Bài viết nghiên cứu quy trình công nghệ chiết tách hoạt chất sinh học từ lá của cây Thông đỏ và cây Dừa cạn Việt Nam phục vụ sản xuất thuốc chống ung thư và xuất khẩu. Thuộc Chương trình Khoa học Công nghệ trọng điểm cấp Nhà nước.
Trang 116
NGHIấN CỨU QUY TRèNH CHIẾT XUẤT, TINH CHẾ 10-DEACETYL
BACCATIN III, TAXOL VÀ CÁC TAXOID KHÁC TỪ THễNG ĐỎ
LÁ DÀI (TAXUS WALLICHIANA ZUCC) TRỒNG Ở ĐÀ LẠT
TRấN QUY Mễ PILOT
Tr ần Cụng Luận*; Bựi Thế Vinh*; Vương Chớ Hựng**; Nguyễn Tiến Hựng**
TểM TẮT
Xây dựng quy trỡnh chiết xuất, tinh chế cỏc taxoid từ lỏ Thụng đỏ bằng cỏc kỹ thuật chiết ngấm kiệt, sắc ký trao đổi diaion HP-20, sắc ký cột silica gel pha thường Phương phỏp đơn giản, hiệu quả 10-deacetyl baccatin III (10-DAB) và cỏc taxoid khỏc thu được cú độ tinh sạch cao, hiệu suất thu nhận đỏng kể (10-DAB là 0,072% và taxol là 0,0014%) Quy trỡnh này cú thể ỏp dụng ở quy mụ lớn (25 kg nguyờn liệu/mẻ) để sản xuất 10-DAB, taxol và cỏc taxoid khỏc từ nguyờn liệu lỏ Thụng đỏ trồng ở Lõm Đồng
* Từ khoỏ: 10-deacetyl baccatin III; Taxol; Taxoid; Thụng đỏ lỏ dài
PROCESS OF extraction AND PURIFICATION OF 10-DEACETYL BACCATIN III AND TAXOL OF TAXUS WALLICHIANA CULTIVATED IN LAMDONG PROVINCE
SUMMARY
The process for isolation of taxoids from Taxus wallichiana Zucc was developed by the effective and simple technique as diaion HP-20 ion exchange and silica gel normal phase chromatography By using general extraction and chromatography method, 10-deacetyl baccatin III (10-DAB) and related taxoid were isolated with the high purity and remarkable yield (0,072 % for 10-DAB and 0,0014 % for taxol) This process can be applied for large-scale to produce 10-deacetyl baccatin III and tatxol as well as the other derivatives from the leaf of Taxus wallichiana cultivated in Lamdong province
* Key words: Taxus wallichiana; Taxol; Taxuspine F; Baccatin III; Baccatin III derivatives
ĐẶT VẤN ĐỀ
Paclitaxel (taxol), một loại thuốc chữa
ung thư đang hiện hành, được phõn lập
đầu tiờn từ cõy Thụng đỏ Thỏi Bỡnh Dương
(Taxus brevifolia Nutt) Năm 1969, Wani và
CS đó xỏc định cấu trỳc lập thể (1971) và
được ứng dụng trong lõm sàng tại Mỹ,
Nhật, Phỏp để điều trị ung thư buồng trứng, ung thư vỳ, ung thư phổi Cục Quản lý Dược
và Thực phẩm Hoa Kỳ (FDA) cấp phộp sử dụng từ năm 1992 Hóng Bristol-Myers Squibb (BMS) đó sớm cú hợp tỏc với Viện Ung thư Quốc gia (National Cancer Institute-NCI) để phỏt triển và thương mại húa taxol
* Cụng ty Dược Vimedimec
