Mục tiêu nghiên cứu của bài viết nhằm đánh giá tác dụng kháng khuẩn in vitro và tính kích ứng da của dung dịch mafenid acetate (MA) trên các chủng vi khuẩn (VK) thường gặp trong bỏng trên thỏ thực nghiệm. Phương pháp: sử dụng phương pháp khuếch tán trên thạch để đánh giá tác dụng kháng khuẩn in vitro.
Trang 1ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG KHÁNG KHUẨN IN VITRO VÀ
TÍNH KÍCH ỨNG DA TRÊN ĐỘNG VẬT THỰC NGHIỆM
CỦA DUNG DỊCH MAFENID ACETAT
Lương Quang Anh*; Nguyễn Như Lâm*; Hồ Anh Sơn**; Nguyễn Lĩnh Toàn**
TÓM TẮT
Mục tiêu: đánh giá tác dụng kháng khuẩn in vitro và tính kích ứng da của dung dịch mafenid
acetate (MA) trên các chủng vi khuẩn (VK) thường gặp trong bỏng trên thỏ thực nghiệm
Phương pháp: sử dụng phương pháp khuếch tán trên thạch để đánh giá tác dụng kháng khuẩn
in vitro 6 thỏ khỏe mạnh được đắp thuốc trên da lưng và theo dõi điểm kích ứng da sau 72 giờ
tiếp xúc Kết quả: thuốc có tác dụng kháng khuẩn đối với Shigella flexneri, Salmonella typhi,
Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Bacillus pumilus, Bacillus subtilis, Bacillus cereus, Sarcina lutea Đồng thời, thuốc cũng có tác dụng kháng khuẩn đối với Pseudomonas
aeruginosa phân lập được tại Khoa Hồi sức Cấp cứu, Viện Bỏng Quốc gia Tuy nhiên, VK vẫn
phát triển mạnh khi tiếp xúc với dung dịch MA có nồng độ < 5% Điểm kích ứng bằng 0 khi đắp thuốc trên lưng của thỏ thí nghiệm Kết luận: dung dịch MA 5% có tác dụng kháng khuẩn tốt với
nhiều chủng VK, trong đó có trực khuẩn mủ xanh phân lập được tại Viện Bỏng Quốc gia và không kích ứng khi sử dụng trên thỏ
* Từ khóa: Mafenid acetat; Tác dụng kháng khuẩn; Kích ứng da
Evaluation of Antibacterial Activities In Vitro and Skin Irritation of Mafenide Acetate Solution on Rabbits
Summary
Objectives: Evaluation of antibacterial activities in vitro and skin irritation of mafenide acetate (MA) solution on rabbits Methods: Determination of antibacterial activities in vitro by the agar well diffusion method Assessment of skin irritation grade on 6 healthy rabbits that were topically
applied the drug on its back after 72 hours of contact Results: The drug had effectiveness on
Shigella flexneri, Salmonella typhi, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Bacillus pumilus, Bacillus subtilis, Bacillus cereus, Sarcina lutea With regard to Pseudomonas aeruginosa isolated from samples obtained at Intensive Care Unit, MA solution showed its germicide similarly Conversely, the baterium kept with its powerful growth when the drug at doses below 5% was applied on The skin irritation grade was at zero Conclusions: The drug showed good antimicrobial activities on some bacteria species including Pseudomonas aeruginosa isolated from our hospital
It had no skin irritation when applied on experimental rabbits
* Key words: Mafenide acetate; Antibacterial activities; Skin irritation
* Viện Bỏng Qu c gia
** Học viện Quân y
Người phản hồi (Corresponding): Lương Quang Anh (luongquanganh@vmmu.edu.vn)
Ngày nhận bài: 27/05/2015; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 09/09/2015
