bệnh nhân bị ong chích) Thời gian theo dõi
trung bình 6,34 tháng
Nhóm 2: Tấm biểu mô từ tế bào niêm mạc
má được nuôi cấy trên màng ối của 6 bệnh nhân
(6 mắt) với hội chứng Stevens Johnson và một
bệnh nhân bỏng hóa chất Tổng cộng 7 mắt, thời
gian theo dõi trung bình 18,4 tháng
KẾT QUẢ
Nhóm 1:
- Ghép tế bào gốc vùng rìa
- Thời gian theo dõi trung bình 6,34 tháng
- Bề mặt nhãn cầu ổn định 22/23 ca Một ca bi
nhiễm trùng sau mổ 07 ngày trên bệnh nhân
nhiễm HIV (nhiễm trùng sau đó được điều trị ổn)
- Thị lực cải thiện lớn hơn 2 hàng 20/23 ca
(87%)
- Tân mạch chưa phát triển 18/23 ca
- Độ 1: 3/23 ca, độ 2: 1/23 ca và độ: 4 1/23
Nhóm 2:
- Ghép tế bào niêm mạc má
- Thời gian theo dõi trung bình 18,4 tháng
- Bề mặt nhãn cầu ổn định 6/7 mắt
- Tân mạch độ 1: 5/7 mắt, độ 2: 1/7 mắt, độ 3: 1/7 mắt
- Thị lực có cải thiện nhưng không quá 1 hàng
BÀN LUẬN
Ghép tấm biểu mô được nuôi cấy từ tế bào gốc đã giúp giải quyết được những bệnh lý bề mặt nhãn cầu do suy yếu tế bào gốc vùng rìa giác mạc(6,9,12,13,34)
Phối hợp với ghép giác mạc sẽ đem lại thị lực cho bệnh nhân tốt hơn và góp phần mang lại thành công của phẫu thuật ghép giác mạc Cần điều trị tình trạng viêm bề mặt, tình trạng khô mắt thật tốt sẽ giúp mang lại kết quả tốt
Bệnh nhân cần được làm xét nghiệm tiền phẫu kiểm tra các bệnh liên quan miễn dịch ví
dụ HIV, tiểu đường, viêm khớp, nhằm tiên lượng và hướng điều trị
Hình 3.24: Mắt tổn thương
sẹo giác mạc trước ghép
Hình 3.25: Điều trị tổn thương
sẹo giác mạc trước ghép
Hình 3.26:Tế bào rìa giác mạc
sau nuôi cấy, trước ghép
Hình 3.27: Điều trị tổn thương
sẹo giác mạc trước ghép
Trang 6Đối với bệnh nhân suy giảm miễn dịch cần
rất thận trọng vì rất dễ bị nhiễm trùng do phải
sử dụng corticoid sau mổ
Phẫu thuật không phức tạp nhưng đòi hỏi
sự tỉ mỉ Chọn bệnh nhân đúng chỉ định và theo
dõi chặt chẽ
Với việc ứng dụng keo sinh học collagen sẽ
giúp cho phẫu thuật đơn giản và hiệu quả hơn
Đa số trường hợp có tổn thương giác mạc
nặng thì ghép tế bào gốc là bước đệm của việc
ghép giác mạc sau này
KẾT LUẬN
Thành công của kỹ thuật nuôi cấy tế bào
gốc
Phẫu thuật an toàn và hữu dụng, đặc biệt ở
những trường hợp mộng thịt tái phát, những
trường hợp hội chứng Stevens Johnson có đục
giác mạc cần phẫu thuật ghép giác mạc sau đó
nhằm đem lại thị lực cho bệnh nhân
Mở ra một hướng mới trong việc ứng dụng
tế bào gốc điều trị bệnh lý bề mặt nhãn cầu
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1 Ariane R, Yann B (2006): Essentials of stem cell biology, Elsevier,
Inc.: 440 – 444
2 Azuara BA, Pillai CT, Dua HS (1999) : Amniotic membrane
transplantation for ocular surface reconstruction, Br J Ophthalmol, 83:
399-402
3 Bacakova L, Filova E, Rypacek F, Svorcik V, Stary V (2004): Cell
adhesion on artificial materials for tissue engineering Physiol Res, 53:
35-45
4 Chen HJ, Pires RT, Tseng SC (2000): Amniotic membrane
transplantation for severe neurotrophic corneal ulcers, Br J Ophthalmol,
84: 826-833
5 Der-Yuan W, Yi-Jen H, Vivian CY, Jan-Kan C (2003): Propagation
and phenotypic preservation of rabbit limbal epithelial cells on amniotic
membrane, Investigative Ophthalmology and Visual Science, 44:
4698-4704
6 Higa K, Shimazaki J (2008): Recent advances in cultivated
epithelial transplantation, Cornea, 27(1):S41-47
7 Higa K, Shimmura S, Kato N et al (2007): Proliferation and
differentiation of transplantable rabit epithelial sheets
engineered with or without an amniotic membrane carrier, Invest Ophtalmol Vis Sci, 48: 597–604
8 Higa K, Shimmura S, Shimazaki J, Tsubota K (2005): Hyaluronic acid-CD44 interaction mediates the adhesion of lymphocytes by amniotic membrane stroma, Cornea, 24: 206-212
9 Higa K, Shimmura S, Shimazaki J, Tsubota K (2006): Ocular surface epithelial cells up-regulate HLA-G when expanded in vitro on amniotic membrane substrates, Cornea, 25: 715-721
10 Hopkinson A, Shanmuganathan VA, Gray T, Yeung AM, Lowe
J, James DK, Dua HS (2008): Optimization of amniotic membrane (AM) denuding for tissue engineering, Tissue engineering, 14: 371-383
11 Hori J, Wang M, Kamiya K, Takahashi H, Sakuragawa N (2006): Immunological characteristics of amniotic epithelium, Cornea,
25:53-58