** Đại học Y-Dược TP HCM
Ng-ời phản hồi: (Corresponding): Trần Cụng Luận (congluan53@gmail.com)
Ngày nhận bài: 25/12/2013; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 14/1/2014
Trang 218
Mỹ và một số nước châu Âu đã thành công
trong việc sản xuất taxol (hợp chất trị bệnh
ung thư), nhưng lại chiết từ vỏ cây Thông
đỏ Công nghệ này làm cây nhanh lão hóa
và gây cạn kiệt nguồn cung cấp Do đó, xu
hướng hiện nay là chiết tách taxol, đồng
thời tận dụng các taxoid khác để bán tổng
hợp taxol ở cành, lá của các loài Thông đỏ
Ở nước ta, loài Thông đỏ lá dài (Taxus
nguyên liệu tiềm năng nhất để sản xuất
thuốc trị bệnh ung thư, vì các taxoid chính
có trong lá Thông đỏ có hàm lượng cao [2,
4, 7] Hiện trong nước vẫn chưa có nghiên
cứu nµo công bố về quy trình pilot thu nhận
taxoid từ Thông đỏ lá dài Báo cáo này
thông báo quy trình chiết tách, tinh chế các
taxoid trong Thông đỏ lá dài ở quy mô pilot
với mục tiêu cung cấp nguyên liệu taxol và
các tiền chất bán tổng hợp taxol cho sản
xuất thuốc điều trị ung thư Đây cũng là mét
phÇn kết quả của đề tài “Nghiên cứu quy
trình công nghệ chiết tách hoạt chất sinh
học từ lá của cây Thông đỏ và cây Dừa cạn
Việt Nam phục vụ sản xuất thuốc chống ung
thư và xuất khẩu Thuộc Chương trình Khoa
học Công nghệ trọng điểm cấp Nhà nước
NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU
1 Nguyên liệu
Nguyên liệu: lá và cành của cây Thông
đỏ lá dài được trồng ở Lâm Đồng do Trung
tâm Trồng và Chế biến cây thuốc Đà Lạt
cung cấp Nguyên liệu sau khi thu hái, rửa
sạch, phơi khô, xay thành bột và bảo quản
ở nhiệt độ phòng đến khi chiết xuất
2 Phương pháp nghiªn cøu
- Chiết xuất: làm ẩm bột nguyên liệu và
ngâm 24 giờ, chiết ngấm kiệt bằng MeOH
(tỷ lệ 1:6), thu được dịch chiết Cô giảm áp dịch chiết đến dạng cao sệt, thu được cao MeOH thô Dùng cao MeOH thô hòa với nước, lắc với dichloromethan, sau khi cô giảm áp dịch dichloromethan thu được cao
CH2Cl2 Nạp cao CH2Cl2 vào cột diaion
HP-20 (15 cm x 110 cm), rửa giải lần lượt với các dung môi: nước, MeOH 10%, MeOH 60%, MeOH 80%, MeOH 100%
- Phân lập các hợp chất:
+ Phân đoạn cột diaion HP-20 MeOH 60%: s¾c ký cét (SKC) silica gel phân đoạn MeOH 60% với hệ dung môi giải ly ete dầu hỏa-aceton có độ phân cực tăng dần, thu được 3 phân đoạn (III1 → 3) và một chất kết tinh T1. SKC silica gel phân đoạn III2 với hệ dung môi CHCl3-MeOH có độ phân cực tăng dần (100% CHCl3 → CHCl3-MeOH 100:5), thu được ba phân đoạn III2-1, III2-2, III2-3 Phân đoạn III2-2 có hai vết chính, tiếp tục tiến hành SKC silica gel pha đảo với hệ dung môi MeOH-H2O (40:60), phân lập được hai chất tinh sạch, ký hiệu là T2, T3