Ngày bài báo được đăng: 18/09/2015
Trang 2ĐẶT VẤN ĐỀ
Tại Việt Nam, nhiễm khuẩn trong bỏng
đang trở thành vấn đề lớn, ảnh hưởng
trực tiếp đến chất lượng điều trị bệnh
nhân (BN), nhất là trong tình trạng còn
thiếu các thuốc kháng khuẩn tại chỗ thực
sự có hiệu quả Trong đó, trực khuẩn mủ
xanh là VK Gram âm hàng đầu gây nhiễm
khuẩn bệnh viện, đặc biệt ở các BN bỏng
Điều trị vết thương, vết bỏng nhiễm trực
khuẩn mủ xanh rất khó khăn vì VK này có
khả năng đề kháng cao đối với hầu hết
các thuốc kháng sinh, đặc biệt là các
chủng đa kháng kháng sinh, làm tăng chi
phí điều trị cũng như làm tăng tỷ lệ tử
vong ở BN bỏng [1, 2, 3]
MA là thuốc thuộc nhóm sulfamid đã
được sử dụng ở các trung tâm điều trị
bỏng trên thế giới Đây là thuốc có độ an
toàn cao, hiệu quả diệt khuẩn tốt, trong
đó có trực khuẩn mủ xanh MA chủ yếu
sử dụng dưới dạng dung dịch và dạng
kem, dùng đơn lẻ hoặc kết hợp với một
thuốc kháng khuẩn khác Viện Bỏng Quốc
gia đã bào chế thành công dung dịch MA
5% đạt tiêu chuẩn cơ sở Vì vậy, nghiên
cứu này được thực hiện nhằm: Bước đầu
đánh giá tác dụng háng huẩn in vitro và
tính ích ứng da của chế phẩm, làm cơ
sở hoa học cho việc ứng dụng chế phẩm
này trong điều trị BN bỏng
NGUYÊN VẬT LIỆU, ĐỐI TƯỢNG VÀ
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
1 Nguyên vật liệu và đối tượng
nghiên cứu
* Nguyên vật liệu:
- Dung dịch MA 5% do Viện Bỏng Quốc
gia sản xuất, đạt tiêu chuẩn cơ sở
- Thuốc đối chiếu: streptomycin sulfat
16 IU/ml đối với thử kháng khuẩn VK Gram (-), benzathin penicillin 20 IU/ml đối với thử kháng khuẩn VK Gram (+) Môi trường canh thang nuôi cấy vi sinh vật gồm: NaCl 0,5%, pepton 0,5%, cao thịt 0,3%, nước vừa đủ 100 ml Môi trường thạch thường gồm: NaCl 0,5%, pepton 0,5%, cao thịt 0,3%, thạch 1,6%, nước vừa đủ
100 ml
* Đ i tượng nghiên cứu:
- Chủng vi sinh vật kiểm định do Bộ môn Vi sinh - Sinh học, Đại học Dược
Hà Nội cung cấp, bao gồm: VK Gram (-):
Escherichia coli (EC), Proteus mirabilis (Pro), Shigella flexneri (Shi), Salmonella typhi (Sal), Pseudomonas aeruginosa (Pseu)
VK gram (+): Staphylococcus aureus (SA), Bacillus pumilus (BP), Bacillus subtilis (BS), Bacillus cereus (BC), Sarcina lutea (Sar)
- Phân lập chủng trực khuẩn mủ xanh
từ mẫu bệnh phẩm tại Khoa Hồi sức Cấp cứu, Viện Bỏng Quốc gia 6 thỏ đực khỏe mạnh, cân nặng 2.000 ± 100 g, đạt tiêu chuẩn thí nghiệm
2 Phương pháp nghiên cứu
* Phương pháp đánh giá tác dụng háng huẩn in vitro:
- Xác định vòng vô khuẩn của chế phẩm bằng phương pháp khuếch tán trên thạch đối với một số chủng VK quốc tế
+ Tiến hành: các khoanh giấy lọc vô trùng được tẩm 3 lần với dung dịch mẫu thử, sấy ở nhiệt độ < 60oC đến khô hết dung môi Cấy vi sinh vật kiểm định vào môi trường canh thang, nuôi cấy cho phát triển trong tủ ấm 37oC từ 18 - 24 giờ đến nồng độ 107 tế bào/ml Môi trường thạch thường vô trùng (làm lạnh về 45 - 500C)
Trang 3được cấy vi sinh vật kiểm định với tỷ lệ
2,5 ml/100 ml Lắc tròn để vi sinh vật
phân tán đều trong môi trường thạch
thường, đổ vào đĩa petri vô trùng với thể
tích 20 ml/đĩa, để thạch đông lại Khoanh
