Nghiên cứu với mục tiêu nhằm đánh giá khả năng đáp ứng in vitro của các chủng C. neoformans phân lập từ bệnh nhân viêm não - màng não đối với amphotericin B (AMB), fluconazol (FLU) và flucytosine (5-FU) bằng phương pháp khuếch tán trên thạch.
Trang 1ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG ĐÁP ỨNG IN VITRO CỦA CRYPTOCOCCUS
NEOFORMANS ĐỐI VỚI CÁC THUỐC KHÁNG NẤM
Nhữ Thị Hoa, Phạm Quốc Trung*
TÓM TẮT
Mục tiêu: đánh giá khả năng đáp ứng in vitro của các chủng C neoformans phân lập từ bệnh nhân viêm
não-màng não đối với amphotericin B (AMB), fluconazol (FLU) và flucytosine (5-FU) bằng phương pháp khuếch tán trên thạch
Phương pháp: thử nghiệm in vitro được tiến hành trên 107 loài C neoformans được phân lập từ bệnh
nhân và lưu trữ tại bộ môn Ký Sinh-Vi Nấm Học, trường Đại học Y Khoa Phạm Ngọc Thạch Phục hồi các loài
C neoformans trên môi trường SDA hoặc trên chuột bạch đã gây suy giảm miễn dịch và định danh kiểm tra bằng môi trường Staib-Ajello Xác định bước sóng và ngưỡng OD tương đương 10 6 CFU/ml để định lượng dịch treo nấm bằng quang phổ kế Môi trường Muller Hinton có bổ sung glucose và methylen blue được sử dụng trong đánh giá đáp ứng thuốc Đường kính vòng sạch nấm được đo sau 2 ngày Phân tích số liệu bằng phần mềm Stata 10.0
Kết quả: bước sóng thích hợp để định lượng nồng độ nấm C neoformans là 640nm; OD tương đương 10 6
CFU/ml là 0,06 Trong 107 mẫu được khảo sát, 8,4% thuộc var gattii, 91,6% thuộc var neoformans Tỉ lệ C neoformans nhạy với amphotericin B, fluconazol, flucytosine lần lượt là 76,6% , 71% , 0,9%; nhạy kém là 23,4%, 16,8% và 0% Không ghi nhận trường hợp kháng amphotericin B, trong khi đó, 12,2% C neoformans kháng fluconazol và 99% C neoformans kháng flucytosine Các chủng kháng tập trung ở nhóm var neoformans Chưa phát hiện mối liên quan giữa khả năng đáp ứng thuốc in vitro với chủng (variety) cũng như việc sử dụng fluconazol dự phòng
Kết luận và đề xuất: bước sóng 640nm (máy spectro SC) là bước sóng thích hợp để định lượng nồng độ
dịch treo nấm C neoformans Mức độ nhạy của C neoformans đối với amphotericin B và fluconazol có khuynh hướng giảm Cần tiến hành khảo sát MIC của các hoạt chất kháng nấm trên các chủng phân lập từ môi trường
và bệnh nhân nhằm đưa ra kết luận chính xác và cụ thể hơn
Từ khóa: C neoformans, bước sóng 640nm, amphotericin B, fluconazol, flucytosine, tỉ lệ kháng, tỉ lệ nhạy
ABSTRACT
IN VITRO SUSCEPTIBILITY OF CRYPTOCOCCUS NEOFORMANS TO ANTIFUNGALS
Nhu Thi Hoa, Pham Quoc Trung
* Y Hoc TP Ho Chi Minh * Vol 16 - Supplement of No 1 - 2012: 70 - 75
Objectives: to assess in vitro susceptibility of C neoformans isolated from meningo-encephalitic patients to
amphotericin B, fluconazol, flucytosine by disk diffusion method
Method: in vitro susceptibility to amphotericin B, fluconazol, flucytosine of 107 C neoformans isolates,
preserved in 10% glycerine solution at Pham Ngoc Thach University of Medicine, was assessed by disk diffusion method The strains were recovered by inoculating into SDA (Sabouraud dextrose agar) or intra-peritoneal injection to immunosuppressed mice and identified via Staib-Ajello culture Optimal wavelength and OD
Bộ môn Ký Sinh-Vi Nấm Hoc, trường Đại Học Y Khoa Phạm Ngọc Thạch
Tác giả liên lạc: Ths Nhữ Thị Hoa ĐT: 0903379566 Email: drnhuhoa@yahoo.com