SKC silica gel phân đoạn III3 với hệ dung môi CHCl3-MeOH có độ phân cực tăng dần (100% CHCl3 → CHCl3-MeOH 95:5), thu được phân đoạn III3-1 (100% CHCl3), III3-2 và kết tinh màu trắng, ký hiệu T4
Phân đoạn III3-1 tiếp tục qua SKC silica gel với hệ dung môi giải ly ete dầu hỏa-aceton có độ phân cực tăng dần thu được mét kết tinh trắng tinh sạch, ký hiệu T5 + Phân đoạn cột diaion HP-20 MeOH 60%: SKC silica gel phân đoạn MeOH 100% với hệ dung môi giải ly ete dầu hỏa-aceton
có độ phân cực tăng dần thu được kết tinh hình kim trắng, ký hiệu T6
- Phương pháp phân tích: phổ IR đo trên máy IR FTIR 8201 (Shimadzu) Phổ 1
H, 13C NMR được đo trên máy Bruker AM500 FT-NMR và JEOL JNM GX-400, đo trong
Trang 319
CDCl3 vµ MeOD vớitetramethyl silan (TMS)
làm chất chuẩn nội Sắc ký lớp mỏng được
thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn silica
gel 60F254 (Merck) Hệ khai triển CHCl3
-MeOH Diaion HP-20 (Misubishi) và silica
gel 60 F254 (0,063-0,200 mm) (Merck) được
dùng trong SKC
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN
1 KÕt qu¶ chiÕt xuÊt vµ ph©n lËp
Chiết ngấm kiệt 25 kg bột nguyên liệu
Thông đỏ bằng MeOH (1:6), thu được khoảng
150 lít dịch chiết Sau khi cô giảm áp, thu được
8 kg cao MeOH
Hòa 1 lít nước vào 1 kg cao MeOH,
lắc phân đoạn với khoảng 12 lít CH2Cl2, cô
giảm áp dịch trích ly thu được 200 g cao
CH2Cl2
Nạp 200 g cao CH2Cl2 vào cột diaion
HP-20, rửa giải lần lượt bằng các dung môi
nước (30 lít), MeOH 10% (60 lít), MeOH
60% (150 lít), MeOH 80% (60 lít), MeOH
100% (60 lít)
Phân đoạn cột diaion HP-20 MeOH 60%
(42 g) thực hiện SKC hấp phụ trên silica gel
pha thường và pha đảo với nhiều hệ dung
môi giải ly có độ phân cực khác nhau, chúng
tôi đã phân lập được 4 chất, ký hiệu: chất T1
(500 mg; 0,012%), T2 (160 mg; 0,0038%),
T3 (50 mg; 0,0012%), T4 (3 g; 0,072%) và T5
(93 mg; 0,0022%)
Phân đoạn cột diaion HP-20 MeOH 100%
(45 g), thực hiện SKC hấp phụ trên silica gel
pha thường thu được T6 (60 mg; 0,0014%)
2 Kết quả xác định cấu trúc hóa học
các chất chiết đƣợc
- Chất T1
+ Được phân lập dưới dạng bột màu
trắng, kém tan trong MeOH, tan trong hệ
dung môi CHCl3-MeOH, sắc ký lớp mỏng
bằng hệ dung môi CHCl3-MeOH (9:1) cho
vết tắt quang ở bước sóng UV 254 nm
Hiện hình bằng H2SO4 10%/EtOH, xuất
hiện vết tròn màu hồng nhạt với Rf = 0,48
Hiệu suất thu nhận là 0,012% Dựa vào phổ
