Mục tiêu nghiên cứu của bài viết nhằm xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng doxorubicin (DOX) trong huyết tương chuột, ứng dụng trong đánh giá sinh khả dụng, tương đương sinh học của các chế phẩm chứa DOX trên thực nghiệm.
Trang 1ĐỊNH LƯỢNG DOXORUBICIN TRONG HUYẾT TƯƠNG CHUỘT
BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO
Bùi Bá Minh*
TÓM TẮT
Mục tiêu: xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng doxorubicin (DOX) trong huyết
tương chuột, ứng dụng trong đánh giá sinh khả dụng, tương đương sinh học của các chế phẩm
chứa DOX trên thực nghiệm Phương pháp: xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng
DOX trong huyết tương chuột bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) theo hướng dẫn của
FDA Kết quả: đã xây dựng được quy trình định lượng DOX bằng HPLC với các điều kiện sau:
xử lý mẫu bằng tủa protein với acetonitril; cột Gemini C18; 5 µm, 250 x 4 mm; pha động: acetonitril - amoni nitrat 0,25 g/l trong nước với tỷ lệ 30:70 (v/v); tốc độ dòng 1,0 ml/phút; detector: PDA ở 232 nm; thể tích tiêm mẫu: 10 µl; thời gian chạy: 10 phút; nội chuẩn là daunorubicin 8 µg/l Phương pháp có độ đặc hiệu, chọn lọc tốt, thời gian lưu của DOX trung bình 3,5 phút, tách biệt hơn daunorubicin với thời gian lưu trung bình 5,7 phút Mẫu trắng có đáp ứng nhỏ hơn 5% so với mẫu chuẩn và nội chuẩn Độ lặp lại tốt với độ lệch chuẩn tương đối (RSD) trong ngày từ 2,1 - 3,8 % và khác ngày từ 3,62 - 4,68% Độ đúng đạt 91,7 - 98,4% với khoảng nồng độ từ 1 - 100 µg/l Độ tuyến tính từ 1 - 100 µg/l với R2 là 0,9995 Giới hạn định lượng dưới 1 µg/l Phương pháp xử lý mẫu có hiệu suất chiết cao (94,2 - 98,8%) với RSD < 4%
Mẫu huyết tương ổn định sau 3 chu kỳ đông - rã và trong quá trình xử lý mẫu Kết luận: quy
trình có thể áp dụng được để định lượng DOX trong huyết tương chuột
* Từ khóa: Doxorubicin; Huyết tương chuột; Sắc ký lỏng hiệu năng cao
Determination of DOX Concentration in Mouse Plasma by High Performance Liquid Chromatography
Summary
Objectives: To develop and validate the method of DOX determination in mouse plasma to assess the bioavailability, the biological equivalence of the DOX-containing compositions Methods: Development and validation a method of quantifying DOX in mouse plasma by HPLC according to FDA guidelines Results: Analytical procedures: the sample is processed by precipitating the protein with acetonitrile Column gemini C 18 , 5 µm, 250 x 4 mm; mobile phase: acetonitrile - ammonium nitrate 0.25 g/L in water at a ratio of 30:70 (v/v); flow rate: 1.0 mL/min; detector: PDA at 232 nm; injection volume: 10 µL; runtime: 10 minutes; internal standard is daunorubicin 8 µg/L The method has a good selectivity, response of blank samples were 5% less than standard and internal standard samples The precision was good with RSD intra-day and inter-day during the day ranged from 2.1 to 3.8% and day to day ranged from 3.62 to 4.68%
* Bệnh viện Quân y 103
Người phản hồi (Corresponding): Bùi Bá Minh (minh_phar@yahoo.com)
Ngày nhận bài: 11/04/2017; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 07/08/2017
Ngày bài báo được đăng: 10/087/2017
