Đề tài này được tiến hành với mục tiêu nhằm xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm chế phẩm thuốc bột phối hợp từ các dược liệu xạ can, bọ mắm và dâu tằm. Mời các bạn cùng tham khảo bài viết để nắm rõ nội dung chi tiết của đề tài nghiên cứu này.
Trang 1XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN KIỂM NGHIỆM CHẾ PHẨM THUỐC BỘT PHỐI HỢP TỪ CÁC DƯỢC LIỆU XẠ CAN, BỌ MẮM VÀ DÂU TẰM
Nguyễn Thị Dịu Hiền*, Nguyễn Thị Ngọc Đan**, Lâm Bích Thảo**, Trần Công Luận**,
Dương Thị Mộng Ngọc**, Lã Văn Kính***
TÓM TẮT
Mục tiêu: Xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm chế phẩm thuốc bột phối hợp từ các dược liệu Xạ can, Bọ mắm
và Dâu tằm
Phương pháp: Định tính các hợp chất saponin, alkaloid, flavonoid và rutin bằng phản ứng hoá học và sắc ký
lớp mỏng Định lượng flavonoid toàn phần tính theo rutin trong chế phẩm bằng phương pháp quang phổ tử ngoại khả kiến
Kết quả: Đã xây dựng được tiêu chuẩn kiểm nghiệm chế phẩm thuốc bột phối hợp từ các dược liệu Xạ can,
Bọ mắm và Dâu tằm Xác định sự hiện diện của 3 nhóm hợp chất là flavonoid, saponin, alkaloid Trên hình ảnh sắc ký đồ của chế phẩm cho thấy có sự hiện diện của cả 3 loại dược liệu và hoạt chất rutin Hàm lượng flavonoid toàn phần tính theo rutin trong chế phẩm là 0,088%
Kết luận: Phương pháp phân tích đáng tin cậy, đơn giản nên có thể ứng dụng vào công tác kiểm tra đánh
giá chất lượng chế phẩm cũng như giúp ích cho việc ổn định quy trình sản xuất
Từ khoá: Xạ can, Bọ mắm, Dâu tằm, rutin, sắc ký lớp mỏng, quang phổ tử ngoại khả kiến
ABSTRACT
THE STANDARDIZATION OF THE POWDER PREPARATION FROM SOME MEDICINAL PLANTS:
BELAMCANDA CHINENSIS, POUZOLZIA ZEYLANICA AND MORUS ALBA
Nguyen Thi Diu Hien, Nguyen Thi Ngoc Dan, Lam Bich Thao, Tran Cong Luan,
Duong Thi Mong Ngoc, La Van Kinh
* Y Hoc TP Ho Chi Minh * Vol 18 - Supplement of No 1 – 2014: 216 - 221
Objectives: The aim of this study to develop the standardization for anlyzing the powder preparation from
some medicinal plants: Belamcanda chinensis, Pouzolzia zeylanica and Morus alba
Methods: Chemical reactions and Thin Layer Chromatography (TLC) were used to identify the presence of
saponins, alkaloids, flavonoids and rutin in the powder preparation Quantitative determination of total flavonoid expressed in rutin by UV spectrophotometric method
Results: The testing standardization of the powder preparation were establised The presence of saponins,
alkaloids, flavonoids were determined by chemical reactions TLC showed the presence of the medicinal plants and rutin in the preparation Total flavonoid content expressed in rutin was determined to be 0.088%
Conclusions: The preparation have been standardized for stabilizing the producing process as well as the
quality of product The analytical method was proven to be reliable This result is used to further study