NMR 1 chiều và 2 chiều, đối chiếu tài liệu tham khảo [9] nhận định T1 là taxuspine F
+ Phổ 1H NMR cho các tín hiệu cộng hưởng H [1,74 (3H, s, 16-Me); 1,12 (3H, s, 17-Me); 2,31 (3H, s, 18-Me) và 0,97 (3H, s,
19-Me)]; H [2,05 (3H, s, 2-OAc), 2,05 (3H, s, 7-OAc), 2,06 (3H, s, 9-OAc) và 2,01 (3H, s, 10-OAc)], proton oxymetin H [5,60 (1H, m, H-2); 4,20 (1H, m, H-5), 5,53 (1H, m, H-7), 5,91 (1H, d, H-9) và 6,26 (1H, d, H-10)], proton metylen H [1,63, m; 1,94, m, (H-6a
và H-6b); 2,31, m; 2,78, dd, (H-14a và H-14b) proton metylen gắn trên carbon olefin H
[4,81 (1H, s, H-20a) và 5,21 (1H, s, H-20b)], proton metin H [2,19 (1H, dd, H-1)] và H
[3,53 (1H, d, H-3)]
+ Phổ 13C NMR cho các tín hiệu của 28
C gồm: 8 carbon methyl, 2 carbon methylen
và 1 carbon tứ cấp [C 37,7 (C-15)] vùng trường cao, 1 carbon carbonyl [C 199,4 (C-9)],
4 carbon carbonyl ester [C 169,7 (10-OAc), 169,3 (2-OAc), 169,1 (7-OAc) và 169,1 (9-OAc)], 3 carbon olefin bậc bốn [C 144,7 (C-4); 149,8 (C-11) và 139,1 (C-12)], 1 carbon olefin bậc hai [C 115,4 (C-20)], 5 carbon bậc ba mang oxygen [C 68,9 (C-2), 74,5 (C-5), 69,5 (C-7), 75,1 (C-9) và 72,7 (C-10)],
2 carbon bậc ba [C 48,8 (C-1) và 39,7 (C-3)] và carbon bậc bốn [C 144,7 (C-4)]
Hình 1: Cấu trúc hóa học của taxuspin F (T1).
Trang 420
- Chất T2:
+ Được phân lập dưới dạng bột màu
trắng, kém tan trong MeOH, tan trong hệ
dung môi CHCl3-MeOH, sắc ký lớp mỏng
bằng hệ dung môi CHCl3-MeOH (9:1) cho
vết tắt quang ở bước sóng 254 nm Hiện
hình bằng H2SO4 10%/EtOH xuất hiện vết
tròn màu nâu với Rf = 0,18 Hiệu suất thu
nhận là 0,0038% Dựa vào phổ NMR 1 và 2
chiều, đối chiếu tài liệu tham khảo [10] nhận
định T2 là 19-hydroxybaccatin III
+ Phổ 1H-NMR cho tín hiệu cộng hưởng
H [1,09 (3H; s; 16-Me); 1,29 (3H; s;
17-Me); 1,99 (3H; s; 18-Me)]; H [2,30 (3H; s;
4-OAc) và H [2,24 (3H; s; 10-OAc)], proton
oxymethin H [6,43 (1H; d; 6,5 Hz; H-2);
5,05 (1H; d; 9,0 Hz; H-5); 4,40 (1H; m; H-7);
6,43 (1H; s; H-10) và 4,80 (1H; m; H-13)],
proton methylen H [2,54 (m); 1,78 (m)
(H-6a và H-6b) và 2,14 (m, 2H-14)], proton
methin H [3,89 (1H; d; H-3)], proton
methylen gắn carbon mang oxygen H [4,35
(m; H-20)] và proton methylen -CH2-OH H
[4,64 (2H; m; H-19)]
Phổ 13C-NMR cho các tín hiệu của 31
carbon với tín hiệu đặc trưng gồm: 1 carbon
carbonyl C [204,5 (C-9)], 3 carbon carbonyl
ester C [170,7 (4-OAc); 170,8 (10-OAc);
166,9 (2-OBz)], 6 carbon trong vòng benzen
C [129,2 (C-2′,6′); 128,8 (C-3′,5′); 133,7 (C-4′);
129,9 (C-1′)], 2 carbon olefin bậc bốn C
