Đánh giá khả năng ức chế của α-mangostin từ vỏ quả măng cụt đến hai dòng tế bào ung thư phổi LU-1 và ung thư ruột kết SW480

Hoạt tính chống ung thư của các dẫn suất xanthone trong măng cụt được đặc biệt quan tâm trong thời gian gần đây do chúng có khả năng ức chế mạnh sự phát triển của nhiều dòng tế bào ung thư khác nhau như ung thư vú, ung thư gan, ung thư phổi, ung thư dạ dày và đặc biệt là ung thư máu (Moongkarndi et al. 2004; Kijjoa et al. 2008).

ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG ỨC CHẾ CỦA α-MANGOSTIN TỪ VỎ QUẢ MĂNG CỤT ĐẾN HAI DÒNG TẾ BÀO UNG THƯ PHỔI LU-1 VÀ

UNG THƯ RUỘT KẾT SW480

Lê Minh Trí*, Đoàn Thanh Huyền, Ngô Thị Thúy Phương

Tóm tắt: Hoạt tính chống ung thư của các dẫn suất xanthone trong măng cụt

được đặc biệt quan tâm trong thời gian gần đây do chúng có khả năng ức chế mạnh sự phát triển của nhiều dòng tế bào ung thư khác nhau như ung thư vú, ung thư gan, ung thư phổi, ung thư dạ dày và đặc biệt là ung thư máu (Moongkarndi

et al 2004; Kijjoa et al 2008) Các nghiên cứu của Ee và cộng sự (Ee et al 2006;

Ee et al 2008) đã phát hiện thấy dịch chiết n-hexan và chloroform của rễ và vỏ của măng cụt có hoạt tính gây độc mạnh trên dòng tế bào ung thư máu CEM- SS Pedraza và cộng sự (Pedraza-Chaverri et al 2008b) đã chỉ ra rằng các dẫn xuất xanthone như α-mangostin, γ-mangostin, mangostanol và garcinone D có hoạt tính ức chế sự phát triển của các tế bào ung thư máu với các giá trị IC 50 lần lượt

là 4,7; 5,5; 9,6 và 3,2 µg/ml.

Từ khoá: Măng cụt, Ung thư gan, Ung thư phổi,α-mangostin, γ-mangostin

1 MỞ ĐẦU

Măng cụt (Garcinia mangostana L.) thuộc họ Clusiaceae (Guttiferae) được trồng rộng

rãi ở nhiều nước như Malaysia, Indonesia, Philippines và Campuchia.Măng cụt có chứa nhiều chất hóa học khác nhau như tannin, chất nhựa (resin), pectin và đặc biệt là các dẫn

xuất xanthone, những chất thuộc nhóm chất phenolic (Đỗ Tất Lợi 2000; Ee et al 2006 )

Các chất xanthone của vỏ quả măng cụt đã được xác định là: -mangostin, -mangostin, -mangostin, iso-mangostin, nor-mangostin, bên cạnh đó còn có các trioxyxanthon, pyranoxanthon, dihydroxy methyl butenyl xanthon, trihydroxy methyl butenyl xanthon, pyrano xanthenon Các chất garcinone A, B, C, D, E, mangostinon, garcimangoson A, B,

C, gartanin, egonol, epicatechin, procyanidin, benzophenon glucosid cũng được phát hiện nhưng với hàm lượng rất thấp

Hoạt tính chống ung thư của các dẫn suất xanthone trong măng cụt được đặc biệt quan tâm trong thời gian gần đây do chúng có khả năng ức chế mạnh sự phát triển của nhiều dòng tế bào ung thư khác nhau như ung thư vú, ung thư gan, ung thư phổi, ung thư dạ dày

và đặc biệt là ung thư máu (Moongkarndi et al 2004; Kijjoa et al 2008) Các nghiên cứu của Ee và cộng sự (Ee et al 2006; Ee et al 2008) đã phát hiện thấy dịch chiết n-hexan và

chloroform của rễ và vỏ của măng cụt có hoạt tính gây độc mạnh trên dòng tế bào ung thư

máu CEM- SS Pedraza và cộng sự (Pedraza-Chaverri et al 2008b) đã chỉ ra rằng các dẫn

xuất xanthone như α-mangostin, γ-mangostin, mangostanol và garcinone D có hoạt tính ức