Trang 2equivalent to 10 6 CFU/ml were determined for quantification of yeast cells suspension by spectrophotometry Muller-Hinton media supplemented with glucose and methylen blue was used for assessing susceptibility of the yeast to antifungi Diameter of antifungal zone was recorded after 48 hours Data were analyzed with Stata10.0
Results: the optimal wavelength to defining the density of cryptococcal suspension is 640 nm, and OD being
equivalent to 10 6 CFU/ml is 0.06 Among 107 isolates evaluated, there were 8.4% var gattii, and 91.6% var neoformans In vitro susceptibility of C neoformans to amphotericin B, fluconazol, and flucytosine are respectively: susceptible: 76.6%, 71% and 0.9%; intermediate: 23.4%, 16.8% and 0% No resistant strains to amphotericin B were observed, but 99.07% and 12.15% of isolates were readily resistant to flucytosine and fluconazol respectively Most of strains resisting to fluconazol and flucytosine belong to var neoformans No correlation between in vitro susceptibility and fungal variety, together with the prophylactic use of fluconazol were found
Conclusions and recommendations: wavelength of 640nm (Spectro SC apparatus) is optimal for
determining density of cryptococcal suspension In vitro susceptibility to fluconazol, amphotericine B tends to decline It is really necessary to conduct research on amphotericin B, fluconazol and flucytosine MICs of isolates from environment and patients
Key words: C neoformans, spectrophotometry, amphotericin B, fluconazol, flucytosine, resistance,
susceptibilty
ĐẶT VẤN ĐỀ
C neoformans là một trong những tác nhân
gây nhiễm trùng cơ hội, đặc biệt trên cơ địa
HIV/AIDS, do đó, kháng nấm dự phòng đã
được khuyến cáo áp dụng trên các đối tượng
nguy cơ cao Ngoài ra trong điều trị, sau đợt tấn
công, phác đồ kéo dài cũng được đòi hỏi để
này có thể dẫn đến nguy cơ thay đổi ngưỡng
đáp ứng của C neoformans đối với thuốc kháng
nấm(13, 15)
Thật vậy, trước thập niên 90, ngưỡng MIC
HIV/AIDS, nhiều tác giả ghi nhận tình trạng
giảm tác dụng của fluconazol trên C
neoformans(7, 8, 13) Borann phát hiện ngưỡng MIC
của fluconazol tăng dần từ năm 2000 đến năm
2002, và số trường hợp kháng fluconazol cũng
tăng 5,6 lần: 2,5% trong năm đầu so với 14% vào
hợp kháng amphotericin B cũng được khẳng
định qua đánh giá in vitro: MIC của
Amphotericin B từ 0,2µg/ml vào năm 1958 tăng
Đặc biệt hiện tượng kháng chéo giữa
amphotericin B và fluconazol đã được phát hiện
trong một số C neoformans gây bệnh trên
người(6) Tại Việt Nam, trong khảo sát về viêm
não-màng não do C neoformans năm 2004, N.Q
Trung ghi nhận 12/15 trường hợp nhập viện lần
N.L.H Anh và L.G Hiếu cũng trình bày 3
nhiên, việc sử dụng các thuốc kháng retrovirus
ở Việt Nam chưa bao phủ đều khắp các đối tượng HIV/AIDS Như vậy, hiện tượng giảm
đáp ứng của C neoformans đối với các hoạt chất
kháng nấm là thật sự hay chỉ là hậu quả của tình trạng suy giảm miễn dịch không được cải thiện của bệnh nhân? Trên cơ sở đó, khảo sát tác dụng
in vitro của thuốc kháng nấm trên C neoformans
đã được tiến hành
ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Phương pháp khuếch tán trên thạch được sử dụng để khảo sát khả năng đáp ứng với amphotericin B, fluconazol, flucytosine của 107
loài C neoformans được phân lập từ bệnh nhân