Trang 2The accuracy was 91.7 - 98.4% with concentrations ranging from 1 - 100 µg/L The method has
a linearity of 1 - 100 µg/L with R 2 of 0.998 LLOQ was 1 µg/L The high extraction efficiency (94.2 - 98.8%) with RSD < 4% was obtained Plasma samples were stable after 3 cycles of freezing and during sample processing Conclusions: Analytical procedures should be applied to quantify DOX in mouse plasma
* Keywords: Doxorubicin; Mouse plasma; High performance liquid chromatography
ĐẶT VẤN ĐỀ
Y học hiện đại đang chú trọng đến
hiệu quả điều trị của thuốc đối với từng
bệnh nhân Để làm được điều này, việc
định lượng nồng độ thuốc trong máu, dịch
sinh học rất cần thiết DOX là thuốc
chống ung thư dùng phổ biến Phương
pháp định lượng DOX trong chế phẩm đã
có trong Dược điển Mỹ, nhưng chưa có
phương pháp định lượng DOX trong dịch
sinh học [4] Khó khăn của việc định
lượng trong dịch sinh học là nồng độ
thuốc thấp và ảnh hưởng của môi trường
Nghiên cứu này nhằm: Xây dựng và thẩm
định phương pháp định lượng nồng độ
DOX trong huyết tương chuột theo hướng
dẫn của FDA, ứng dụng để đánh giá sinh
khả dụng, tương đương sinh học của các
chế phẩm chứa DOX trên thực nghiệm
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU
1 Đối tượng nghiên cứu
Huyết tương chuột có chứa DOX
* Thiết bị và vật liệu:
- Hệ thống HPLC Alliance Waters 2695D,
autosampler, detector PDA Các máy ly
tâm lạnh, ly tâm thường
- Dung môi hóa chất đạt chuẩn phân
tích và chuẩn cho HPLC
- Huyết tương chuột do Ban Cung cấp Động vật Thí nghiệm, Học viện Quân y cung cấp
- Chất chuẩn DOX hydrochlorid USP
RS, lô L0K258, hàm lượng 99,8% và daunorubicin hydrochlorid USP RS, lô M1M099, hàm lượng 99,5% do Viện Kiểm nghiệm Thuốc TW cung cấp
2 Phương pháp nghiên cứu
* Xây dựng phương pháp phân tích:
- Xây dựng quy trình xử lý mẫu bệnh phẩm: khảo sát phương pháp xử lý mẫu, chiết tách DOX để định lượng
- Xác định điều kiện sắc ký: dựa vào tài liệu tham khảo và điều kiện thực tế, tiến hành khảo sát các điều kiện sắc ký: cột sắc ký, thành phần pha động, chất nội chuẩn, thể tích tiêm mẫu, thời gian tiêm mẫu để định lượng DOX trong dịch sinh học
* Thẩm định phương pháp:
Thẩm định phương pháp định lượng chất trong dịch sinh học theo hướng dẫn của FDA [3]
- Chuẩn bị:
+ Dung dịch chuẩn làm việc DOX (400 µg/ml, 200 µg/ml, 80 µg/ml, 40 µg/ml,
20 µg/ml, 8 µg/ml, 4 µg/ml) pha trong nước + Dung dịch nội chuẩn daunorubicin (DAU) có nồng độ 40 µg/ml pha trong nước
Trang 3+ Mẫu trắng: huyết tương trắng không
chứa chuẩn và nội chuẩn
+ Mẫu nội chuẩn: huyết tương trắng
không chứa chuẩn, chỉ chứa nội chuẩn
+ Mẫu chuẩn: pha loãng dung dịch
chuẩn và nội chuẩn làm việc với huyết
tương trắng để thu được các mẫu chuẩn
ở nồng độ thích hợp
+ Mẫu QC (Quality Control): mẫu QC
chuẩn bị từ dung dịch chuẩn gốc độc lập
với dung dịch chuẩn gốc dùng để pha
mẫu chuẩn
* Khảo sát các chỉ tiêu thẩm định theo
hướng dẫn của FDA:
- Tính đặc hiệu, chọn lọc:
Tiến hành sắc ký các mẫu trắng; mẫu
nội chuẩn; mẫu chuẩn và mẫu thử
Đáp ứng của mẫu trắng tại thời điểm
trùng với thời gian lưu của DOX, không
vượt quá 20% đáp ứng của mẫu chuẩn
Đáp ứng của mẫu trắng tại thời điểm
trùng với thời gian lưu của nội chuẩn phải
không được vượt quá 5% đáp ứng của