3,2 µg/ml

Nghiên cứu của của Matsumoto và cộng sự (Matsumoto et al 2003; Matsumoto et al

2004) cũng phát hiện thấy tác dụng này của các xanthone trên hàng loạt các tế bào ung thư máu cũng như nhiều dòng tế bào ung thư gan khác nhau Các tác giả phát hiện thấy có 6 xanthone từ vỏ quả măng cụt có tác dụng ức chế sự phát triển của dòng tế bào ung thư máu HL-60 ở người trong đó -mangostin có khả năng ức chế hoàn toàn ở nồng độ 10 µM

Nhóm nghiên cứu của Ho (Ho et al 2002a)lại phát hiện thấy garcinone E có hoạt tính gây

độc mạnh các tế bào ung thư gan (hepatocellular carcinomas- HCC) và các dòng ung thư

dạ dày

Moongkarndi và cộng sự (Moongkarndi et al 2004) phát hiện thấy dịch chiết methanol của vỏ quả măng cụt, bộ phận có chứa nhiều - và -mangostin, cũng có khả năng gây độc

tế bào ung thư thông qua việc cảm ứng quá trình apoptosis Cụ thể là α- mangostin đã tinh sạch ở nồng độ 20 µM có tác dụng cảm ứng apoptosis ở dòng tế bào ung thư máu HL60 thông qua việc làm thay đổi hình thái tế bào hay thông qua cơ chế phụ thuộc capase-3 Với

cơ chế phụ thuộc capase-3, apoptosis việc tăng cường giải phóng endonuclease-G từ ti thể

và cảm ứng tăng cường biểu hiện một micro iARN có tên miR-143, nhờ đó làm giảm tín

hiệu gây ung thư KRAS (Nakagawa et al 2007)

Trong một nghiên cứu khác, Nakatani và cộng sự (Nakatani et al 2004) lại phát hiện

thấy -mangostin gây độc tế bào dòng ung thư não (glioma) ở chuột thông qua việc ức chế hoạt tính kinase của tổ hợp chất kìm hãm- kappaB, đồng thời làm giảm sự biểu hiện của gene cyclooxygenase-2, nhờ đó hạn chế quá trình phát triển khối u

Gần đây, của Akao và cộng sự (Akao et al 2008 -b) khi đi sâu nghiên cứu về cơ chế

gây độc tế bào của các xanthone đã phát hiện thấy chúng liên quan trực tiếp đến việc làm dừng chu trình tế bào (cell cycle) với việc ức chế sự biểu hiện của các cyclin cdc2 và p2 Các tác giả đã chỉ ra rằng phase G1 của chu trình tế bào bị dừng hoạt động bởi α-mangostin and β-α-mangostin, còn phase S lại bị dừng hoạt dộng bởi γ-α-mangostin Hơn thế nữa, các tác giả còn chỉ rõ α-mangostin cảm ứng quá trình apoptosis thông qua việc hoạt hóa liên tiếp con đường tín hiệu cơ bản có tên là MAP kinases và serine/threonine kinase Akt Có thể thấy rằng, đích tác dụng lên các tế bào ung thư của các xanthone được cho là các ti thể Bằng chứng là hình ảnh ti thể chụp dưới kính hiển vi huỳnh quang cho thấy rõ chúng đã bị tổn thương do bị truơng lên, bị mất chức năng màng, bị giảm hàm lượng ATP nội bào, tích lũy nhiều ROS và bị giảm hàm lượng cytochrome c/AIF được giải phóng ra Nhìn chung, các nghiên cứu đều cho thấy rằng nhiều dẫn xuất xanthone từ măng cụt, đặc biệt là các mangostin, có tác dụng ức chế có hiệu quả sự phát triển của nhiều dòng tế bào ung thư người khác nhau thông qua việc cảm ứng quá trình apotosis

Bên cạnh cơ chế gây độc tế bào thông qua cảm ứng apoptosis, các chất chống ung thư còn có thể gây độc thông qua việc tác động trực tiếp lên màng, qua đó làm ly giải tế bào Nhiều nghiên cứu về các chất phenol đã chứng minh rằng chúng có khả năng tương tác với

màng tế bào và gây tổn thương màng (Greenberg et al 2008) Các nhóm OH trong phân tử

các chất này đóng vai trò trong việc tạo liên kết với một số trung tâm tương tác đặc hiệu kiểu receptor trên màng tế bào ung thư Khi tương tác được hình thành sẽ làm thay đổi tính thấm của màng, thay đổi cấu hình và tạo những lỗ thủng trên màng Kết quả là quá trình ly giải tế bào xảy ra Mangostin là những chất thuộc nhóm phenolic có chứa các gốc OH trong phân tử Chính các gốc này có vai trò thể hiện hoạt tính sinh học do chúng có thể tương tác với màng tế bào