12 Kevin YH Chee, Anthony Kicic, Steven J Wiffen (2006): Limbal stem cells: the search for a marker, Clinical and Experimental Ophthalmology, 34: 64–73
13 Koizumi NJ, Inatomi TJ, Quantock AJ (2000): Amniotic membrane as
a substrate for cultivating limbal epithelial cells for autologous transplantation in rabbits, Cornea, 19: 65-71
14 Kruse FE, Joussen AM, Rohrschneider K, You L, Sinn B, Baumann J, Volcker HE (2000): Cryopreserved human amniotic membrane for ocular surface reconstruction, Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol, 238: 68-75
15 Kubo M, Sonoda Y, Muramatsu R, Usui M (2001): Immunogenicity
of human amniotic membrane in experimental xenotransplantation, Invest Ophthalmol Vis Sci, 42:1539-1546
16 Manabe Y, Himeno N, Fukumoto M (1991): Tensile strength and collagen content of amniotic membrane do not change after the second trimester or during delivery, Obstet Gynecol, 78: 24-27
17 Meller D, Tseng SCG (1999): Stratified Conjunctival Epithelial Cell Differentiation on Amniotic Membrane, Investigative Ophthalmology & Visual Science, 40: 878-886
18 Miki T, Lehmann T, Cai H, Stolz DB, Strom SC (2005): Stem cell characteristics of amniotic epithelial cells, Stem Cells, 23: 1549-1559
19 Miyamoto K, Hayashi K, Suzuki T, Ichihara S, Yamada T, Kano Y, Yamabe T, Ito Y (2004): Human placenta feeder layers support undifferentiated growth of primate embryonic stem cells, Stem Cells, 22: 433-440
20 Rita S, Sumita P, Chacharkar MP (2007): Effect of high doses of gamma radiation on the functional characteristics of amniotic membrane, Rad Phys Chem, 76:1026 – 1030
21 Satake Y, Dogru M, Yamane GY et all (2008): Barrier function and cytologic features of the ocular surface epithelium after autologous cultivated oral mucosal epithelial transplantation, Arch Ophthalmol, 126: 23-8
22 Shimazaki J, Aiba M, Goto E et all (2002): Transplantation of human limbal epithelium cultivated on amniotic membrane for the treatment of severe ocular surface disorders, Ophthalmology, 109:1285-90
23 Shimazaki J, Higa K, Kato N et all (2009): Barrier function of cultivated limbal and oral mucosal epithelial cell sheets, Invest Ophthalmol Vis Sci, 50:5672-80
Trang 724 Shimazaki J, Higa K, Morito F et all (2007):Factors influencing
outcomes in cultivated limbal epithelial transplantation for
chronic cicatricial ocular surface disorders, Am J Ophthalmol,
143: 945-53
25 Shimazaki J, Maruyama F, Shimmura S et all (2001):
Immunologic rejection of the central graft after limbal allograft
transplantation combined with penetrating keratoplasty, Cornea,
20:149-52
26 Shimazaki J, Shimmura S, and Tsubota K (2002): Limbal stem
cell transplantation for the treatment of subepithelial amyloidosis
of cornea (gelatinous drop-like dystrophy), Cornea, 21:177-80
27 Shimazaki J, Shimmura S, Tsubota K (2004): Donor source
affects the outcome of ocular surface reconstruntion in chemical
or thermal burns of the cornea, Opthalmology, 111:38-44
28 Shimmura S, and Tsubota K (2002): Ocular surface
reconstruction update, Curr Opin Ophthalmol, 13:213-219
29 Shimmura S, Tsubota K (2008): Surgical treatment of limbal
stem cell deficiency: are we really transplanting stem cell?, Am J
Ophthalmal, 146:154-5
30 Terada S, Matsuura K, Enosawa S, Miki M, Hoshika A, Suzuki S, Sakuragawa N (2000): Inducing proliferation of human amniotic epithelial (HAE) cells for cell therapy, Cell Transplant, 9:701-704
31 Tseng SC, Prabhasawat P, Barton K, Gray T, Meller D (1998): Amniotic membrane transplantation with or without limbal allografts for corneal surface reconstruction in patients with limbal stem cell deficiency, Arch Ophthalmol, 116: 431-441
32 Tsubota K, Satake Y, Kaido M et all (1999): Treatment of severe ocular-surface disorders with corneal epithelial stem cell transplantation, N Engl J Med, 340:1697-703
33 Tsubota K, Satake Y, Ohyama M, Toda I, Takano Y, Ono M, Shinozaki N, Shimazaki J (1996): Surgical reconstruction of the ocular surface in advanced ocular cicatricial pemphigoid and Stevens-Johnson syndrome, Am J Ophthalmol, 122: 38-52
34 Yiqin Du, Jing Chen, James L Funderburgh, Xiuan Zhu, Lingsong Li (2003): Functional reconstruction of rabbit corneal epithelium by human limbal cells cultured on amniotic membrane, Molecular Vision, 9:635-643