[131,5 (C-11) và 146,5 (C-12)]; 2 carbon
bậc ba mang oxygen C [75,6 (C-2); 84,4
(C-5); 71,1 (C-7); 76,7 (C-10); 66,7 (C-13)],
2 carbon bậc bốn mang oxygen C 78,0 (C-1)
và 80,4 (C-4)]
- Chất T3:
+ Phân lập dưới dạng bột màu trắng,
tan kém trong MeOH, tan trong hệ dung
môi CHCl3-MeOH, sắc ký lớp mỏng bằng
hệ dung môi CHCl3-MeOH (9:1) cho vết tắt
quang ở bước sóng 254 nm Hiện hình bằng H2SO4 10%/EtOH, xuất hiện vết tròn màu nâu với Rf = 0,29 Hiệu suất thu nhận
là 0,0012% Dựa vào phổ NMR 1 và 2 chiều, đối chiếu tài liệu tham khảo[3] nhận định T3
là baccatin III
+ Phổ 1
H- NMR cho các tín hiệu cộng hưởng H [1,07 (3H, s, 16-Me); 1,25 (3H, s, 17-Me); 1,99 (3H, s, 18-Me) và 1,57 (3H, s,
19-Me)]; H [2,22 (3H, s, 10-OAc) và 2,37 (3H, s, 4-OAc)], proton oxymetin H [6,26 (1H, d, H-2); 4,99 (1H, d, H-5); 4,45 (1H, dd, H-7); 6,86 (1H, s, H-10) và 4,82 (1H, m, H-13)], proton metylen [H 2,35, 2,41 (H-6a và H-6b)
và 2,28 (2H, H-14)], proton metin [H 4,01
(1H, d, H-3)], proton metylen gắn carbon có
mang oxygen [H 4,38 (1H, d, H-20a) và
4,23 (1H, H-20b)]
+ Phổ 13C- NMR cho các tín hiệu của 31 carbon với tín hiệu đặc trưng gồm 1 carbon carbonyl [C 205,5 (C-9)], 3 carbon carbonyl ester [C 172,4 (10-OAc), 169,3 (4-OAc) và
167,1 (s, 2-OBz)], 6 carbon hương phương
[C 129,5 (C-1′), 130,1 (C-2′,6′), 132,1 (C-3′,5′)
và 133,6 (C-4′)], 2 carbon olefin bậc bốn [C
129,5 (C-11) và 144,2 (C-12)], 1 carbon bậc hai mang oxygen [C 74,8 (C-20)], 5 carbon bậc ba mang oxygen [C 77,8 (C-2), 82,2 (C-5), 72.3 (C-7), 78,7 (C10), 68,0 (C-13)]
và 2 carbon bậc bốn mang oxygen [C 79,2 (C-1) và 81,5 (C-4)]
- Chất T4: Được phân lập dưới dạng bột màu trắng, kém tan trong MeOH, tan trong hệ dung môi CHCl3-MeOH Sắc ký lớp mỏng bằng hệ dung môi CHCl3-MeOH (9:1), cho vết tắt quang ở UV 254 nm Hiện hình bằng
H2SO4 10%/EtOH, xuất hiện vết tròn màu nâu với Rf = 0,06 Hiệu suất thu nhận là 0,072% Dựa vào phổ NMR 1 và 2 chiều, đối chiếu tài liệu tham khảo [2] nhận định T4
là 10-deacetyl baccatin III
Trang 521
+ Phổ 1
H- NMR cho các tín hiệu cộng
hưởng H [1,06 (3H, s, 16-Me); 1,09 (3H, s,
17-Me); 2,05 (3H, s, 18-Me) và 1,72 (3H, s,
19-Me)]; H [2,32 (3H, s, 4-OAc)], proton
oxymetin H [5,62 (1H, d, H-2); 5,00 (1H, d,
H-5); 4,25 (1H, dd, H-7); 5,28 (1H, s, H-10)
và 4,81 (1H, m, H-13)], proton metylen [H
1,86; 2,52 (H-6a và H-6b) và 2,21; 2,29 (2H,
H-14)], proton metin [H 3,98 (1H, d, H-3)],
proton metylen gắn carbon có mang oxygen
[H 4,31 (1H, d, H-20a) và 4,21 (1H, H-20b)]
