Đề tài được tiến hành để nghiên cứu chiết xuất và phân lập lycorin trong lá Náng hoa trắng làm chất chuẩn đối chiếu cho nghiên cứu định tính và định lượng lycorin trong dược liệu và chế phẩm chứa lycorin.
Trang 1Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011
NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP LYCORIN TỪ NÁNG HOA TRẮNG
(CRINUM ASIATICUM ROXB AMARYLLIDACEAE)
LÀM CHẤT CHUẨN ĐỐI CHIẾU TRONG KIỂM NGHIỆM
Nguyễn Ngọc Quỳnh**, Nguyễn Hữu Phúc**, Trần Hùng*
TÓM TẮT
Mục tiêu: Nghiên cứu chiết xuất và phân lập lycorin trong lá Náng hoa trắng làm chất chuẩn đối chiếu cho
nghiên cứu định tính và định lượng lycorin trong dược liệu và chế phẩm chứa lycorin
Phương pháp: Dược liệu được chiết bằng phương pháp ngấm kiệt với cồn 95% và bốc hơi dưới áp suất
giảm thu được cao chiết Cao chiết được chiết phân bố lỏng – lỏng với các dung môi có độ phân cực khác nhau thu được các cao phân đoạn Các phân đoạn được tách và lập các chất tinh khiết bằng phương pháp sắc ký cột cổ điển Chất tinh khiết được tinh chế bằng phương pháp kết tinh lại Chất phân lập được, được xác định cấu trúc bằng các kỹ thuật phổ NMR và MS Độ tinh khiết của lycorin được đánh giá bằng HPLC với detector UV
Kết quả: Đã phân lập được 3,5 g hợp chất tinh khiết, xác định cấu trúc là lycorin và kiểm tra độ tinh khiết
đạt 99 %
Kết luận: Đã phân lập được lycorin với độ tinh khiết có thể dùng làm chất chuẩn đối chiếu trong kiểm
nghiệm dược liệu và chế phẩm có chứa lycorin
Từ khóa: Náng hoa trắng, Crinum asiaticum, lycorin, phân lập, cấu trúc, HPLC-PDA
ABSTRACT
ISOLATION OF LYCORINE FROM CRINUM ASIATICUM ROXB AMARYLLIDACEAE – ORIENT AS
REFERENCE SUBSTANCE
Nguyen Ngoc Quynh, Nguyen Huu Phuc, Tran Hung
* Y Hoc TP Ho Chi Minh * Vol 15 - Supplement of No 1 - 2011: 602 - 605
Objectives: Extraction and isolation study of lycorine from Crinum asiaticum leaves for using as reference
standard for quality control of herbs and lycorine-containing preparations
Methods: leaves powder of Crinum asiaticum was percolated with 95% alcohol, percolate obtained was
evaporated under reduced pressure to give a liquid extract The extract was fractionated by distribution with solvents The fractions were then chromatographed on silica gel 60 (0.40 – 0.063 mm) Lycorine was isolated,
purified and elucidated by NMR spectra The purity of lycorine was determined by HPLC-PDA
Results: 3 fractions (Q1, Q2, Q3) were obtained from alcoholic extract of Crinum asiaticum leaves Lycorine (3.5 g) was isolated from fraction Q3 and its purity was detemined as pure as 99 %
Conclusions: Lycorine was isolated with the purity suitable for using as reference standard for quality control of herbs and lycorine-containing preparations
Key words: Crinum asiaticum, lycorine, isolation, structure, HPLC-PDA
ĐẶT VẤN ĐỀ
Náng hoa trắng được sử dụng trong y học cổ
truyền và dân gian của Việt nam và một số nước
đông và Đông nam Á, để điều trị các viêm khớp
và dùng làm thuốc kháng khuẩn(4,5) Náng hoa trắng được biết như một cây thuốc chứa nhiều alkaloid và một số alkaloid trong nhóm này có
Trang 2Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Nghiên cứu Y học
tác dụng kháng viêm, kháng khối u, và cải thiện
trí nhớ tuổi già, tác dụng này được y học hiện
đại quan tâm đặc biệt(1,2,3,4) Đề tài được thực hiện
với mục đích phân lập lycorin để sử dụng làm
chất chuẩn đối chiếu cho việc xây dựng phương
pháp kiểm nghiệm dược liệu, các chế phẩm
chứa lycorin và các nghiên cứu về tác dụng sinh
học của lycorin sau này