Keywords: Belamcanda chinensis, Pouzolzia zeylanica, Morus alba, rutin, TLC, UV spectrophotometric
∗
Trường Đại Học Nông Lâm TP HCM ∗∗ Trung Tâm Sâm & Dược Liệu TP HCM
∗∗∗
Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp Miền Nam
Tác giả liên lạc: PGS.TS Lã Văn Kính ĐT: 0913916201 email: lakinh@hcmgmail.com
Trang 2ĐẶT VẤN ĐỀ
Ngày nay, cùng với sự phát triển của y học
cổ truyền, các loại thuốc có nguồn gốc từ thiên
nhiên đang được nghiên cứu và đưa vào sản
xuất rất nhiều Những loại thuốc này tốt cho sức
khỏe người sử dụng, ít tác dụng phụ hơn các
thuốc có nguồn gốc tổng hợp hóa học Từ xa xưa,
Xạ can được coi là một vị thuốc quý chữa các
bệnh về họng, viêm amidan có mủ, ho nhiều
đờm, khản tiếng Lá Dâu tằm có vị đắng, ngọt,
tính hàn, có tác dụng chữa cảm mạo, phong
nhiệt, sốt nóng, ho, viêm họng Bọ mắm chữa
viêm họng, ho lâu ngày, bệnh về phổi Nhằm
góp phần cho cho sự phát triển các loại thuốc có
nguồn gốc từ thiên nhiên, chế phẩm thuốc bột
phối hợp từ các dược liệu Xạ can, Bọ mắm và
Dâu tằm để điều trị các bệnh về hô hấp đang
được tiến hành nghiên cứu Trong nghiên cứu
này, chúng tôi áp dụng các phương pháp lý hóa
để khảo sát độ ẩm, định tính các nhóm hoạt chất
chủ yếu có trong chế phẩm Áp dụng phương
pháp sắc ký lớp mỏng để xác định sự hiện diện
của các dược liệu trong thành phần chế phẩm
Đồng thời, áp dụng phương pháp quang phổ để
xác định hàm lượng flavonoid toàn phần tính
theo rutin Từ đó, góp phần tiêu chuẩn hóa và
kiểm nghiệm chất lượng chế phẩm trong các
nghiên cứu triển khai tiến tới giới thiệu một sản
phẩm mới cho cộng đồng
ĐỐI TƯỢNG – PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Nguyên liệu
Chế phẩm thuốc bột được bào chế bởi Bộ
môn Hoá – chế phẩm – Trung tâm Sâm và dược
liệu Tp HCM Thành phần gồm cao Xạ can
(4,75%), cao Bọ mắm (3,55%), cao Dâu tằm (2,8%)
và tá dược làm dạng bột (88,90%)
Phương tiện
Hóa chất: methanol (TQ); anhydric acetic
(Merck); diethyl ether (TQ): ethyl acetate (TQ);
cloroform (TQ); toluene (TQ), rutin chuẩn
(Sigma - Aldrich, độ tinh khiết ≥ 95%)
Dụng cụ: Máy siêu âm (εlma, LC60H); tủ sấy;
bể cách thủy; bình sắc ký; cân có độ chính xác 0,1mg (Mettler Tolerdo, AB204); máy quang phổ
tử ngoại khả kiến (Thermo Spectronic - Heλios γ)
Phương pháp khảo sát độ ẩm, độ mịn, độ đồng đều khối lượng (1)
Khảo sát độ ẩm (mất khối lượng do sấy khô) theo DĐVN IV, phụ lục 9.6, trang PL-182: Cân 1g chế phẩm, sấy ở 1050C đến khối lượng không đổi Lặp lại thí nghiệm 3 lần
Khảo sát độ mịn theo DĐVN IV, phụ lục 3.5, trang PL-110
Khảo sát độ đồng đều khối lượng theo DĐVN
IV, phụ lục 11.3, trang PL-221, thực hiện với 20 gói, lấy ngẫu nhiên
Định tính bằng phương pháp hóa học (2,4)
Thực hiện các phản ứng hóa học để xác định
sự hiện diện của các hợp chất alkaloid, flavonoid, saponin trong chế phẩm
Hợp chất alkaloid: Dùng dịch chiết H2SO4 5% của 5g bột chế phẩm, chiết siêu âm 15 phút với