Nakagawa và cộng sự (Nakagawa et al 2007) đã phát hiện thấy việc cùng xử lý α-mangostin và 5-FU, một trong những chất điều trị ung thư ruột hiệu quả nhất hiện nay, ở cùng nồng độ 2,5 µM đã có tác dụng tăng cường ức chế sự phân chia của tế bào ung thư ruột dòng DLD-1 so với mẫu xử lý riêng rẽ mỗi chất ở các nồng độ 5 µM

Tương tự, Akao và cộng sự (Akao et al 2008 -b) cũng nhận thấy rằng α- mangostin có khả năng ngăn chặn ung thư thực nghiệm trên chuột hiêu quả và đặc biệt có hiệu quả khi kết hợp với 5-FU để điều trị ung thư ruột Các tác giả cho rằng có thể dùng chất này để phòng chống ung thư hay sử dụng dưới dạng liệu pháp kết hợp với thuốc điều trị ung thư

để nâng cao hiệu quả chữa trị Như vậy, việc sử dụng mangostin cũng như các chất xanthone như các chất CAM cho những bệnh nhân ung thư là rất có triển vọng Trên thực

tế, các sản phẩm có chứa xanthone, trong đó, có mangostin, dưới dạng thực phẩm chức

năng như các nước ép trái măng cụt đã được thị trường hóa để sử dụng với mục đích tăng cường sực khỏe, chống lão hóa cho con người

2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Nguyên liệu: Vỏ quả măng cụt được sử dụng ở dạng khô Nguyên liệu được chiết

trong các dung môi: ethanol, ether petroleum, chloroform, ethylacetate, acetone bằng cách ngâm nguyên liệu trong nhiều giờ trong dung môi và chiết hồi lưu bằng socklet

Các dòng tế bào ung thư:Được Viện kiểm nghiệm dược/ Bộ Y tế cung cấp và thử nghiệm

Bảng 1 Danh sách hóa chất chính được sử dụng trong thí nghiệm

Dichlomethane, methanol, ethanol, ethyl

acetate, ether petroleum

Trung Quốc

Peroxidase chuẩn, 3,3´-5,5´ tetramethyl

benzidine

Sigma (Mỹ)

Huyết thanh bò FBS (Fetal bovine serum),

trypsin, EDTA

Atlanta Biological (Hoa kỳ) Tất cả các hóa chất sử dụng đều có độ tinh sạch (PA)

Phương pháp nuôi cấy tế bào in vitro

Các dòng tế bào ung thư được nuôi cấy dưới dạng đơn lớp trong môi trường nuôi cấy DMEM với thành phần kèm theo gồm 2 mM L- glutamine, 10 mM HEPES, và 1,0 mM sodium pyruvate, ngoài ra bổ sung 10% fetal bovine serum – FBS (GIBCO) Tế bào được

Phép thử sinh học xác định tính độc tế bào (cytotoxic assay)

Phương pháp thử độ độc tế bào in vitro được Viện Ung thư Quốc gia Hoa Kỳ (National

Cancer Institute – NCI) xác nhận là phép thử độ độc tế bào chuẩn nhằm sàng lọc, phát hiện các chất có khả năng kìm hãm sự phát triển hoặc diệt tế bào ung thư (TBUT) ở điều kiện

in vitro (Monks et al 1991) Phép thử tiến hành xác định hàm lượng protein tế bào tổng số

dựa vào mật độ quang học (OD – Optical Density) đo được khi thành phần protein của tế bào được nhuộm bằng Sulforhodamine B (SRB) Giá trị OD máy đo được tỉ lệ thuận với lượng SRB gắn với phân tử protein, do đó lượng tế bào càng nhiều (lượng protein càng nhiều) thì giá trị OD càng lớn Phép thử được thực hiện trong điều kiện cụ thể như sau: Chất thử (10 l) pha trong DMSO 10% được đưa vào các giếng của khay 96 giếng để

có nồng độ 100 g/ml; 20g/ml; 4 g/ml; 0.8 g/ml

Trypsin hóa tế bào thí nghiệm để làm rời tế bào và đếm trong buồng đếm để điều chỉnh mật độ cho phù hợp với thí nghiệm

Thêm vào các giếng thí nghiệm lượng tế bào phù hợp (trong 190 l môi trường) và để chúng phát triển trong vòng từ 3-5 ngày

Một khay 96 giếng khác không có chất thử nhưng có TBUT (180l) sẽ được sử dụng làm đối chứng ngày 0 Sau 1 giờ, đĩa đối chứng ngày 0 sẽ được cố định tế bào bằng Trichloracetic acid – TCA