NGUYÊN LIỆU - PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU
Nguyên liệu
Đối tượng là cây Náng hoa trắng được thu
hái tại Tp Cần Thơ (tháng 6/2008) Mẫu được
định danh và lưu mẫu tại Bộ môn Dược liệu,
Khoa Dược, Đại học Y Dược TPHCM
Phương pháp nghiên cứu
Dược liệu được chiết bằng phương pháp
ngấm kiệt với dung môi là cồn 95%.Cao chiết
được tách thành các phân đoạn đơn giản hơn
bằng cách chiết phân bố lỏng – lỏng Sau đó các
phân đoạn được tách và phân lập các hợp chất
bằng phương pháp sắc ký cột cổ điển, chất tinh
khiết được tinh chế bằng phương pháp kết tinh
lại Cấu trúc của chất phân lập đã được xác định
bằng phổ MS thực hiện trên máy Quattro Micro
API, phổ NMR với máy Bruker Avance 500 sử
dụng CDCl3 Chất phân lập được kiểm tra độ
tinh khiết bằng sắc ký lỏng áp sất cao, thực hiện
trên máy HPLC Hitachi L – 2000
EZChrom Elite, đầu dò UV – Vis, với các
điều kiện sắc ký như sau:
Cột sắc ký: LiChro Cart RP C18 (250 mm x
4,6 mm, 5μm)
Pha động: Ammonium acetat 1% (kl/tt) pH
8,0 – Acetonitril (90: 10)
Tốc độ dòng: 1,5ml/phút
Thể tích tiêm mẫu: 20μl
Bước sóng phát hiện: 290nm
Nhiệt độ phân tích: nhiệt độ phòng
Thời gian phân tích: 18 phút
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN Chiết tách các hợp chất trong Náng hoa trắng
Bột dược liệu khô (12 kg) được làm ẩm bằng cồn 95% trong khoảng 1 giờ, vào bình ngấm kiệt, sau đó thêm dung môi ngập mặt dược liệu khoảng 2-3 cm Ngâm trong 24 giờ, rút dịch chiết cho đến khi kiểm tra trên giấy lọc không cho vết vàng cam với thuốc thử Dragendorff Dịch chiết được cô thu hồi dung môi thu được cao lỏng và được thêm đồng lượng nước Chiết phân bố lỏng – lỏng cao chiết này lần lượt bằng n-hexan và sau đó là chloroform thu được các cao tương ứng là Q1 (20 g), Q2 (15g) Dịch chiết sau khi chiết với CHCl3 đượckiềm hóa bằng
NH4OH đđ đến pH 10 và chiết tiếp bằng CHCl3 cất thu hồi dung môi thuđược 23 g cao chiết Q3
Phân lập lycorin từ Q3
23 g cao Q3 được nhồi lên cột (40 × 5 cm) với 120g Silica gel (0,040-0,063mm), triển khai sắc ký với hệ dung môi chloroform và chloroform – methanol với lượng methanol tăng dần
Kết quả là đã thu được 11 phân đoạn, trong
đó phân đoạn VLC-01.6 thu được có hàm lượng chất E cao nhất VLC-01.6 thu được được để kết tinh phân đoạn và sau đó tinh chế bằng cách kết tinh lại nhiều lần trong hỗn hợp dung môi CHCl3–MeOH (1:1) ở 5oC Lọc lấy tinh thể và rửa lại nhiều lần bằng MeOH thu được tinh thể alkaloid E không màu, hình khối nhỏ (3,5 g) Alkaloid E thu được được kiểm tra bằng sắc
ký lớp mỏng trên nhiều hệ dung môi, phát hiện bằng đèn UV 365-254 và thuốc thử Dragendorff
E chỉ cho 1 vết duy nhất trên các sắc ký đồ
Xác định cấu trúc hợp chất E
E là chất kết tinh ở dạng tinh thể hình khối, không màu, có độ phân cực trung bình, tan tốt trong dung môi DMSO, cho phản ứng đặc trưng của alkaloid Cấu trúc của M được xác định chủ yếu bởi các dữ liệu phổ MS và cộng hưởng từ hạt nhân
Trang 3Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011
Các dữ liệu phổ NMR cho thấy E có 16
carbon cho các tín hiệu phổ từ 20 ppm – 150 ppm
Trong đó có 5 carbon bậc IV, 7 carbon bậc III, 4
carbon bậc II và không có carbon bậc 1
Tất cả 5 carbon bậc IV của E đều chuyển
dịch ở vùng trường thấp (δ C từ 120 – 150 ppm)
đặc trưng của các carbon lai hóa sp 2 Trong số
này có 2 carbon mang nhóm thế oxy (δ C 145,59
và 145,15 ppm)
Trong số 7 Carbon bậc III, có 3 carbon lai
hóa sp 2 của nối đôi trong đó có 2 carbon của
vòng thơm [δ C 106,94 d; δ H 6,68 (1H, s) và
104,99 d; δ H 6,82 (1H, s) ppm] và 1 của nối đôi