+ Phổ 13C- NMR cho các tín hiệu của 29
carbon với tín hiệu đặc trưng gồm: 1 carbon
carbonyl [C 211,6 (C-9)], 2 carbon carbonyl
ester [C 171,2 (4-OAc) và 167,2 ( 2-OBz)],
6 carbon hương phương [C 129,9 (C-1′),
130,2 (C-2′,6′), 128,8 (C-3′,5′) và 133,7 (C-4′)],
2 carbon olefin bậc bốn [C 134,2 (C-11)
và 144,0 (C-12)], 1 carbon bậc hai mang
oxygen [C 76,9 (C-20)], 5 carbon bậc ba
mang oxygen [C 75,1 (C-2), 84,9 (C-5),
71.7 (C-7), 75,3 (C10) và 67,2 (C-13)], 2
carbon bậc bốn mang oxygen [C 78,8 (C-1)
và 81,0 (C-4)]
T2 (19-hydroxybaccatin III)
H OAc CH2OH
T3 (baccatin III) H OAc CH3
T4 (10 deacetyl baccatin III)
T6 (taxol) C6H5
-CH(NH-CO-C 6 H 5 -CH(OH)
OAc CH3
- Chất T5 Được phân lập dưới dạng kết tinh hình kim, kém tan trong MeOH, tan trong hệ dung môi CHCl3-MeOH Sắc ký lớp mỏng bằng hệ dung môi PE-Ac2O (6:4) và hiện hình bằng H2SO4 10%/EtOH, xuất hiện vết tròn màu nâu xám với Rf = 0,56 Hiệu suất thu nhận là 0,0022% Dựa vào phổ NMR 1
và 2 chiều, đối chiếu tài liệu tham khảo [5] nhận định T4 là taxchin A
+ Phổ 1H-NMR cho các tín hiệu cộng hưởng H [1,68 (3H, s, 16-Me); 1,16 (3H, s, 17-Me); 2,21 (3H, s, 18-Me) và 0,95 (3H, s, 19-Me)] 6 nhóm -OAc H [1,96 (3H, s, 5-OAc); 2,02 (3H, s, 7-OAc); 2,05 (3H, s, 9-OAc); 2,05 (3H, s, 10-OAc); 2,11 ( 3H, s, 13-OAc); 2,23 (3H, s, 20-OAc)] Proton oxymethin H
[4,24 (1H, m, H-2)], proton methylen H [1,9 (H-6a; H-6b); 1,47 và 2,63 (H-14a, H-14b); 3,94 và 4,53 (H-20a, H-20b)] Proton methin
H [2,62 (1H,H-3); 2,21 (1H, H-4); 5,01 (1H, H-5); 5,39 (1H, H-7); 5,77 (1H, H-9); 6.15 (1H, H-10); 5.95 (1H, H-13)]
+ Phổ 13C-NMR cho các tín hiệu của 32 carbon, trong đó có tín hiệu đặc trưng gồm
6 carbon carbonyl ester C [171,4 (5-OAc); 170,4 (7-OAc); 170,4 (9-OAc); 170,1 (10-OAc); 169,8 (13-OAc); 169,1 (20-OAc)] 2 carbon olefin bậc bốn C [133,6 (C-11) và 137,8 (C-12)]; 1 cacbon bậc ba mang oxygen C
[68,74 (C-2)]
Trang 622
- Chất T6
Được phân lập dưới dạng kết tinh hình
kim, kém tan trong MeOH, tan trong hệ
dung môi CHCl3-MeOH Sắc ký lớp mỏng
bằng hệ dung môi CHCl3-MeOH (9:1) và
hiện hình bằng H2SO4 10%/EtOH xuất hiện
vết tròn màu nâu xám với Rf = 0,70 Hiệu
suất thu nhận là 0,0014% Dựa vào phổ
NMR 1 và 2 chiều, đối chiếu tài liệu tham
khảo [5] nhận định T6 là taxol
+ Phổ 1H- NMR cho tín hiệu cộng hưởng
H [1,20 (3H, s, 16-Me); 1,22 (3H, s, 17-Me);
1,80 (3H, s, 18-Me) và 1,65 (3H, s, 19-Me)];
H [2,15 (3H, s, 10-OAc) và 2,42 (3H, s,
4-OAc)], proton oxymetin H [5,68 (1H, d,
H-2); 4,49 (1H, d, H-5); 4,40 (1H, dd, H-7);