Sau giai đoạn phát triển trong tủ ấm CO2, tế bào được cố định vào đáy giếng bằng TCA

nghiệm được rửa 3 lần bằng 5% acetic acid rồi để khô trong không khí ở nhiệt độ phòng Cuối cùng, sử dụng 10 mM unbuffered Tris base để hòa tan lượng SRB đã bám và nhuộm các phân tử protein, đưa lên máy lắc đĩa lắc nhẹ trong 10 phút và sử dụng máy ELISA Plate Reader (Bio-Rad) để đọc kết quả về hàm lượng màu của chất nhuộm SRB qua phổ hấp phụ ở bước sóng 515 nm Khả năng sống sót của tế bào khi có mặt chất thử sẽ được xác định thông qua công thức sau:

OD(đối chứng âm) - OD(ngày 0) Các phép thử được lặp lại 3 lần để đảm bảo tính chính xác Ellipticine (Sigma) luôn được sử dụng như là chất đối chứng dương và được thử nghiệm ở các nồng độ 10 g/ml; 2

g/ml; 0,4 g/ml; 0,08 g/ml DMSO 10% luôn được sử dụng như đối chứng âm Giá trị

bào và có khả năng ức chế sự phát triển hoặc diệt tế bào ung thư (Skehan et al 1990)

3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

Hoạt chất -mangostin đã tinh sạch được từ vỏ quả măng cụt Garcinia mangostana L

ở Việt Nam làm thuốc hỗ trợ điều trị ung thư, trong nghiên cứu này chúng tôi tiến hành xác định khả năng diệt hoặc kìm hãm sự phát triển của tế bào ung thư của hoạt chất α- mangostin trên hai dòng tế bào ung thư phổi LU-1 và tế bào ung thư ruột kết SW480 Với phương pháp đã được mô tả ở trên, kết quả cụ thể được trình bày ở bảng 2

Bảng 2 Kết quả nghiên cứu

Nồng độ

OD TB

%

%

ức chế

0,145

0,466

1,043

1,209

0 DAY= 0,1102 Ghi chú: OD là giá trị mật độ quang học;

ODTB là giá trị OD trung bình do thí nghiệm lặp lại

Kết quả bảng 2 cho thấy với nồng độ hoạt chất 4 g/ml, hoạt chất α-mangostin đã kìm hãm được sự sinh trưởng và phát triển của dòng tế bào ung thư phổi LU-1 tương ứng là 30% Khi nồng độ hoạt chất tăng lên 20 g/ml, đã ức chế được hoàn toàn sự sinh trưởng

và phát triển của dòng tế bào ung thư phổi, đạt tương ứng 101% Trong khi đó, chất đối chứng dương ellipticine ở nồng độ 10g/ml đã ức chế được 96,8% (bảng 3)

Hoạt chất -mangostin đều có hoạt tính diệt hoặc ức chế tế bào ung thư phổi LU-1 phát

Bảng 3 Ảnh hưởng của α-mangostin lên sự phát triển của tế bào ung thư ruột kết SW 480

Nồng độ

0,144

0,680

1,345

1,639

0 day = 0,1182

Ghi chú: OD là giá trị mật độ quang học; OD TB là giá trị OD trung bình do thí nghiệm

lặp lại

a) Nồng độ 100 g/ml

b) Nồng độ 20 g/ml

c) Nồng độ 4 g/ml

Hình 1 Khả năng ức chế tế bào ung thư SW 480

của α-mangostin tại các nồng độ khác nhau

Trên dòng tế bào ung thư ruột kết SW480 ở nồng độ hoạt chất 4 g/ml chỉ ức chế được 26- 60%, nhưng khi tăng nồng độ hoạt chất lên 20 g/ml đã ức chế được 99- 101% sự sinh trưởng và phát triển của dòng tế bào ung thư ruột kết SW480 (bảng 3) Hoạt chất α