ngoài vòng thơm [δ C 118,41 d; δ H 5,38 (1H, s)
ppm] và 2 carbon sp 3 mang nhóm thế oxy (δ C
71,68 và 70,17 ppm)
Trong số 4 carbon bậc 2 của E, có một carbon
chuyển dịch ở vùng trường thấp (δ C 100,49 ppm)
đặc trưng của nhóm methylendioxy
Phổ khối ESI-MS positive cho biết khối
lượng phân tử của E là 287 E có số khối lẻ
chứng tỏ có số lẻ nguyên tử nitơ trong phân tử,
tương ứng với công thức nguyên là C16H17NO4
Độ bất bão hòa của phân tử tính được là 9 Với
các đặc điểm như trên, có thể dự đoán E là một
alkaloid có một nitơ, 1 vòng thơm, một nối đôi
ngoài vòng, 1 nhóm methylendioxy, 2 nhóm
OH tự do và 5 vòng trong đó có 1 vòng 5 mang
nhóm methylendioxy với kiểu cấu trúc của
lycorin
Cấu trúc của E được xác định là lycorin bởi
các dữ liệu phổ NMR và được xác nhận bởi so
sánh với dữ liệu chuyển dịch hóa học của
lycorin báo cáo trong tài liệu(1) Cấu trúc và các
tương tác tìm được trong phổ COSY và HMBC
của E được trinh bày ở Hình 2 Chuyển dịch hóa
học của proton và carbon của E, so sánh với
lycorin được trình bày ở Bảng 1
N O
O
O
H
H H
H
H
H
H
H H
H
H
1 2 3
4 11
12 5 6
9
8 10
7 6a 10a 10b 4a
3,34 2,22
3,21
2,46 2,46 28,07 141,68
2,63
106,94
145,59
104,99
129,60
145,48 129,70
6,82 4,29
40,15 70,16
2,52 56,65
53,24
5,38 118,41
60,72 71,67 3,99
5,95 5,95
4,85 4,75
Hình 2 Tương tác H và C trong cấu trúc chất E Bảng 1 So sánh độ dịch chuyển hóa học chất E và
lycorin
E Lycorin (1)
C
δC δH ppm δC δH ppm
6 56,65 t 4,02 (1H, d); 3,34 (1H, d) 56,73 t 3,32 (1H, d); 4,02 (1H, d)
12 53,24 t 3,21 (1H, t); 2,22 (1H, q) 5,31 t 3,18 (1H, t); 2,19 (1H, q)
Kiểm tra độ tinh khiết lycorin phân lập được
Lycorin phân lập được được xác định độ tinh khiết sắc ký trên hệ thống sắc ký lỏng cao
áp với Detector PDA Kết quả sắc ký cho thấy lycorin phân lập được chỉ cho một đỉnh chính trên sắc ký đồ với độ tinh khiết tương ứng là 99
% Kết quả được thể hiện ở Hình 3 Với độ tinh
Tương tác H-H trong COSY Tương tác H-C trong HMBC
Trang 4Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Nghiên cứu Y học
chuẩn trong các nghiên cứu xây dựng phương
pháp định tính và định lượng lycorin trong
dược liệu và chế phẩm có lycorin
Minutes
0
10
20
30
40
50
60
0 10 20 30 40 50 60
UV-VIS
Retention Time
Name
Hình 3 Sắc ký đồ lycorin nồng độ 100μg/ml bằng
HPLC nồng độ 100μg/ml
KẾT LUẬN
Đề tài đã phân lập được lycorin từ cây Náng
hoa trắng với 1 lượng lớn (3,5g) Cấu trúc của
lycorin được xác nhận bằng các phương pháp
phân tích phổ hiện đại NMR, MS Với độ tinh khiết 99% (HPLC-PDA), lycorin thu được có thể làm chất chuẩn sử dụng trong kiểm nghiệm dược liệu và các chế phẩm có lycorin Phương pháp định lượng lycorin trong dược liệu bằng HPLC sẽ được báo cáo ở bài báo sau
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1 Hitwrayawljid K., Indyk C., Ebyuncghai A.H., Pezzuto J.M.,
Cordel G.A (1993), Cytotoxic and antimalarial alkaloid from bulbs
of Crinum amabile, J Nat Prod., 56(8), 1331-38
2 Manske R.H.F (1975), Amaryllidaceae alkaloids, The alkaloids
chemistry and physiology, XV, Academic Press, 83-164
3 Satoru Yui, Masaaki Mikami, Mikio Kitahara, Masatoshi Yamazaki (1998), “The inhibitory effect of Lycorine on tumor cell apoptosis induced by polymorphonuclear
leukocyte-derived calprotectin”, Immunopharmacology, 42, 151-162
4 Tram N T N., Tz.V Titorenkova, V.St Bankova, N.V Handjieva, S.S Popov (2002 ), “Crinum L Amaryllidaceae”,
Fitoterapia 73, 183-208
5. Võ văn Chi (2004), Từ điển thực vật thông dụng, Tập 1, NXB
Khoa học và Kỹ thuật Hà Nội, trang 265