6,39 (1H, s, H-10) và 6,19 (1H, m, H-13)],
proton metylen [H 1,79 và 2,46 (6a và
H-6b); 2,20 và 2,38 (2H, H-14)], proton metin
[H 3,83 (1H, d, H-3)], proton metylen gắn
carbon có mang oxygen [H 4,16 (1H, d,
H-20a) và 4,23 (1H, H-20b)] cùng với các
tín hiệu proton của ba nhân thơm ở vùng
trường thấp 7 - 8 ppm
+ Phổ 13C- NMR cho các tín hiệu của 47
carbon với tín hiệu đặc trưng gồm 1 carbon
carbonyl [C 203,7 (C-9)], 5 carbon carbonyl
ester [C 171,1 (10-OAc); 170,6 (4-OAc);
173,6 (C-1’); 166,6 (C-2’’-OBz) và 167,6
(C-2-OBz)], 18 tín hiệu carbon hưíng phương
vùng trường thấp 120-140 ppm, hai carbon olefin bậc bốn [C 134,0 (C-11) và 142,1 (C-12)], 1 carbon bậc hai mang oxygen [C 76,8 (C-20)], 5 carbon bậc ba mang oxygen [C 75,9 (C-2); 85,0 (C-5), 72,4 (C-7); 76,2 (C10) và 71,9 (C-13)] và 2 carbon bậc bốn mang oxygen [C 78,8 (C-1) và 81,7 (C-4)]
Có nhiều quy trình công bố về chiết tách, thu nhận 10-DAB và taxoid khác trong Thông đỏ Các giai đoạn của quy trình tóm tắt như sau: (1) sử dụng dung môi để chiết hoạt chất khỏi nguyên liệu ban đầu, (2) loại các tạp chất còn trong dịch chiết bằng phương pháp hóa học (lắc phân đoạn, dùng tác nhân loại màu, chất nhày (3) dùng phương pháp sắc ký cột với nguyên liệu silica gel pha thuận hay pha đảo để thu nhận taxoid tinh khiết Trong đó, quy trình của KV Rao (1995, Mỹ) [5] đề cập đến việc thu nhận các taxoid chính: taxol, 10-DAB, baccatin III, cephalomannin ở quy mô công nghiệp Sử dụng phương pháp chiết hoàn lưu liên tục bằng MeOH, chiết phân đoạn lỏng, áp dụng phương pháp sắc ký cột áp suất trung bình pha đảo và pha thuận Kết quả thu được taxol (0,04%, tính trên khối lượng nguyên liệu vỏ), 10-DAB (0,02%) và các taxoid khác
Việc thu nhận taxoid từ lá Thông đỏ lá dài sử dụng vật liệu sắc ký là nhựa diaion HP-20 và hạt silica gel pha thường khá đơn giản, có giá thành rẻ Với pha tĩnh diaion HP-20, pha động là hệ dung môi MeOH:H2O, có thể thu hồi dung môi, tái sử dụng cả pha tĩnh và pha động, điều này có
ý nghĩa lớn về mặt sản xuất Mặt khác, cột
sử dụng là thép không gỉ, dễ thiết kế, áp dụng ở quy mô lớn Quy trình này có nhiều
ưu điểm hơn quy trình đã nghiên cứu của
KV Rao và CS (sử dụng cột sắc ký pha đảo có áp suất, thiết bị tốn kém, pha tĩnh sau khi sử dụng phải rửa nhiều lần trước khi tái sử dụng…)
Trang 723
KẾT LUẬN
Quy trình thu nhận các taxoid từ lá cây
Thông đỏ lá dài Taxus wallichiana Zucc
đã được khảo sát ở quy mô pilot (tương
đương 3 kg lá khô/mẻ) với thiết bị và