H2SO4 5% (3 lần x 5ml), làm các phản ứng màu với thuốc thử (TT) đặc trưng của hợp chất alkaloid (Mayer, Bouchardat, Dragendroff)
Hợp chất flavonoid: Dùng dịch chiết methanol của 3g chế phẩm, chiết siêu âm 15 phút với 20ml MeOH, lọc Dịch lọc được cô đến cắn Hoà cắn với 15ml ethanol, siêu âm cho tan hết cắn, lọc, làm các phản ứng với thuốc thử (TT) đặc trưng của hợp chất flavonoid (NaOH 10%, FeCl3 10%, chì acetat 5%, Mg/HCl đđ)
Hợp chất saponin: Cân khoảng 3g bột chế phẩm, thêm 30ml ethanol 70%, đun cách thủy 30 phút, lọc Dịch lọc chia làm hai phần:
Phần 1: Cô dịch lọc đến cắn Hòa cắn với 5ml nước nóng, lọc vào ống nghiệm Pha loãng với nước cất cho đủ khoảng 10ml, lắc dọc theo chiều thẳng đứng của ống nghiệm
Trang 3Phần 2: dịch lọc cô đến cắn Hòa cắn với
0,5ml anhydric acetic, 1ml cloroform và cho vào
ống nghiệm, cho từ từ vào ống nghiệm H2SO4 đđ
(phản ứng Lieberman)
Định tính bằng phương pháp sắc ký lớp
mỏng
Dung dịch mẫu thử Bọ mắm
Cân khoảng 20g nguyên liệu và 100g chế
phẩm, cho vào cốc có mỏ 250ml, chiết siêu âm
với cồn 96% đến khi dịch chiết hết màu, tiếp tục
chiết siêu âm bã nguyên liệu lần lượt với cồn
72% và cồn 48% đến khi kiệt Tập trung toàn bộ
dịch chiết được, lọc và cô giảm áp thu hồi dung
môi đến cắn Cắn hòa với 50ml nước cất, siêu âm
cho tan cắn Dịch nước được lắc với ether ethylic
đến khi dịch ether hết màu Tập trung dịch ether
cô còn 2ml làm dung dịch chấm sắc ký
Dung dịch mẫu thử Dâu tằm, Xạ can và hoạt
chất rutin
Cân khoảng 20g nguyên liệu và 100g chế
phẩm, cho vào cốc có mỏ 250ml, chiết siêu âm
với cồn 96% đến khi dịch chiết hết màu, tiếp
tục chiết siêu âm bã nguyên liệu lần lượt với
cồn 72% và cồn 48% đến khi kiệt Tập trung
toàn bộ dịch chiết được, lọc và cô giảm áp thu
hồi dung môi đến cắn Cắn hòa với 50ml nước
cất, siêu âm cho tan cắn Dịch nước được lắc
với ether ethylic đến khi dịch ether hết màu,
loại dịch ether Dịch nước được lắc tiếp với
chloroform, loại dịch chloroform Dịch nước
được lắc tiếp với ethyl acetat Tập trung dịch
ethyl acetat cô còn 2ml làm dung dịch chấm
sắc ký của nguyên liệu
Dung dịch chuẩn rutin
Hoà tan rutin chuẩn trong methanol để được
dung dịch 1mg/ml
Điều kiện sắc ký
Bản mỏng nhôm Silicagel 60F254 (dày 0,25
mm, 20 x 20 cm) Merck, Germany
Hệ dung môi khai triển
Toluene - Ethyl acetate (7:3) để xác định sự
hiện diện của Xạ can, Dâu tằm, Bọ mắm
Ethyl acetate – acid formic – acid acetic – nước (100:11:11:26) để xác định sự hiện diện của hoạt chất rutin
Thể tích chấm : 20µl dd nguyên liệu, 10µl dd chế phẩm và 10µl dd chuẩn
Phát hiện
Soi UV 254nm, UV 365nm và thuốc thử FeCl3
5% trong cồn để phát hiện Xạ Can, rutin
Soi UV 365nm và thuốc thử Anisaldehyd để phát hiện Dâu tằm, Bọ mắm
Định lượng flavonoid toàn phần tính theo rutin trong chế phẩm bằng phương pháp quang phổ tử ngoại khả kiến (4)
Thuốc thử