viêm não-màng não và lưu trữ tại bộ môn Ký Sinh Trùng – Vi Nấm Học, Đại học Y khoa Phạm Ngọc Thạch Phục hồi các loài bằng canh cấy SDA (sabouraud dextrose agar) hoặc cấy
Trang 3trên chuột suy giảm miễn dịch Định lượng
nồng độ dịch treo nấm bằng quang phổ kế ở
bước sóng 640nm Bước sóng này được xác định
thông qua việc khảo sát mức độ hấp thụ sóng
cao nhất của C neoformans (chủng quốc tế ATCC
76108, ATCC 28957) trong dãy sóng từ 600nm
đến 700nm Dịch treo nấm, sau khi đo quang,
CFU/ml vào môi trường Muller Hinton có bổ
sung glucose và methylen blue Đặt đĩa kháng
nấm (Neostabs) vào canh cấy và ủ ở nhiệt độ
phòng Đường kính vòng kháng nấm được đo
sau 2 – 3 ngày và phân loại mức độ nhạy cảm
theo tiêu chuẩn của nhà sản xuất Neostabs
Phân tích số liệu bằng Stata 10.0
KẾT QUẢ
Bảng 1: Đặc điểm chung của mẫu nghiên cứu
Thời điểm lấy mẫu Trước năm 2000 Sau năm 2008
16
91
14,9 85,1 Suy giảm miễn dịch
Có HIV/AIDS (+) HIV/AIDS (–) Không
103
99
4
4
96,3 96,1 3,9 3,7 Uống fluconazol dự phòng
Có
Chủng var gattii var neoformans
9
98
8,4 91,6
Đa số chủng thuộc var neoformans, được
phân lập sau năm 2008 từ cơ địa suy giảm miễn dịch, trong đó HIV/AIDS chiếm ưu thế, nhưng chỉ 5,1% có dự phòng nhiễm nấm cơ hội bằng fluconazol
Biểu đồ 1: Giá trị OD của các chủng C neoformans quốc tế và bệnh nhân theo dãy bước sóng từ 600 – 700 nm
Theo biểu đồ 1, với bước sóng 640 nm, khả
năng hấp thu sóng của C neoformans cao nhất ở
cả 2 chủng quốc tế và bệnh nhân
Bảng 2: giá trị OD tương ứng với nồng độ dịch treo
các chủng nấm C neoformans quốc tế
Nồng độ nấm OD M OD
var neoformans (ATCC
28957)
Mẫu 1
Mẫu 2
1 x 106 1,3 x 106
0,059 0,065
0,06
2
var gattii (ATCC 76108)
Mẫu 1
Mẫu 2
0,9 x 106
1 x 106`
0,058 0,062 0,06
CFU/ml dịch treo tế bào C neoformans là 0,06
Bảng 3: Tỉ lệ nhạy cảm của C neoformans đối với các
thuốc kháng nấm:
(n,%)
Kháng (n,%)
Tất cả các chủng đều nhạy với amphotericin
B trong đó 23,4% nhạy kém Ngược lại, hầu hết
C neoformans kháng với flucytosine và 12,2%
Trang 4kháng với fluconazol
Bảng 4: phân bố khả năng đáp ứng với thuốc kháng
nấm theo chủng:
(Fisher)
neoformans 23 (23,5) 75 (76,5)
neoformans 31 (31,6) 67(68,4)
Sự đáp ứng in vitro với các thuốc kháng nấm
tương tự ở cả 2 chủng
Bảng 5: khả năng đáp ứng với AMB phân bố theo
thời gian và việc dùng FLU dự phòng
Đáp ứng * (n, %) 2
(Fisher)
Thời gian
(năm 2000)
Trước 5 (31,3) 11 (68,8) p > 0,5
Sau 20 (22,0) 71 (78,0) Dùng FLU
dự phòng
Không 23 (22,6) 79 (77,5) p > 0,3
* Không: nhạy kém và kháng; Có: nhạy
Chưa ghi nhận sự khác biệt về việc dùng
FLU dự phòng và các chủng trước hoặc sau 2008
trong đáp ứng in vitro đối với AMB của C
neoformans
Bảng 6: khả năng đáp ứng với FLU phân bố theo thời
điểm thu thập chủng và việc dùng FLU dự phòng:
Đáp ứng * ( n, %) χ 2 (Fisher)
Thời gian (năm
2008)
Trước 2 (12,5) 14 (87,5) p > 0,1 Sau 29 (31,9) 62 (68,1)
Dùng FLU dự
phòng
Không 28 (27,5) 74 (72,6) p >0,1
*Không: nhạy kém và kháng; Có: nhạy
Việc đáp ứng in vitro đối với fluconazol
không phụ thuộc thời điểm phân lập các chủng
nấm cũng như việc dùng fluconazol dự phòng
BÀN LUẬN
Đặc điểm của mẫu nghiên cứu
Tổng mẫu nghiên cứu bao gồm 107 loài
Cryptococcus neoformans phân lập từ bệnh nhân,
trong đó 96,1% từ cơ địa nhiễm HIV/AIDS, chủ
yếu sau năm 2008, nhưng chỉ 5,1% trường hợp
