Nghiên cứu được thực hiện với mục tiêu nhằm ứng dụng thành công kỹ thuật PCR định lượng huỳnh quang phát hiện dị bội NST 13, 18, 21, X, Y trong các mẫu dịch ối. Mời các bạn cùng tham khảo bài viết để nắm rõ nội dung chi tiết của đề tài nghiên cứu này.
Trang 1TRONG CHẨN ĐOÁN TRƯỚC SINH NHANH PHÁT HIỆN
BẤT THƯỜNG SỐ LƯỢNG NHIỄM SẮC THỂ Ở NGƯỜI
Hoàng Hiếu Ngọc*, Phạm Thị Huyền Trang**, Phạm Hùng Vân**, Nguyễn Vạn Thông***,
Khổng Hiệp***
TÓM TẮT
Đặt vấn đề: Vài năm trở lại đây, nhiều kỹ thuật sinh học phân tử mới được phát triển với mục đích phát
hiện các bất thường số lượng các nhiễm sắc thể và giúp chẩn đoán trước sinh các thai kỳ nguy cơ với thời gian nhanh hơn mà vẫn đảm bảo độ chính xác như kỹ thuật làm nhiễm sắc thể đồ. Xuất phát từ nhu cầu trên, nhóm nghiên cứu của chúng tôi tiến hành ứng dụng kỹ thuật PCR định lượng huỳnh quang (QF – PCR) để chẩn đoán nhanh bất thường số lượng nhiễm sắc thể 13, 18, 21, X, Y ở người.
Mục tiêu: Ứng dụng thành công kỹ thuật PCR định lượng huỳnh quang phát hiện dị bội NST 13, 18, 21,
X, Y trong các mẫu dịch ối.
Phương pháp: Tách chiết DNA từ các mẫu dịch ối của các thai kỳ nguy cơ (bất thường double test, triple
test) và có chỉ định của bác sĩ lâm sàng. Sau đó, thực hiện phản ứng PCR định lượng huỳnh quang và cuối cùng điện di sản phẩm khuếch đại trên hệ thống điện di mao quản. Dữ liệu thô thu được sẽ được phân tích trên phần mềm chuyên dụng để tìm ra bất thường trong mẫu ối.
Kết quả: Từ tháng 03/2010 đến tháng 01/2011 chúng tôi thu thập được 64 mẫu ối từ thai kỳ nguy cơ.
Trong đó phát hiện được 10 trường hợp bất thường (16,9%). Các kết quả này đều tương đồng với kết quả nhiễm sắc thể đồ được thực hiện song song tại bệnh viện Hùng Vương.
Kết luận: Bằng việc ứng dụng kỹ thuật QF‐PCR, chúng tôi đã xây dựng thành công qui trình xét nghiệm
chẩn đoán bất thường số lượng nhiễm sắc thể với độ chính xác cao và tiết kiệm thời gian, cung cấp một phương tiện chẩn đoán cho bác sĩ sản khoa trong việc xác định bất thường số lượng nhiễm sắc thể ở những thai kỳ nguy
cơ cao.
Từ khóa: QF‐PCR, chẩn đoán trước sinh, dị bội thể
ABSTRACT
RAPID PRENAL DIAGNOSIS BY QUANTITATIVE FLUORESCENT POLYMERASE
CHAIN REACTION TO DETECT HUMAN ANEUPLOIDIES IN AMNIOTIC FLUIDS
Hoang Hieu Ngoc, Pham Thi Huyen Trang, Pham Hung Van, Nguyen Van Thong, Khong Hiep,
* Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 18 ‐ Supplement of No 1 ‐ 2014: 144 ‐ 149
Background: Previously, aneuploidies were usually diagnosed by karyotype. But this technique is time
consuming and hardly avoid the concern for pregnant women. Based on the development of molecular biology in medicine, we apply quantitative fluorescent polymerase chain reaction technique (QF‐PCR) to detect aneuploidies
in amniotic fluids from high risk pregnancy with reducing time.
Objective: Detecting aneuploidies in amniotic fluids from high risk pregnancy.
Method: DNA from amniotic cells were extracted and then performed QF‐PCR. The fluorescent‐labeled
amplicons were detected by capillary electrophoresis system. Then, these raw data were analyzed by specific software.