nội chuẩn
- Độ lặp lại trong ngày, độ lặp lại khác
ngày:
+ Độ lặp lại trong ngày: đo QC ở
3 mức nồng độ, mỗi mức nồng độ ít nhất
5 mẫu độc lập trong cùng một ngày Giá
trị RSD phải ≤ 15%
+ Độ lặp lại giữa các ngày: tiến hành
tương tự như xác định độ lặp lại trong
ngày, ít nhất 3 ngày Giá trị RSD phải ≤ 15%
- Độ đúng:
Tiến hành định lượng các lô mẫu QC ở
3 khoảng nồng độ thấp (LQC), trung bình
(MQC) và cao (HQC), mỗi lô mẫu gồm ít
nhất 5 mẫu độc lập So sánh giá trị trung
bình các lần định lượng với giá trị lý
thuyết có trong mẫu Độ đúng của phương pháp tại mỗi nồng độ phải nằm trong khoảng 85 - 115%
- Hiệu suất chiết:
So sánh kết quả định lượng các mẫu LQC; MQC và HQC cùng với mẫu chuẩn pha trong pha động (không qua chiết tách), có nồng độ tương ứng Hiệu suất chiết phải không quá 110% và không thấp hơn 30%; RSD của giá trị hiệu suất chiết tại các nồng độ không quá 15% và hiệu suất chiết trung bình tại các nồng độ khác nhau không quá ± 15%
- Khoảng tuyến tính:
Phân tích các mẫu chuẩn DOX trong huyết tương có nồng độ từ 1/40 đến 2 - 3 lần nồng độ tối đa dự tính Hệ số tương quan giữa tỷ lệ đáp ứng píc của DOX/DAU và nồng độ DOX phải lớn hơn 0,98 và ít nhất 75% số điểm của đường chuẩn, bao gồm cả mẫu có nồng độ thấp nhất và mẫu có nồng độ cao nhất phải có
độ đúng nằm trong khoảng từ 85 - 115%, riêng điểm thấp nhất của đường chuẩn cho phép sai số không quá 20%
- Giới hạn định lượng dưới (LLOQ):
Tiến hành sắc ký các mẫu trắng và mẫu chuẩn có nồng độ 1/10 - 1/30 Cmax Nồng độ được coi là giới hạn định lượng dưới nếu trên sắc ký đồ mẫu chuẩn ở nồng độ đó cho píc DOX tách biệt với các píc tạp, có độ đúng từ 80 - 120%; độ lặp lại với giá trị RSD ≤ 20% và đáp ứng píc DOX ≥ 5 lần đáp ứng của mẫu trắng
- Độ ổn định của DOX trong huyết tương:
Xác định độ ổn định của DOX sau
3 chu kỳ đông - rã đông; trong quá trình
xử lý mẫu trên các mẫu LQC và HQC
Trang 4+ Độ ổn định sau 3 chu kỳ đông - rã:
Bảo quản mẫu ở nhiệt độ -20oC trong
24 giờ, lấy mẫu ra và để tan ở nhiệt độ
phòng Sau khi đã tan chảy hoàn toàn, để
mẫu trở lại đông lạnh trong 12 - 24giờ
Lặp lại chu kỳ đông - rã đông 2 lần nữa
Tiến hành phân tích mẫu sau lần để rã
đông thứ 3 Kết quả lượng DOX có trong
mẫu sau 3 chu kỳ đông - rã đông và mẫu
phân tích trước khi để đông phải sai khác
không có ý nghĩa thống kê
+ Độ ổn định trong quá trình xử lý
mẫu: So sánh nồng độ DOX có trong mẫu
được chiết tách ngay sau khi rã đông và
mẫu có nồng độ tương ứng chỉ được
chiết tách sau khi đã rã đông và để ở
nhiệt độ phòng tối thiểu 4 giờ Kết quả
phải sai khác không có ý nghĩa thống kê
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ
BÀN LUẬN
1 Xây dựng phương pháp phân
tích
* Quy trình xử lý mẫu:
- Chuẩn bị mẫu: lấy 0,2 ml huyết tương
cho vào ống ly tâm Thêm 50 µl dung dịch
chuẩn (hoặc QC), lắc xoáy trong 30 giây
Thêm 50 µl dung dịch DAU 40 µg/ml (nội
chuẩn), lắc xoáy trong 30 giây
- Chiết tách DOX: thêm vào mẫu phân
tích 0,2 ml dung dịch acetonitril, lắc xoáy
trong 3 phút Ly tâm 10.000 vòng/phút x
10 phút Lấy dịch nổi, lọc qua màng
0,45 µm Dịch lọc thu được dùng để tiêm
sắc ký
* Kết quả lựa chọn điều kiện sắc ký:
Qua tham khảo tài liệu [1, 2, 4] và khảo sát, đã lựa chọn được điều kiện sắc