được điều trị dự phòng với fluconazol (Bảng 1), chứng tỏ việc dự phòng nhiễm nấm cơ hội ở bệnh nhân HIV/AIDS chưa được quan tâm đúng mức Tình trạng này có thể bị tác động bởi các lý
do như : 1) những khó khăn về kinh tế không cho phép bệnh nhân tuân thủ điều trị fluconazol
dự phòng; 2) sự tương tác giữa fluconazol với các thuốc điều trị khác, như rifampicin; 3) nhiều đối tượng nguy cơ cao chỉ được phát hiện nhiễm HIV vào thời điểm chẩn đoán viêm não-màng não do vi nấm; 4) việc dự phòng
Về phân bố chủng (variety), 91,6% C
neoformans thuộc var neoformans (Bảng 1), phù
hợp với đặc điểm sinh học của Cryptococcus
neoformans: var neoformans tấn công chủ yếu trên
trước và sau 1986, cho thấy tỉ lệ nhiễm C
neoformans var neoformans gia tăng cùng với đại
neoformans phân lập từ bệnh nhân ở các nước
Đông Nam Á nói chung cũng nghiêng về var
neoformans(10, 13), do vậy, Việt Nam, một nước trong khu vực, ít nhiều sẽ mang dáng dấp của
mô hình này
Hầu hết các chủng phân tích đều được lưu trữ từ năm 2008 (Bảng 1), các chủng trước 2008 chỉ bằng 1/6, vì vậy bản chất của sự thay đổi mức đáp ứng với thuốc kháng nấm theo thời gian, nếu tồn tại, có thể chưa được bộc lộ rõ trong khảo sát này
Xác định bước sóng và OD thích hợp trong việc định lượng nồng độ nấm thông qua phương pháp quang phổ kế
Mật độ nấm là một trong những yếu tố có
thể ảnh hưởng đến khả năng đáp ứng in vitro của vi nấm đối với thuốc kháng nấm, do vậy
cần đảm bảo chính xác số lượng tế bào nấm trong dịch treo thử nghiệm Hiện nay có nhiều phương pháp xác định nồng độ dịch treo, trong
đó định lượng bằng quang phổ kế ở bước sóng thích hợp là phổ biến nhất Tuy nhiên, bước
sóng tối ưu đối với C neoformans chưa được đề
cập trong các danh mục chuẩn nên việc xác định
Trang 5bước sóng đã được tiến hành dựa trên mức độ
hấp thu sóng ở một nồng độ nhất định của C
neoformans tại nhiều bước sóng khác nhau Biểu
đồ 1 cho thấy bước sóng 640nm cho giá trị OD
cao nhất ở cả 2 chủng quốc tế: var neoformans
ATCC 28957 và var gattii ATCC 76108 Đây là
những chủng có bao nang dày rõ rệt Ngược lại,
bao nang của C neoformans từ các bệnh nhân
được phân lập trên canh cấy SDA thường trở
nên mỏng hơn, thậm chí không thể nhìn thấy Vì
thế, C neoformans phân lập từ bệnh nhân có bao
nang mỏng được dùng để kiểm chứng và cho
kết quả bước sóng tương tự Qua đó chứng tỏ
khả năng hấp thụ sóng của các loại tế bào hạt
men Cryptococcus neoformans không bị ảnh
hưởng bởi bao nang Do vậy, bước sóng 640nm
được sử dụng để định lượng nồng độ dịch treo
tế bào C neoformans trong nghiên cứu này, khác
với bước sóng 625nm dùng cho vi nấm nói
này là tất yếu do khác biệt tùy loại máy quang
phổ, loại Cuvet, loại vi nấm được sử dụng …
Sử dụng bước sóng 640nm để xác định OD ở
2 cho thấy: OD = [0,058 – 0,065] tương ứng với
mật độ nấm dao động trong khoảng (0,9 – 1,3) x
trung bình giữa 2 var hầu như không tồn tại,
0,062 và 0,060 Vì vậy để thuận tiện cho việc tính
toán, đo đạc, OD = 0,06 được chọn làm OD
dịch treo nấm cho cả var neoformans và var
gattii
Đánh giá khả năng đáp ứng In vitro của C
neoformans đối với các thuốc kháng nấm
Theo bảng 3, 76,6% C neoformans nhạy với
Amphotericin B, thấp hơn nghiên cứu của
không thể quy cho môi trường cấy khác nhau
hoặc lượng nấm tiêm vào vì ở mỗi điều kiện đều
được quy định ngưỡng đánh giá tương ứng
Những sai sót trong đo đạc vòng kháng nấm có