* Bộ môn Hoá Sinh, Khoa Y, Đại học Y Dược TPHCM, ** Công ty Nam Khoa, *** Bệnh viện Phụ Sản Hùng Vương
Trang 2Results: From 03/2010 to 01/2011, we have 64 amniotic fluid samples. There are 10 cases (16.9%) with
aneuploidies including 3 cases of trisomy 21, 3 cases of trisomy 18, 1 case of Turner syndrome, 3 cases of Klinfelter syndrome. These results share the similarity of karyotype that also performed simultaneously at Hung Vuong Hospital.
Conclusions: By applying QF‐PCR, we have built up the examination to detect aneuploidies from amniotic
fluids successfully. Since, we open up the new trend of rapid prenatal diagosis in Vietnam.
Keywords: QF‐PCR, prenatal diagnosis, aneuploidy.
ĐẶT VẤN ĐỀ
Bất thường số lượng nhiễm sắc thể là
nguyên nhân thường gặp nhất của dị tật bẩm
sinh, ảnh hưởng lên 1 trong 165 trẻ sơ sinh(7). Sự
bất thường nhiễm sắc thể ảnh hưởng lên thai kỳ,
gây dị tật bẩm sinh hoặc sẩy thai. Khoảng một
nửa các trường hợp sẩy thai tự nhiên ở ba tháng
đầu là do nguyên nhân nhiễm sắc thể. Bất
thường nhiễm sắc thể phát hiện bằng chọc ối
chiếm 30 – 35% theo sau việc siêu âm thấy bất
thường(11, 14). Bất thường nhiễm sắc thể được chia
thành bất thường về cấu trúc và số lượng nhiễm
sắc thể. Bất thường về số lượng có thể là thêm
hẳn một bộ nhiễm sắc thể (đa bội) hoặc là thừa,
thiếu một nhiễm sắc thể (dị bội) thì gặp nhiều
hơn là bất thường về cấu trúc nhiễm sắc thể ‐
chiếm đến khoảng 95% các trường hợp(13).
Các trường hợp đa bội có thể là do rối loạn
trong quá trình phân chia của trứng hay thường
gặp hơn là 2 tinh trùng được thụ tinh vào cùng
một trứng. Trái lại, dị bội vẫn là do không phân
ly nhiễm sắc thể trong quá trình tạo giao tử của
trứng, cho thấy nguyên nhân liên quan đến tuổi
mẹ cao là chủ yếu. Đa số các trường hợp thụ thai
tam bội là do một trứng được thụ tinh với hai
tinh trùng. Vì vậy, thể tam bội thường có dạng
nhiễm sắc thể đồ là 69,XXX; 69,XXY; hay
69,XYY. Hầu hết các thai kỳ tam bội đều bị sẩy
vào ba tháng đầu hoặc thời điểm đầu của ba
tháng giữa. Khoảng 7% trường hợp sẩy thai xác
định trên lâm sàng là do tam bội. Lượng alpha –
fetoprotein trong huyết thanh mẹ thường được
lượng giá cho thai kỳ nghi ngờ tam bội(10).
Dị bội nhiễm sắc thể thường là dư hay
thiếu một chiếc nhiễm sắc thể (nhiễm sắc thể
thường hay nhiễm sắc thể giới tính) gây ra
dạng trisomy hay monosomy. Hấu hết các dạng trisomy nhiễm sắc thể thường hay một vài loại trisomy của nhiễm sắc thể X là do không phân ly nhiễm sắc thể trong quá trình tạo trứng và tỉ lệ mắc các loại bất thường nhiễm sắc thể này thường liên quan đến tuổi
mẹ(9). Đối với hội chứng Kleinfelter 47, XXY thì
tỉ lệ không phân ly nhiễm sắc thể ở tế bào trứng hay tinh trùng thì chiếm tỉ lệ bằng nhau,
có khi tỉ lệ gặp ở tinh trùng chiếm tỉ lệ hơi cao hơn (57%). Không giống như trisomy các loại nhiễm sắc thể thường khác, monosomy X lại thường gặp ở những phụ nữ trẻ(13).