ký gồm:
- Cột: Gemini C18; 5 µm, 250 x 4 mm Nhiệt độ cột: 25°C
- Pha động: acetonitril - amoni nitrat 0,25 g/l trong nước với tỷ lệ 30:70 (v/v)
+Tốc độ dòng 1,0 ml/phút
+ Detector: PDA ở 232 nm + Thể tích tiêm mẫu: 10 µl
+ Thời gian chạy: 10 phút + Nội chuẩn là DAU nồng độ trong huyết tương 8 µg/ml
Với điều kiện sắc ký này, đã tách phân biệt được píc của DOX và píc của DAU với hệ số tách 1,64 Diện tích píc của DOX trung bình 12.682 mAU.s và diện tích píc của DAU trung bình 133.176 mAU.s ở mẫu chứa 1 µg/ml chuẩn DOX
và 8 µg/ml nội chuẩn DAU Các đáp ứng píc này lớn hơn 5 lần so với mẫu huyết
tương trắng (hình 1)
2 Thẩm định phương pháp phân tích
* Độ đặc hiệu - chọn lọc:
Tiêm lặp lại 5 lần mẫu huyết tương trắng, mẫu huyết tương chứa DOX
3 µg/ml và DAU 8 µg/ml sau khi xử lý mẫu theo quy trình đã lựa chọn ở trên Kết quả phân tích cho thấy DOX có thời gian lưu (tR) trung bình 3,46 phút, RSD 0,68%; DAU có thời gian lưu trung bình 5,66 phút, RSD 0,19% Mẫu trắng có đáp ứng nhỏ hơn 5% so với mẫu chuẩn Píc DOX có hệ số đối xứng (SF) là 1,04; số đĩa lý thuyết (N) 9.860
Trang 5-0.010
-0.005
0.000
0.005
0.010
0.015
0.020
0.025
0.030
Minutes
-0.010
-0.005
0.000
0.005
0.010
0.015
0.020
0.025
0.030
Minutes
-0.010
0.000
0.010
0.020
0.030
Minutes
Hình 1: Sắc ký đồ huyết tương trắng (a), huyết tương có chứa nội chuẩn DAU (b),
huyết tương có chứa chuẩn DOX và nội chuẩn DAU (c)
a
b
c
Trang 6* Độ lặp lại, độ đúng:
- Độ lặp lại, độ đúng trong ngày:
Phân tích các mẫu LQC (3 µg/ml), MQC (20 µg/ml) và HQC (80 µg/ml), mỗi mẫu
6 lần trong ngày
Bảng 1: Kết quả độ lặp lại, độ đúng trong ngày
Phương pháp có độ đúng tốt (91,71 - 98,37%); độ lặp lại trong ngày với giá trị RSD nhỏ (2,1 - 3,8%), đáp ứng yêu cầu về độ lặp lại, độ đúng của phương pháp phân tích trong dịch sinh học
- Độ lặp lại, độ đúng khác ngày:
Phân tích các mẫu LQC (3 µg/ml), MQC (20 µg/ml) và HQC (80 µg/ml), mỗi mẫu
5 lần mỗi ngày, trong 3 ngày
Bảng 2: Kết quả độ lặp lại, độ đúng khác ngày
Ở cả 3 nồng độ (3; 20 và 80 µg/ml), phương pháp đều cho độ đúng 90,2 - 99,7% và
độ lặp lại khác ngày với giá trị RSD < 10% (3,62 - 4,68%) chứng tỏ phương pháp nghiên cứu có độ lặp lại, độ đúng cao, đáp ứng yêu cầu đối với phương pháp dùng trong sinh học
* Khoảng tuyến tính:
Phân tích các mẫu chuẩn DOX trong huyết tương có nồng độ 1; 2; 5; 10; 20, 50;
100 µg/ml, chuẩn bị theo quy trình đã xây dựng Xác định mối tương quan giữa nồng
độ DOX trong huyết tương và tỷ lệ diện tích píc DOX/DAU đo được Kết quả được trình bày trong bảng 3 và hình 2
Trang 7Bảng 3: Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính
Tỷ
lệ
diện
tích
chuẩn/
nội
chuẩn
Nồng độ (µg/l)
Hình 2: Đồ thị tương quan giữa nồng độ DOX và tỷ lệ diện tích píc DOX/DAU
Phương pháp có khoảng tuyến tính từ 1,0 - 100,0 µg/l với hệ số tương quan
R2 0,9995
* Giới hạn định lượng dưới:
Phân tích mẫu trắng và mẫu chuẩn có nồng độ thấp nhất trong khoảng tuyến tính
(1 µg/ml) Xác định đáp ứng píc của mẫu chuẩn, mẫu trắng Tính nồng độ DOX trong
mẫu chuẩn từ tỷ lệ diện tích DOX/DAU và đường chuẩn
Bảng 4: Kết quả xác định giới hạn định lượng dưới
Diện tích píc (mAU.s)
Stt