thể xảy ra nhưng chỉ xuất hiện khi đường kính
vòng ức chế mập mờ tại ranh giới của 2 phân lớp: nhạy– nhạy kém hoặc nhạy kém – kháng Vì vậy, bảng 3 gợi ý một sự thay đổi về khả năng
đáp ứng của C neoformans đối với Amphotericin
B Những thử nghiệm về MIC cần được thực hiện trên các chủng phân lập trước, trong và tái phát sau điều trị để khẳng định hiện tượng này Trong thử nghiệm đối với Fluconazol, tỉ lệ nhạy, nhạy kém và kháng lần lượt là 71%, 20,5%
và 14%, khá tương đồng với nghiên cứu của
nhận khuynh hướng tăng dần đối với Fluconazol so với trước đại dịch AIDS Tuy nhiên mức độ đáp ứng thay đổi tùy thuộc vào thời gian sử dụng Fluconazol nên kết quả thay đổi theo từng báo cáo
Xét tính đáp ứng của các chủng đối với hoạt chất kháng nấm, bảng 4 chưa thể hiện sự khác
ứng với amphotericin B tốt hơn var neoformans,
nhưng không khác biệt đối với fluconazole Theo Luciana, amphotericin B tác dụng như
nhau trên cả 2 var nhưng var gattii kém nhạy
cỡ mẫu giữa 2 chủng: hoặc tập trung chủ yếu
vào var neoformans trong số liệu của George,
Gomez, T.T.H Châu và khảo sát hiện tại; hoặc
lệch về phía var gattii trong đánh giá của
Luciana Do đó, để khẳng định, cần có một nghiên cứu với cỡ mẫu lớn hơn và cân đối hơn giữa hai chủng
Xét về thời điểm thu thập mẫu, không tìm
thấy sự thay đổi về khả năng đáp ứng In vitro của C neoformans theo thời gian (bảng 5, bảng 6)
Nguyên nhân có thể do mầm bệnh không phát tán vào môi trường và không lan truyền một cách tự nhiên từ người sang người qua đường không khí cũng như qua các chất tiết, chất thải,
do đó sự đột biến gây kháng thuốc của tế bào nấm, cũng ít cơ hội được “di truyền” Vì thế, hiện tượng kháng thuốc hoặc kém nhạy của một
Trang 6chủng C neoformans nhiều khả năng được hình
thành ngay trong thời gian tồn tại trên cơ thể
của chính bệnh nhân bị nhiễm
Về việc sử dụng fluconazol dự phòng, mặc
dù hiện tượng kháng chéo thường xảy ra giữa
các hoạt chất trong cùng nhóm, nhưng từ năm
1995, Joseph-Horne đã phát hiện khả năng
kháng chéo giữa amphotericin B và fluconazole
trên một số chủng C neoformans gây bệnh trên
được mối liên hệ giữa việc dùng fluconazol dự
phòng và mức độ đáp ứng in vitro của C
neoformans đối với amphotericin B, thậm chí cả
fluconazol Có lẽ cỡ mẫu đã che dấu bản chất
của vấn đề: chỉ 5/107 trường hợp được ghi nhận
đã phòng ngừa nhiễm nấm cơ hội bằng
fluconazol Do vậy, để nhận định chính xác hơn
về vấn đề này cần một nghiên cứu khác với cỡ
mẫu phù hợp hơn
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT
Bước sóng 640 nm thích hợp cho việc định
lượng nồng độ dịch treo nấm C neoformans trên
dòng máy spectro SC C neoformans kháng mạnh
với flucytosine và có khuynh hướng giảm đáp
ứng với fluconazol và amphotericin B Chưa tìm
thấy sự khác biệt về đáp ứng in vitro giữa var
neoformans và var gattii đối với các thuốc kháng
nấm
Khảo sát MIC của các chủng C neoformans
phân lập từ bệnh nhân và môi trường thiên
nhiên nên được tiến hành với cỡ mẫu phù hợp
để đánh giá chính xác sự thay đổi khả năng đáp
ứng, nếu có, của C neoformans đối với các hoạt
chất kháng nấm
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1 Aller AI, Lozano F (2000) Correlation of fluconazole MICs with
clinical outcome in cryptococcal Infection Antimicrob agents
Chemother, 44(6):1544 - 8