giấy lọc đã tẩm chất thử đặt lên bề mặt
môi trường thạch thường chứa vi sinh vật
theo sơ đồ định sẵn Ủ các đĩa petri có
mẫu thử trong tủ ấm ở nhiệt độ 37oC
trong 18 - 24 giờ Đọc kết quả, đo đường
kính vòng vô khuẩn bằng thước kẹp
Panmer có độ chính xác 0,02 mm
+ Đánh giá kết quả: dựa vào đường
kính vòng vô khuẩn và đánh giá theo công
thức sau:
D
=
n
D
n
i
i
1 SD =
1
) (
1
2
n D
n
i
D
: Đường kính trung bình vòng vô
khuẩn, Di: Đường kính vòng vô khuẩn
SD: Độ lệch thực nghiệm chuẩn có hiệu
chỉnh, n: Số thí nghiệm làm song song
- Xác định vòng vô khuẩn của chế phẩm
bằng phương pháp khuếch tán trên thạch
đối với Pseudomonas aeruginosa phân
lập tại Viện Bỏng Quốc gia
* Tiến hành: tạo một lỗ có đường kính
10 mm trên bề mặt đĩa thạch Đổ dung
dịch thử vào lấp đầy lỗ trên bề mặt môi
trường thạch thường chứa Pseudomonas
aeruginosa đã phân lập từ mẫu bệnh phẩm
tại Khoa Hồi sức Cấp cứu, Viện Bỏng
Quốc gia theo sơ đồ định sẵn Ủ các đĩa
petri có mẫu thử trong tủ ấm ở nhiệt độ
37oC trong 24 giờ Sau đó, lấy các đĩa petri
ra đọc kết quả Đo đường kính vòng vô
khuẩn bằng thước chia độ tính bằng mm
- Xác định sơ bộ sự phát triển của
Pseudomonas aeruginosa phân lập tại Viện Bỏng Quốc gia khi tiếp xúc với thuốc
ở các nồng độ khác nhau
Từ dung dịch MA 5%, tiến hành pha các dung dịch MA có nồng độ giảm dần tương ứng với nồng độ 1/2, 1/4, 1/8, 1/16
và 1/32 so với nồng độ MA 5% Hút chính xác 1 ml dung dịch này cho vào ống nghiệm chứa 100 µl hỗn dịch chứa 108
VK/ml Cấy hỗn dịch VK và thuốc vào các đĩa petri thạch thường, để trong tủ ấm ở nhiệt
độ 370C trong 24 giờ Sau đó, lấy các đĩa petri ra để theo dõi sự phát triển của VK trên các đĩa thạch tương ứng với VK tiếp xúc với thuốc ở nồng độ khác nhau
* Phương pháp đánh giá tính ích ứng
da trên thỏ thực nghiệm:
- Thử nghiệm tiến hành trên 6 thỏ Trên mỗi thỏ, mỗi bên tại vùng da lưng đã cạo, đắp thuốc thử dạng dung dịch Bên phải đặt thuốc thử nghiệm, bên trái đặt dung dịch natri clorid 0,9% Nhúng đều lượng thuốc thử vào gạc đã tiệt trùng có diện tích 2,5 x 2,5 cm Áp gạc có thuốc thử vào vùng da định thử (đã cạo sạch lông) Cố định miếng gạc trong 4 giờ để đảm bảo miếng gạc luôn áp vào da thỏ Sau 4 giờ, bóc gạc, rửa sạch vùng da bằng nước cất Nhận định kết quả sau 4,
24, 48, 72 giờ đắp thuốc
Đánh giá phản ứng trên chỗ da đặt thuốc xem mức độ kích ứng gây ban đỏ hoặc phù theo thang điểm được quy định sẵn như sau:
- Đánh giá phản ứng của da ở trạng thái gây ban đỏ, có vẩy xước (A)
Không có ban đỏ: 0 điểm; ban đỏ rất nhẹ:
1 điểm; ban đỏ nhận thấy rõ: 2 điểm; ban đỏ
Trang 4vừa phải đến nghiêm trọng: 3 điểm; ban
đỏ có vẩy xước nhẹ: 4 điểm
- Đánh giá phản ứng của da ở trạng
thái phù nề (B)
Không phù nề: 0 điểm; phù nề nhẹ:
1 điểm; phù nề nhẹ có viền phồng:
2 điểm; phù nề vừa phải có viền phồng:
3 điểm; phù nề nghiêm trọng (viền phồng
≥ 1 mm): 4 điểm
- Đánh giá kết quả: lấy trung bình của
2 điểm A và B là điểm kích ứng da của chế phẩm Chế phẩm đạt yêu cầu về
độ kích ứng da có điểm kích ứng da bằng 0
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN
1 Kết quả đánh giá tác dụng kháng khuẩn in vitro
* K ết quả xác định vòng vô khuẩn trên các chủng VK qu c tế:
Tiến hành đo vòng vô khuẩn khi cho thuốc tiếp xúc với các chủng VK quốc tế
Bảng 1: Kết quả đo vòng vô khuẩn của dung dịch MA trên các chủng VK
VI SINH VẬT MẪU D ˉ(mm) s VI SINH VẬT MẪU D ˉ(mm) s
Pseu 2 11,02 0,03 SA 2 10,37 0,65
3 9,29 0,21 3 10,91 0,28
4 3,02 0,12 4 10,00 0,41
5 0,00 0,00 5 0,00 0,00 Chuẩn 10,29 0,24 Chuẩn 15,51 0,37 Pro 2 11,53 0,38 BS 2 17,04 0,54
3 KK 3 18,72 0,72
4 KK 4 21,27 0,52
5 KK 5 18,83 0,31 Chuẩn KK Chuẩn 23,70 0,42 Shi 2 14,07 0,21 BP 2 13,03 0,05
3 11,19 0,80 3 13,87 0,33
4 10,63 0,26 4 3,15 0,26
5 8,03 0,05 5 11,27 0,19 Chuẩn 10,43 0,49 Chuẩn 17,00 0,14 Sal 2 8,97 0,53 Sar 2 14,39 0,29
3 8,80 0,51 3 16,43 0,42
4 8,54 0,04 4 14,20 0,86
5 8,13 0,10 5 9,33 0,24 Chuẩn 12,53 0,23 Chuẩn 25,57 0,45
Trang 5EC 2 KK BC 2 10,57 0,46
3 KK 3 8,30 0,20
4 KK 4 11,13 0,09
5 KK 5 0,00 0,00 Chuẩn 17,00 0,82 Chuẩn 21,83 0,85
(Ghi chú: KK: kìm khu ẩn)
Dung dịch bào chế có tác dụng trên nhiều chủng VK nhƣ: Shigella flexneri, Salmonella
typhi, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Bacillus pumilus, Bacillus subtilis, Bacillus cereus và Sarcina lutea Trong đó, đáng chú ý là thuốc đều có tác dụng
kháng VK Pseudomonas aeruginosa và Staphylococcus aureus Đây là 2 chủng VK
hay gặp trên vết bỏng Kết quả này phù hợp với nhiều nghiên cứu về MA [4, 6] Ngoài
ra, thuốc chỉ có tác dụng kìm khuẩn đối với VK Escherichia coli, Proteus mirabilis
Hình 1a: Vòng vô khuẩn trên
Pseudomonas aeruginos
Hình 1b: Vòng vô khuẩn trên
Staphylococcus aureus
Hình 1: Hình ảnh vòng vô khuẩn của dung dịch MA trên một số chủng VK
(Ghi chú: Mẫu chuẩn: Ở vị trí điểm 0 giờ
Mẫu 2, 3, 4 (từ trái qua phải tính từ mẫu chuẩn): mẫu thử dung dịch MA)
* Kết quả đánh giá tác dụng kháng khuẩn
trên chủng VK phân lập được tại bệnh viện:
Kết quả xác định vòng vô khuẩn trên
chủng VK phân lập tại Viện Bỏng Quốc gia:
Lấy mẫu bệnh phẩm từ Khoa Hồi sức
Cấp cứu, Viện Bỏng Quốc gia và phân lập
Pseudomonas aeruginosa Đây là chủng
VK bệnh viện, có khả năng đề kháng cao
với thuốc kháng khuẩn
* Giá tr ị vòng vô khuẩn của dung dịch
MA trên Pseudomonas aeruginosa phân
lập tại Viện Bỏng Qu c gia:
Mẫu 1: 5,0 mm; mẫu 2: 7,0 mm; mẫu 3:
7,0 mm
Nhƣ vậy, dung dịch MA có tác dụng kháng khuẩn đối với Pseudomonas
aeruginosa phân lập tại Viện Bỏng Quốc gia Đáng chú ý, đây là chủng VK gặp tại khoa Hồi sức Cấp cứu, vì vậy có thể sử dụng chế phẩm này trong điều trị BN bỏng nặng với mục đích dự phòng nhiễm trực khuẩn mủ xanh
Trang 6Hình 2: Hình ảnh vòng vô khuẩn của dung
dịch MA trên Pseudomonas aeruginosa
phân lập tại Viện Bỏng Quốc gia
- Xác định sơ bộ sự phát triển của
Pseudomonas aeruginosa phân lập tại
Viện Bỏng Quốc gia khi tiếp xúc với thuốc
ở các nồng độ khác nhau
Trên thế giới, dung dịch MA 2,5% được
một số tác giả sử dụng với mục đích đảm
bảo hiệu quả điều trị, góp phần làm giảm chi
phí cho người bệnh [5] Để đánh giá hiệu
quả kháng khuẩn của dung dịch MA có
nồng độ < 5%, chúng tôi tiến hành xác
định sơ bộ sự phát triển của chủng trực