Vài năm trở lại đây, nhiều kỹ thuật sinh học phân tử mới được phát triển với cùng một mục đích phát hiện các bất thường số lượng các nhiễm sắc thể và giúp chẩn đoán trước sinh các thai kỳ nguy cơ với thời gian nhanh hơn mà vẫn đảm bảo độ chính xác như kỹ thuật làm nhiễm sắc thể đồ. Hiện tại, kỹ thuật QF – PCR được dùng trong chẩn đoán nhanh bất thường số lượng nhiễm sắc thể 13, 18, 21, X, Y ở người. Trong phạm vi nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành ứng dụng kỹ thuật trên để chẩn đoán bất thường dị bội thể 13, 18, 21, X, Y trên các mẫu ối được thu thập tại thành phố Hồ Chí Minh. Từ
đó, đánh giá khả năng phát triển của kỹ thuật chẩn đoán trước sinh nhanh này tại Việt Nam.
ĐỐI TƯỢNG ‐ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Mẫu bệnh phẩm
Mẫu dịch ối từ các thai kỳ nguy cơ có chỉ định chọc ối làm nhiễm sắc thể đồ từ bác sĩ lâm sàng. Mẫu được để ở nhiệt độ 2 – 8oC cho đến khi làm xét nghiệm. Tiêu chuẩn loại trừ là mẫu
đã được trữ đông.
Trang 3Phương pháp tách chiết DNA được thực
hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Lấy 1000
μl dịch ối cho vào 1 tube Eppendorf, ly tâm
14.000 rpm trong 3 phút để làm lắng tế bào ối.
Dịch nổi được bỏ đi, thêm vào 200 μl PBS để
thuần nhất tế bào ối trở lại. Sau đó, chúng tôi sử
dụng bộ tách chiết DNA bằng kit thương mại
QIAGEN DNA Blood Mini kit. Nồng độ DNA
thích hợp cho phản ứng QF‐PCR là 1 – 10 ng nên
sau khi đo nồng độ DNA, có thể tiến hành pha
loãng nếu DNA mẫu có nồng độ cao hơn tiêu
chuẩn đề ra.
Thực hiện kỹ thuật QF‐PCR.
Kỹ thuật QF – PCR giúp khuếch đại, phát
hiện, phân tích trình tự đoạn lặp lại ngắn (STR)
nằm trên các cặp nhiễm sắc thể 13, 18, 21, X, Y
dựa trên các cặp mồi đặc hiệu được thiết kế sao
cho vùng trình tự lặp lại được nằm giữa hai đoạn mồi xuôi và ngược. Ngoài ra, ở đầu ở của các đoạn mồi xuôi cũng được gắn thêm các màu huỳnh quang nhằm giúp phát hiện sản phẩm khuếch đại bằng phương pháp điện di mao quản. Trong giai đoạn lũy thừa sớm của phản ứng khuếch đại, lượng sản phẩm khuếch đại được tạo ra tỉ lệ với lượng DNA có trong mẫu ban đầu. Yếu tố tiên quyết cho sự thành công của kỹ thuật là lượng DNA thích hợp cho vào trong một phản ứng và số chu kỳ nhiệt của phản ứng PCR.
Chúng tôi sử dụng bộ kit AneufastTM QF – PCR kit của hãng Molgentix gồm có 6 loại master mix là S1, S2, MXY, M13, M18, M21 khuếch đại các marker trên từng loại nhiễm sắc thể như sau:
Bảng 1: Các loại dấu ấn được sử dụng trong bộ kit QF‐PCR
D21S1446 DXYS218 HPRT D21S1437* D18S858* D13S742*
D13S305 D21S1411 DXS6803* D21S1008* D18S1002*
D18S535 D21S1435 DXS6809*
D18S391 D13S634 DXS8377*
D13S258
D18S386
D18S390
Hai bộ mix S1, S2 cho phép phân tích đồng
thời bốn dấu ấn của mỗi nhiễm sắc thể số 13,
21, 18, hai trình tự lặp lại ngắn trên giả nhiễm
sắc thể thường (X22, DXY218), Amelogenin
(AMXY) và SRY. Sau khi chạy PCR trên 2 loại
mix S1, S2, sản phẩm khuếch đại sẽ được trộn
chung và điện di mao quản cùng một lượt. Bốn
loại master mix còn lại (còn gọi là dấu ấn phụ)
dùng để chạy bổ sung khi kết quả phân tích
S1S2 cho biết bốn dấu ấn của từng loại nhiễm
sắc thể đều ở dạng đồng hợp. Khi đó, kết quả
của marker phụ tương ứng sẽ cho kết quả rõ
ràng hơn hoặc là củng cố thêm kết quả bất
thường có được từ phân tính S1S2. QF‐PCR
được thực hiện theo chu kỳ nhiệt như sau:
hoạt hóa men Taq polymerase 95oC/15 phút, biến tính 95oC/40 giây, bắt cặp 60oC/90 giây, kéo dài 72oC/40 giây, kéo dài cuối cùng
60oC/60 phút. Sản phẩm có thể được giữ ở 4oC đến khi bắt đầu điện di mao quản.