2 CDC (2009) Guidelines for prevention and treatment of
opportunistic infections in HIV-infected adults and adolescents
March 24, Vol.58: 48-50
3 Davey KG, Johnson EM , Holmes AD (1998) In vitro
susceptibility of C neoformans isolates to fluconazole and
itraconazole Antimicrob Chemother, 42:217 - 20
4 Espinel-Ingroff A, Gibbs D, and Wang A (2007) Correlation of
Neo-Sensitabs tablet diffusion assay results on three different
agar media with CLSI broth microdilution M27-A2 and disk diffusion M44-A results for testing susceptibilities of Candida
spp and C neoformans to amphotericin B, caspofungin,
fluconazole, itraconazole, and voriconazole Journal of clinical microbiology, 45(3):858 - 64
5 Gomez-Lopez A, Dos M , Martins A, Melhem MC, Rodriguez-Tudela JL, and Cuenca-Estrella M (2008) In vitro susceptibility of
Cryptococcus gattii clinical isolates J Clin Microbiol Infect, 14:727
- 30
6 Josep-Horne T, Hollomon D (1995) Cross-resistance to polyene
and azole drugs in Cryotococcus neoformans Antimicrob Agents
Chemother, 39:1526-9
7 Kimberly E, Hanson BDA, and Perfect J (2009) Drug resistance
in C neoformans In: Mayers DL Antimicrobial Drug Resistance
p 967 - 81
8 Koletar SL, Buesching WJ and Fass R.J (1995) Emerging
resistance to fluconazole among blood and CSF C neoformans
isolates Antimicrob agents Chemother, p 98
9 Kovacs JA Masur H (2000) Prophylaxis against opportunistic infections in patients with human immunodeficiency virus infection N Engl J Med., 342(19): 1416-29
10 Kwon – Chung KJ, and Bennett JE (1984) Epidemiologic
differences between the two varieties of Crytococcus neoformans
Am J Epidemiol., 120:123 - 30
11 Nguyễn LH Anh, La G Hiếu (2009) Đặc điểm dịch tễ & bệnh
học của C neoformans trên bệnh nhân viêm não-màng não điều
trị tại BV Bệnh Nhiệt Đới từ 11/08 - 06/09 2009 Luận văn Tốt nghiệp bác sĩ khóa XV (2003 – 2009) Đại học Y Khoa Phạm Ngọc Thạch TP HCM
12 Nguyễn Quang Trung (2005) VMN nấm Cryptococcus
neoformans ở bệnh nhân AIDS tại bệnh viện Nhiệt Đới
2004-2005 Luận văn tốt nghiệp bác sĩ nội trú Đại học Y Dược TP HCM
13 Sar B, Monchy D, Vann M, Keo C, Sarthou JL, and Buisson Y
(2004) Increasing in vitro resistance to fluconazole in C
neoformans Cambodian isolates: April 2000 to March 2002 J of
Antimicro Chemother, 54:563 - 5
14 Swinne D, Nkurikiyinfura JB, and Muyembe TL (1986) Clinical
isolates of Crytococcus neoformans from Zaire Eur J Clin
Microbial, 5:50 -1
15 Thompson GR, Wiederhold NP, Fothergill AW, Vallor AC, Wickes BL, and Patterson TF (2009) Antifungal susceptibilities
among different serotypes of C gattii and C neoformans
Antimicrob agents Chemother, 53(1):309 –11
16 Thornsberry C (1991) Antimicrobial susceptibility testing In: Balows A et al Manual of clinical Microbiology, 5th ed, pp
1059-1201 American Society for Microbiology, Washington DC
17 Tran T H Chau, Ho D Nghia, Ly V Chuong, Dinh X Sinh, Van
A Duong, Pham T Diep, Campbell JI, Baker S (2010) A prospective descriptive study of cryptococcal meningitis in HIV
uninfected patients in Vietnam - high prevalence of C
neoformans var grubii in the absence of underlying disease BMC
Infectious Diseases, 10:199
18 Trilles L, Torres BF, Lazéra MS, Wanke B, and Guarro J (2004)
In vitro antifungal susceptibility of C gattii Journal of clinical
microbiology, 42(10): 4815 - 7