khuẩn mủ xanh phân lập tại Viện Bỏng
Quốc gia khi tiếp xúc với các dung dịch
thuốc có nồng độ giảm dần pha chế từ
dung dịch MA 5% ban đầu
Hình 3a1: Dung dịch MA nồng độ 1/1
Hình 3a2: Dung dịch MA nồng độ 1/2
Hình 3b1: Dung dịch MA nồng độ 1/4
Hình 3b2: Dung dịch MA nồng độ 1/8
Hình 3c1: Dung dịch MA nồng độ 1/16
Hình 3c2: Dung dịch MA nồng độ 1/32
Hình 3: Hình ảnh phát triển của Pseudomonas aeruginosa phân lập tại Viện Bỏng Quốc gia khi tiếp xúc với thuốc có nồng độ khác nhau
Trang 7Khi nồng độ của dung dịch MA 5% giảm,
hiệu quả khỏng khuẩn giảm, thậm chớ hầu
như khụng cũn khả năng khỏng khuẩn (VK
phỏt triển xõm kớn bề mặt thạch) Điều này
được lý giải do sức đề khỏng của chủng
VK bệnh viện cao và chỉ nhạy cảm với
dung dịch MA 5% được điều chế ở trờn
2 Kết quả đỏnh giỏ tớnh ớch ứng da
trờn thỏ thực nghiệm
Kết quả da trờn da lưng bỡnh thường
của thỏ thực nghiệm
Bảng 2: Điểm đỏnh giỏ chỉ tiờu kớch ứng
da của dung dịch MA trờn thỏ thực nghiệm
Số
thứ tự
điểm ban
đỏ
điểm phù nề
điểm trung bình
Dung dịch MA 5% khụng gõy kớch ứng
da trờn cả 6 thỏ khỏe mạnh Tuy nhiờn,
khi sử dụng trờn da bị tổn thương, cần
phải theo dừi tỏc dụng kớch ứng của chế
phẩm này, mặc dự giỏ trị pH khỏ trung
tớnh (khoảng 6,8) Một số hỡnh ảnh của thớ
nghiệm thử kớch ứng trờn da lưng của thỏ
thực nghiệm được mụ tả ở hỡnh 4
Hỡnh 4a1: Thời điểm 0 giờ thuốc chứng
Hỡnh 4a2: Thời điểm 72 giờ thuốc chứng
Hỡnh 4b1: Thời điểm 0 giờ thuốc thử
Hỡnh 4b2: Thời điểm 72 giờ thuốc thử
Hỡnh 4: Hỡnh ảnh thử tỏc dụng kớch ứng của dung dịch MA trờn da lưng thỏ thực nghiệm
KẾT LUẬN
Từ kết quả nghiờn cứu trờn, chỳng tụi rỳt ra một số kết luận:
- Dung dịch MA 5% cú tỏc dụng kỡm
khuẩn đối với Escherichia coli, Proteus
Trang 8mirabilis Có tác dụng kháng khuẩn đối
với Shigella flexneri, Salmonella typhi,
Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus
aureus, Bacillus pumilus, Bacillus subtilis,
Bacillus cereus và Sarcina lutea trên in vitro
- Dung dịch MA 5% có tác dụng kháng
khuẩn đối với Pseudomonas aeruginosa
phân lập tại Viện Bỏng Quốc gia trên in
vitro VK này vẫn phát triển mạnh khi tiếp
xúc với dung dịch MA có nồng độ < 5%
- Dung dịch MA 5% không gây kích
ứng trên da lưng bình thường của thỏ
thực nghiệm
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1 Nguy n Như Lâm, Lê Đức Mẫn Nghiên
cứu căn nguyên nhiễm khuẩn và mức độ
kháng kháng sinh tại Khoa Hồi sức Cấp cứu,
Viện Bỏng Quốc gia Tạp chí Y học thảm họa
và Bỏng 2009, 4, tr.56-62
2 Lê Đức Mẫn Nghiên cứu một số yếu tố
nguy cơ và biện pháp điều trị dự phòng nhiễm
khuẩn huyết bỏng tại Viện Bỏng Quốc gia
Luận án Tiến sỹ Y học Học viện Quân y Hà Nội
2007
3 Lê Năm và CS Sơ cứu, cấp cứu và
điều trị bỏng NXB Y học 2006
4 Hashemi B et al Comparison between
topical honey and mafenide acetate in treatment
of auricular burn Am J Otolaryngology 2011, 32,
pp.28-31
5 Ibrahim A et al A simple cost-saving
measure: 2.5% mafenide acetate solution
J Burn Care Res, online 2013
6 Japoni A et al Pseudomonas aeruginosa:
Burn infection, treatment and antibacterial
resistance IRC Med J 2009, 11 (3), pp.244-253