Trang 8Tại vị trí có thời gian lưu khoảng 3,5 phút đáp ứng mẫu chuẩn có nồng độ 1 µg/ml
gấp hơn 20 lần đáp ứng của mẫu trắng và độ lặp lại sau 5 lần phân tích với RSD
< 20% Như vậy, mẫu chuẩn chứa DOX có nồng độ 1 µg/ml đáp ứng yêu cầu giới hạn định lượng dưới của phương pháp phân tích dịch sinh học
* Hiệu suất chiết của phương pháp:
Tiến hành định lượng các mẫu LQC; MQC và HQC cùng với mẫu chuẩn pha trong
pha động (không qua chiết tách) với nồng độ tương ứng
Bảng 5: Hiệu suất chiết ở các khoảng nồng độ
Ở cả 3 khoảng nồng độ 3; 20 và 80 µg/ml, phương pháp đều cho hiệu suất chiết
cao (từ 94,2 - 98,8%); độ lặp lại tốt (RSD < 4%) và hiệu suất chiết trung bình tại các nồng độ chênh lệch nhau không quá 5% Do đó, phương pháp xử lý mẫu được xây dựng phù hợp để chiết tách DOX từ huyết tương chuột
* Độ ổn định của DOX trong huyết tương:
- Độ ổn định sau 3 chu kỳ đông - rã đông: định lượng DOX trước và sau 3 chu kỳ
đông - rã đông trên các mẫu LQC và HQC
Bảng 6: Độ ổn định sau 3 chu kỳ đông - rã đông
p
Sau 3 chu kỳ đông - rã đông, định lượng DOX ở cả 3 mức nồng độ LQC, MQC và
HQC đều khác biệt không có ý nghĩa thống kê so với trước khi để đông
- Độ ổn định trong quá trình xử lý mẫu: định lượng DOX có trong mẫu LQC, MQC,
HQC tách chiết ngay sau khi rã đông và mẫu có nồng độ tương ứng chỉ được chiết tách sau khi đã rã đông, để ở nhiệt độ phòng 4 giờ
Trang 9Bảng 7: Độ ổn định trong quá trình xử lý mẫu
Hàm lượng DOX ở cả 3 mức nồng độ LQC, MQC và HQC đều ổn định trong quá trình xử lý mẫu
Như vậy, nghiên cứu đã xây dựng được quy trình định lượng DOX trong huyết tương chuột Kết quả thẩm định cho thấy phương pháp đạt yêu cầu theo hướng dẫn của FDA
KẾT LUẬN
Đã xây dựng được phương pháp định
lượng DOX trong huyết tương chuột bằng
HPLC Phương pháp đã được thẩm định
với các thông số theo hướng dẫn của
FDA và đạt yêu cầu Phương pháp có độ
đặc hiệu với mức đáp ứng của mẫu trắng
tại thời điểm trùng với thời gian lưu của
mẫu chuẩn không quá 5% Độ lặp lại
trong ngày và khác ngày với độ lệch
chuẩn tương đối đều < 5% Phương pháp
có độ đúng 90,2 - 99,7% ở cả 3 mức
nồng độ thấp, trung bình và cao Khoảng
tuyến tính của phương pháp từ 1 - 100 µg/l
Giới hạn định lượng dưới 1 µg/l Phương
pháp xử lý mẫu cho hiệu suất chiết cao
từ 94,2 - 98,8% Mẫu huyết tương ổn
định sau 3 chu kỳ đông - rã đông và
trong quá trình xử lý mẫu Với kết quả
này, có thể ứng dụng trong đánh giá
sinh khả dụng và tương đương sinh học
của các chế phẩm chứa DOX trên thực nghiệm
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1 Deng W.J, Zeng Z.L, Liang Y.J, Dai C.L, Zhang J.Y, Fu L.W Detecting DOX concentration
in KBv200 and KB cell xenografts in nude mice by high-performance liquid chromatography
Ai Zheng 2008, Apr, 27 (4), pp.364-368
2 Kimberley M Laginha, Sylvia Verwoert, Gregory J.R Charrois and Theresa M Allen
Determination of DOX levels in whole tumor and tumor nuclei in murine breast cancer tumors Clin Cancer Res 2005, October 1,
11, 6944
3 U.S Department of Health and Human Services Food and drug administration
Center for Drug Evaluation and Research (CDER) Guidance for Industry Bioanalytical Method Validation 2001
4 USP 38-NF33 DOX hydrochloride for
injection 2015