Điện di mao quản sản phẩm khuếch đại.
Sản phẩm QF – PCR là những đoạn DNA có chiều dài khác nhau, được đánh dấu huỳnh quang ở một mạch đơn theo nguyên tắc như sau: Nếu chiều dài đoạn DNA khác nhau giữa các dấu ấn thì màu huỳnh quang giống nhau.
Nếu chiều dài DNA được khuếch đại giống nhau ở hai loại dấu ấn khác nhau thì sẽ đánh dấu bằng các màu huỳnh quang khác nhau. Khi điện di, đoạn ngắn sẽ chạy đển đầu đọc laser
Trang 4trước và đoạn dài sẽ chạy đến sau. Tín hiệu
được ghi nhận bằng phần mềm chuyên dụng
Data Collection Version 3.0 của hãng ABI.
Phân tích kết quả QF‐PCR.
Sử dụng phần mềm phân tích Gene Marker
phiên bản 1.91. Mẫu được xem là đạt khi xuất
hiện đủ các tín hiệu của thang chuẩn, phân tích
rõ các tín hiệu của các đoạn khuếch đại, cường
độ huỳnh quang cao. Phần mềm sẽ tính toán
dựa trên diện tích và cường độ huỳnh quanh để
tính ra tỉ lệ của các dấu ấn tương ứng của từng
loại nhiễm sắc thể 13, 18, 21, X, Y. Mẫu được
xem là không đạt khi không xuất hiện đầy đủ
các tín hiệu của thang chuẩn hay các tín hiệu
huỳnh quang khuếch đại của dấu ấn các allele bị
thiếu.
KẾT QUẢ
Từ tháng 03/2010 đến tháng 01/2011 chúng
tôi thu thập được 64 mẫu ối từ thai kỳ nguy cơ.
Trong đó phát hiện được 10 trường hợp bất thường (16,9%). Tỉ lệ thực hiện kỹ thuật QF – PCR thành công là 100% trên tất cả 64 mẫu dịch
ối. Tất cả 64 mẫu này khi được ly trích DNA tế bào ối, thực hiện phản ứng QF – PCR và điện di mao quản cho tín hiệu huỳnh quang đẹp. Thực hiện chế độ phân tích bằng phần mềm GeneMarker phiên bản 1.91 đều thành công với
64 mẫu.
Trong số 64 mẫu được thực hiện QF – PCR,
có 26 mẫu cho kết quả là nữ bình thường chiếm
tỉ lệ 40,6%, 29 mẫu cho kết quả là nam bình thường chiếm tỉ lệ 45,3%. QF – PCR đã phát hiện được 10 trường hợp bất thường gồm 3 mẫu trisomy 21, 3 mẫu mang hội chứng Klinefelter (XXY), 3 mẫu trisomy 18 (hội chứng Edward), 1 mẫu phát hiện monosomy X (hội chứng Turner). Khi so sánh với kết quả nhiễm sắc thể đồ thì chúng tôi thấy QF‐PCR đạt độ nhạy và độ đặc hiệu là 100%.
Hình 1: Kết quả trisomy 21 của một mẫu ối được thực hiện bằng kỹ thuật QF‐PCR
Trang 5Hình 2: Kết quả trisomy 21 trên dấu ấn phụ
Bảng 2: Kết quả so sánh giữa QF‐PCR và nhiễm sắc thể đồ
(40,6%) 29 (45,3%) 3(4,7%) 3(4,7%) 1 (1,6%) 3(4,7%)
Nhiễm sắc thể đồ 64 26 (40%) 29 (45%) 3(4,7%) 3(4,7%) 1 (1,6%) 3 (4,7%)
BÀN LUẬN
Chúng tôi đã thực hiện kỹ thuật QF‐PCR cho
kết quả tương đồng với kỹ thuật nhiễm sắc thể
đồ 100%. Đồng thời, kỹ thuật QF‐PCR đưa ra kết
quả nhanh và đáng tin cậy trong vòng 24 giờ.