AlCl3 5% trong methanol 70%
Mẫu thử
Cân chính xác 10g chế phẩm cho vào bình soxhlet Thêm 250ml ether dầu, chiết đến khi dịch chiết không còn màu Để nguội và gạn bỏ dịch ether Bột chế phẩm trong bình Soxhlet được chiết tiếp tục với 250ml methanol 70%, cho đến khi dịch chiết không còn màu Dịch chiết methanol 70% được chuyển vào bình định mức 250ml, bổ sung methanol 70% vừa đủ đến vạch, lắc đều, thu dung dịch A Lấy chính xác 1 ml dung dịch A bằng micropipet, cho vào ống nghiệm có nắp vặn, thêm chính xác 4ml methanol 70% và 75µl dung dịch AlCl3 5% trong methanol 70%, lắc đều (tiến hành 3 mẫu thử tương tự để lấy giá trị trung bình)
Mẫu trắng thử
Lấy chính xác 1ml dung dịch A cho vào ống nghiệm có nút vặn, thêm chính xác 4,075ml methanol 70%, lắc đều
Mẫu chuẩn
Thêm chính xác vào ống nghiệm chứa 50 µg chuẩn rutin 5ml methanol 70% và 75µl dung dịch AlCl3 5% trong methanol 70%, lắc đều
Trang 4Tất cả các mẫu đều để ở nhiệt độ phòng
lạnh, đậy kín ống nghiệm, sau 30 phút tiến
hành đo, thỉnh thoảng lắc nhẹ cho phản ứng
xảy ra hoàn toàn
Tiến hành đo độ hấp thu các mẫu ở đỉnh hấp
thu cực đại λmax = 425nm, dùng methanol 70%
làm mẫu trắng để chỉnh máy về 0
Hàm lượng flavonoid toàn phần tính theo
rutin có trong chế phẩm được tính theo công
thức sau:
m d m A
A
A
c
t
t
4 '
10
250× −
×
×
×
−
=
Trong đó: At : Độ hấp thu mẫu thử A’t: Độ
hấp thu mẫu trắng thử Ac : Độ hấp thu mẫu
chuẩn mc : Khối lượng chất chuẩn (µg) d: Độ
tinh khiết của chất chuẩn (95%) m : Khối lượng
chế phẩm cần định lượng đã trừ ẩm(g)
KẾT QUẢ
Độ ẩm, độ đồng đều khối lượng của chế
phẩm dạng bột
Bảng 1 Độ ẩm, độ đồng đều khối lượng của chế phẩm
Yêu cầu phải đạt
Độ đồng đều
Độ ẩm của chế phẩm là 5,414% đạt yêu cầu
về độ ẩm của thuốc bột theo quy định của Dược
điển Việt Nam IV
Khối lượng bột thuốc trong mỗi gói trung
bình là 20,166 g, nằm trong giới hạn cho phép
(18,654 ≤ khối lượng trung bình ≤ 21,678), đạt yêu
cầu về độ đồng đều khối lượng theo quy định
của Dược điển Việt Nam IV
Chế phẩm là dạng bột mịn (180/125) theo
quy định của Dược điển Việt Nam IV
Định tính bằng phương pháp hóa học
Bảng 2 Kết quả định tính các hợp chất có trong viên
nang BKHH bằng phương pháp hóa học
Alkaloid
Xuất hiện tủa cam với thuốc thử
Xuất hiện tủa đỏ nâu với thuốc thử
Flavonoid
Dung dịch tăng màu với thuốc thử
Dung dịch có màu xanh rêu với thuốc
Dung dịch có tủa trắng với thuốc thử
Trong chế phẩm có sự hiện diện của các hợp chất alkaloid, flavonoid, saponin
Định tính bằng sắc ký lớp mỏng
Sắc ký đồ của chế phấm với các nguyên liệu đối chiếu
Toluene : Ethyl acetate (7: 3)
Chế phẩm
Xạ can
Chế phẩm
Xạ can
Chế phẩm
Xạ can
trong cồn và quan sát dưới ánh sáng thường Toluene : Ethyl acetate (7: 3)
Chế phẩm
Bọ mắm
Chế phẩm
Bọ mắm
Chế phẩm
Bọ mắm
Trang 5Dâu tằm
Chế phẩm
Dâu tằm Chế phẩm
Dâu tằm Chế phẩm
Anisaldehyd và quan sát dưới ánh sáng thường
Phun TT Anisaldehyd và soi UV365nm