nguyên liệu sắc ký giá thành rẻ, đơn giản
và dễ dàng nâng cấp trªn quy mô công
nghiệp Hiệu suất thu nhận các taxoid
tương đối cao (0,072% 10-DAB; 0,0014%
taxol) so với hàm lượng có trong nguyên
liệu (0,1 - 0,2% 10-DAB và 0,004% taxol) [3]
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1 Trần Công Luận, Ngô Thiện Tú Khanh,
Phan Văn Đệ, Vương Chí Hùng Nghiên cứu
đặc điểm vi học và thành phần hóa học của lá
Thông đỏ (Taxus wallichiana Zucc.), trồng ở
Lâm Đồng Tạp chí Y học TP HCM 2008, 12
(4), tr.98-104
2 Nguyễn Thị Thanh Tâm, Nguyễn Trung Nhân
Nghiên cứu thành phần hóa học của lá cây
Thông đỏ (Taxus wallichiana Zucc), họ Thông
đỏ (Taxaceae) Tạp chí Phát triển KH&CN 2009,
12 (10), tr.57-63
3 Nguyễn Ngọc Song Trâm, Bùi Thế Vinh,
Nguyễn Hoàng Quỳnh Hương, Trần Công Luận
Xây dựng quy trình định lượng 10-DAB và taxol
trong lá Thông đỏ (Taxus wallichiana Zucc.)
Tạp chí Y học TP HCM 2008, tập 12, phụ bản
của số 4, tr.105-111
4 Nguyen Huu Toan Phan, Nguyen Thi Dieu
Thuan, Chau Van Minh, Nguyen Cong Hao
Constituents of Taxus wallichiana Zucc in Vietnam
Proceedings of the fourth Indochina Conference
on Pharmaceutical sciences 2005, 1, pp.186-189
5 Gwendolyn N Chmurny, Bruce D Hilton, Susan Brobst, Sally A Look, Keith M Witherup, John A Beutler 1H- and 13C-NMR assignments for taxol, 7-epi-taxol and cephalomannine Journal
of natural products 1992, 55 (4), pp.414-423
6 Koppaka V Rao, Jampani B Hanuman, Claudio Alvarez, Mark Stoy, John Juchum, Richard
M Davids, Ronald Baxley A new large-scale process for taxol and related taxanes from Taxus brevifolia Pharmaceutical Research 1995, 12 (7)
7 Mroczek T, Glowniak K Solid-phase extraction
and simplified high-performance liquid chromatographic determination of 10-deacetylbaccatin III and related taxoids in yew species Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 2001, 26, pp.89-102
8 Horiguchi T, Cheng Q, Oritani T Two
novel taxane diterpenoids from the needles of
Japanese Yew, Taxus cuspidate Bioscience,
Biotechnology and Biochemistry 2000, 64 (4), pp.894-898
9 Naotoshi Y, Sasaki T, Kobayashi J, Inubushi A, Hosoyama I and Shigemori H
Taxuspines E ~ H and J, New Taxoids from the
Japanese Yew Taxus cuspidate Tetrahedron
1995, 51 (21), pp.5971-5978
10 Mclaughlin JL, Miller RW, Powell RG, Smith CR 19hydroxybaccatin III, 10
-deacetylcephalomannine, and 10-deacetyltaxol:
new antitumor taxanes from Taxus wallichiana
Journal of Natural Products 1981, 44 (3), pp.312-319
Trang 824