Những bất thường dị bội thể thường gặp đã
được phát hiện thành công trong tất cả các mẫu.
Các thao tác trong kỹ thuật QF khá đơn giản,
thực hiện nhanh. Vì vậy, ưu điểm đầu tiên của
kỹ thuật QF là ít tốn thời gian hơn so với kỹ
thuật nhiễm sắc thể đồ.
Kỹ thuật QF cơ bản được dựa trên là kỹ
thuật PCR kinh điển trong đó cải tiến thêm về
khả năng khuếch đại được nhiều loại DNA đích
khác nhau trong 1 phản ứng PCR đồng thời các
loại mồi xuôi được đánh dấu bởi các màu huỳnh
quanh khác nhau giúp phát hiện được sản phẩm
khuếch đại bằng hệ thống điện di mao quản và
phân biệt từng nhóm sản phẩm khuếch đại dựa
trên màu huỳnh quang và chiều dài đoạn khuếch đại. Kết quả điện di phát hiện các đỉnh huỳnh quang được ghi nhận bằng phần mềm đọc tín hiệu chuyên dụng. Bên cạnh đó, phần mềm phân tích (GeneMarker phiên bản 1.91) giúp ta tính toán được cường độ màu huỳnh quang và diện tích các đỉnh từ đó tính ra được tỉ
lệ bình thường hay bất thường của mẫu. Điều này giúp cho việc nhận định kết quả QF vô cùng khách quan, không phụ thuộc vào cái nhìn cảm quan của người làm thí nghiệm.
Dịch ối có đôi khi không tránh khỏi bị lẫn tế bào máu mẹ; tùy thuộc vào lượng máu mẹ bị nhiễm vào nhiều hay ít mà kết quả QF không hoặc có thể sai lệch. Nếu lượng máu mẹ nhiễm chỉ chiếm khoảng dưới 20% tổng lượng tế bào ối thu thập được thì kết quả QF sẽ không bị ảnh hưởng. Đối với những mẫu ối bị nhiễm máu mẹ nhiều, ta có thể nuôi cấy để loại đi tế bào máu.
Trang 6kỹ thuật QF – PCR.
Kỹ thuật QF‐PCR chỉ khảo sát 5 loại nhiễm
sắc thể là nhiễm sắc thể số 13, 18, 21, X, Y bởi vì
tỉ lệ dị tật bẩm sinh liên quan đến bất thường số
lượng nhiễm sắc thể của 5 loại này chiếm tỉ lệ
cao nhất (95%). So với tác giả Maj A.Hulten(8) đã
thực nghiên cứu trên dịch ối bằng kỹ thuật QF‐
PCR thì kết quả của chúng tôi cũng cho thấy có
sự tương đồng về độ tin cậy, nguy cơ của việc
chẩn đoán sai là rất thấp. Một tác giả khác là
Chrysanthy Bili(1) đã tiến hành nghiên cứu trên
1100 mẫu ối thuộc dân số Hy Lạp và cũng đưa
ra được kết luận là kỹ thuật QF‐PCR rất hiệu
quả trong chẩn đoán trước sinh và nên đựa vào
thực hiện như một xét nghiệm thường qui. Tuy
nghiên cứu của chúng tôi thực hiện trên cỡ mẫu
nhỏ nhưng cũng giúp xác định ban đầu, kỹ
thuật QF‐PCR hoàn toàn có thể thực hiện được
thành công tại Việt Nam.
KẾT LUẬN
Việc ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử
vào lĩnh vực chẩn đoán trước sinh nhanh dần
trở nên hiệu quả và ngày càng được tin cậy. Kỹ
thuật QF‐PCR có độ nhạy, độ đặc hiệu và tỷ lệ
thất bại tương đương với kỹ thuật karyotype
trong chẩn đoán dị bội các nhiễm sắc thể thường
gặp nên có thể sử dụng đối với các thai phụ do
tuổi mẹ cao hay bất thường trên siêu âm mà
không cần thực hiện tầm soát sinh hoá. Với thời
gian trả kết quả ngắn trong 1 đến 2 ngày, chính
xác và khả năng tự động hoá cao, kỹ thuật QF‐
PCR có thể ứng dụng thường quy trong chẩn
đoán trước sinh để có kết quả chẩn đoán lệch bội
sớm giảm tình trạng lo lắng cho thai phụ.