Qua kỹ thuật phân tích bằng sắc ký lớp mỏng đã chứng minh trong chế phẩm có sự hiện diện của cả 3 dược liệu Đặc biệt, trên hình ảnh sắc ký đồ cho thấy trong chế phẩm
có một vết cùng giá trị Rf và màu sắc với hoạt chất rutin
Sắc ký đồ của chế phẩm với hoạt chất rutin
Ethyl acetate – acid acetic – acid formic – nước (100 : 11 : 11 : 26)
Chế phẩm
Rutin
Chế phẩm Rutin
Chế phẩm Rutin
Chế phẩm Rutin Quan sát dưới ánh sáng
thường
quan sát dưới ánh sáng thường
Định lượng flavonoid toàn phần tính theo
rutin trong chế phẩm bằng phương pháp
quang phổ tử ngoại khả kiến
Bảng 3 Hàm lượng flavonoid toàn phần tính theo
rutin
Khối lượng
chế phẩm đã
trừ ẩm (g)
Hàm lượng flavonoid toàn phần tính theo rutin (%)
Hàm lượng flavonoid toàn phần tính theo
rutin trong chế phấm là 0,088%
Từ những kết quả thực nghiệm trên, chúng tôi đề nghị một số tiêu chuẩn chất lượng cho chế phẩm thuốc bột (bảng 4) như sau
Bảng 4 Đề xuất tiêu chuẩn chất lượng chế phẩm
khô
Không quá 9%
4 Định tính bằng phương pháp hóa học
Phản ứng với các thuốc thử của hợp chất flavonoid Phản ứng với các thuốc thử của hợp chất alkaloid Phản ứng với các thuốc thử của hợp chất saponin
Trang 6Tiêu chuẩn Yêu cầu
5 Định tính bằng sắc ký lớp
mỏng
Các sắc ký đồ của chế phẩm phải có các vết tương ứng với các vết của dược liệu chuẩn:
Bọ mắm, Xạ can, Dâu tằm và vết của rutin
6 Định lượng bằng phương
pháp quang phổ tử ngoại
Hàm lượng flavonoid toàn phần tính theo rutin 0,075% -
0,10%
KẾT LUẬN
Từ những kết quả thu được từ thực nghiệm,
chúng tôi có một số kết luận sau:
- Chế phẩm đạt các yêu cầu về độ ẩm, độ
mịn, độ đồng đều khối lượng theo các quy định
của Dược điển Việt Nam IV
- Chế phẩm có các hợp chất alkaloid,
flavonoid, saponin
- Chế phẩm có sự hiện diện của 3 dược liệu:
Bọ mắm, Xạ can, Dâu tằm
- Hàm lượng flavonoid toàn phần tính theo
rutin trong chế phẩm trung bình là 0,088%
Những kết quả thu được từ nghiên cứu này
góp phần cho việc tiêu chuẩn hóa và kiểm
nghiệm tiêu chuẩn chất lượng chế phẩm, phục
vụ cho các nghiên cứu triển khai tiếp theo và có triển vọng đóng góp với cộng đồng một lựa chọn mới trong điều trị bệnh hô hấp
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1 Bộ Y tế (2009) Dược điển Việt Nam IV, NXB Y học, tr PL110, 182,
221
2 Pereira C B, Marin A, Tiago D T Maki, Raquel M M.Necchi,
Melania Palermo Manfron (2011) Physicochemical quality control
and dosage of total polyphenols,flavonoids of Morus alba Leaves
pp 5768
3 Trần Hùng (2006) Giáo trình phương pháp nghiên cứu dược liệu
Đại học Y dược TP HCM
4 Viện Dược liệu (2004) Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam,
Tập II NXB Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội, tr 219 - 220 (I), 613 – 618 (I),1095 - 1098 (II)
Ngày nhận bài báo: 3/10/2013 Ngày phản biện nhận xét bài báo: 15/10/2013,
17/10/2013 Ngày bài báo được đăng: 02/01/2013