-mangostin đều có hoạt tính với giá trị IC50 thấp thể hiện hoạt tính mạnh với giá trị IC50 = 5,97 g/ml Hình ảnh chụp trên kính hiển vi đo khả năng ức chế tế bào ung thư SW 480 của α-mangostin được minh họa trên hình 1 a) Ở nồng độ 100 g/ml, b) Ở nồng độ 20

g/ml, c) Ở nồng độ 4 g/ml

-mangostin thể hiện hoạt tính mạnh trong việc kìm hãm hoặc ức chế tế bào ung thư phổi

tử đã khẳng định thêm khả năng diệt tế bào ung thư của hoạt chất γ-mangostin sau 72 giờ nuôi cấy ở các nồng độ hoạt chất khác nhau trên hai dòng tế bào ung thư này, ở nồng độ hoạt chất 20-100 g/ml sau 72 giờ đã ức chế được hoàn toàn sự sinh trưởng và phát triển

tế bào ung thư

4 KẾT LUẬN

Chế phẩm -mangostin thể hiện hoạt tính mạnh trong việc kìm hãm hoặc ức chế tế bào

dòng tế bào ung thư ruột kết SW480)

TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1] Chin, Y.; Kinghorn, A.D Structural characterization, biological effects, and

synthetic studies on xanthones from mangosteen (Garcinia mangostana), a popular botanical dietary supplement Mini Rev Org Chem 2008, 5, 355–364

[2] Yapwattanaphun, C.; Subhadrabandhu, S.; Sugiura, A.; Yonemori, K.; Utsunomiya,

N Utilization of some Garcinia species in Thailand Acta Hort 2002, 575, 563–570 [3] Pedraza-Chaverri, J.; Cárdenas-Rodríguez, N.; Orozco-Ibarra, M.; Pérez-Rojas, J.M

Medicinal properties of mangosteen (Garcinia mangostana) Food Chem Toxicol

2008, 46, 3227–3239

[4] Sloan, E.W Getting ahead of the curve: Phytochemicals Nutraceutical World 2010,

13, 16–17 5 Obolskiy, D.; Pischel, I.; Siriwatanametanon, N.; Heinrich, M Garcinia mangostana L.: A phytochemical and pharmacological review Phytother Res 2009,

23, 1047–1065 Nutrients 2013, 5 3180

[5] Walker, E.B HPLC analysis of selected xanthones in mangosteen fruit J Sep Sci

2007, 30, 1229–1234

[6] Bumrungpert, A.; Kalpravidh, R.W.; Suksamrarn, S.; Chaivisuthangkura, A.;

Chitchumroonchokchai, C.; Failla, M.L Bioaccessibility, biotransformation, and

transport of α-mangostin from Garcinia mangostana (mangosteen) using simulated digestion and Caco-2 human intestinal cells Mol Nutr Food Res 2009, 53 (Suppl

1), 54–61

[7] Gutierrez-Orozco, F.; Chitchumroonchokchai, C.; Lesinski, G.; Suksamrarn, S.;

Failla, M α-Mangostin: Anti-inflammatory activity and metabolism by human cells J

Agric Food Chem 2013, 61, 3891–3900

[8] Pinto, M.; Sousa, M.; Nascimento, M.S Xanthone derivatives: New insights in

biological activities Curr Med Chem 2005, 12, 2517–2538

[9] Shan, T.; Ma, Q.; Guo, K.; Liu, J.; Li, W.; Wang, F.; Wu, E Xanthones from

mangosteen extracts as natural chemopreventive agents: Potential anticancer drugs

Curr Mol Med 2011, 11, 666–677

[10] Li, L.; Brunner, I.; Han, A.R.; Hamburger, M.; Kinghorn, A.D.; Frye, R.; Butterweck,

V Pharmacokinetics of α-mangostin in rats after intravenous and oral application

Mol Nutr Food Res 2011, 55 (Suppl 1), 67–74

[11] Syamsudin, L.; Faizatun, L.; Rahayu, L HPLC analysis and pharmacokinetic study of

mangostin after orally administration in rats T Pharm Res 2009, 2, 43–49

ABSTRACT

STUDYING POSSIBILITY INHIBITION OF α - MANGOSTIN TO

THE TWO LINES CELL LUNG CANCER AND SW480

The mangosteen (Garcinia mangostana) is a tropical fruit native to Southeast Asia and has long been reported to contain multiple health promoting properties This fruit is an abundant source of xanthones, a class of polyphenolic compounds with a distinctive tricyclic aromatic ring system and is largely responsible for its biological activities including anti-cancer activity In cell lung cancer, α-Mangostin was found to be the most potent with an IC 50 value of 5.54 μg/ml and SW480 is 5.97 μg/ml

Keywords: Lung cancer, α-mangostin

Nhận bài ngày 07 tháng 12 năm 2016 Hoàn thiện ngày 10 tháng 5 năm 2017 Chấp nhận đăng ngày 25tháng 10 năm 2017

Địa chỉ: Viện Hóa học Vật liệu/ Viện KH&CNQS

*

Emai: leminhtri1975@yahoo.com.vn