Do thời gian và kinh phí có hạn nên đề tài
chỉ được thực hiện trên cỡ mẫu nhỏ và cách
chọn mẫu là thuận tiện. Tuy nhiên, kết quả thu
được chứng minh rằng đề tài đã được thực hiện
thành công. Chúng tôi mong muốn thực hiện đề
tài này với phạm vi mẫu lớn hơn trên sản phụ
Việt Nam để từ đó tìm ra những kinh nghiệm có
thể áp dụng trên người Việt Nam, nâng khả năng chẩn đoán trước sinh bằng kỹ thuật sinh học phân tử nói chung lên một tầm cao mới.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1 Bili C, Divane A, Apessos A, Konstantinos T, Apostolos A, Ioanmis B, et al (2002). Prenatal diagnosis of common aneuploidies using quantitative fluorescent PCR. Prenatal Diagnosis, 22: 360 ‐ 365.
2 Cirigliano V, Ejarque M, Canadas MP, Lloveras E, Plaja A, Perez Md, et al (2011). Clinical application of multiplex quantitative fluorescent polymerase chain reaction (QF ‐ PCR) for the rapid prenatal detection of common chromosome aneuploidies. Molecular Human Reproduction, 7: 1001 ‐ 1006.
3 Cirigliano V, Sherlock J, Conway G, Quilter C, Rodeck C, & Adinolfi M (1999). Rapid detection of chromosome X and Y aneuploidies by quantitative fluorescent PCR. Prenatal Diagnosis, 19: 1099 ‐ 1103.
4 Cirigliano V, Voglino G, Ordonez E, Marongiu A, Canadas
M, Ejarque M, et al (2009). Rapid prenatal diagnosis of common chromosome aneuploidies by QF ‐ PCR, results of 9 years of clinical experience. Prenatal Diagnosis, 29: 40 ‐ 49.
5 Dupont A, Vaeth M, Videbech P (1986). Mortality and life expectancy of Down’s synfrome in Denmark. J Ment Defic Res, 30: 111 ‐ 120.
6 Hook EB (1981). Rates of chromosomal abnormalities at different maternal ages. Obstet Gynecol, pp.58 ‐ 292.
7 Hsu LYF (1986). Prenatal diagnosis of chromosome abnormalities; in Milunsky A (ed): Genetic Disorders and the Fetus, ed 2. New York, Plenum Press,, pp 115–183.
8 Hulten NA, Dhanjal S, & Pertl B (2003). Rapid and simple prenatal diagnosis of common chromosome disorders: advantages and disadvantages of the molecular methods FISH and QF ‐ PCR. Reproduction, 126: 279 ‐ 297.
9 Kalousek DK, Barrett IJ, McGillivray BC (1989). Placental mosaicism and intrauterine survival of trisomies 13 and 18.
Am J Genet, 44(3): 338‐43
10 OʹBrien WF, Knuppel RA, Kousseff B, Sternlicht D, Nichols P (1988). Elevated maternal serum alpha ‐ fetoprotein in triploidy. Obstet Gynecol, 71: 994‐995.
11 Platt LD, DeVore GR, Lopez E, Herbert W, Falk R, Alfi O (1986). Role of amniocentesis in ultrasound detected fetal malformations. Obstet Gynecol, 68(2): 153‐155.
12 Warburton D (1987). Chromosomal causes of fetal death. Clin Obstet Gynecol, 30: 268‐277.
13 Warburton D, Kline J, Stein Z, Susser M (1980). Monosomy X.
A chromosomal anomaly associated with young maternal age. Lancet, 1: 167‐169.
14 Williamson RA, Weiner CP, Patil S, Benda J, Varner
MW, Abu‐Yousef MM. (1987). Abnormal pregnancy sonogram. Selective indication for fetal. Obstet Gynecol, 69: 15‐20.