Mục tiêu của nghiên cứu nhằm khảo sát tác động kháng Candida spp. in vitro và ex vivo của 2-methoxy-1,4 naphthoquinon so sánh với một số chất đối chiếu như cao BMT, ketoconazol, nystatin và terbinafin. Mời các bạn cùng tham khảo đề tài qua bài viết này.
Trang 1TÁC DỤNG KHÁNG CANDIDA ALBICANS IN VITRO VÀ EX VIVO
CỦA 2-METHOXY-1,4-NAPHTHOQUINON
Nguyễn Đinh Nga*, Mai Phước Tân*, Quách Lâm Tư Ái**
TÓM TẮT
Đặt vấn đề: Để sử dụng 2-methoxy-1,4 naphthoquinon như nguồn nguyên liệu cho tác động kháng nấm
cần được chứng minh tác động kháng Candida albicans in vitro, in vivo của hợp chất này
Mục tiêu nghiên cứu: khảo sát tác động kháng Candida spp in vitro và ex vivo của 2-methoxy-1,4
naphthoquinon so sánh với một số chất đối chiếu như cao BMT, ketoconazol, nystatin và terbinafin
Vật liệu và phương pháp: sử dụng phương pháp pha loãng theo NCCLS-M27-A2; khảo sát tác động của
các chất kháng nấm trên dạng biofilm của C albicans theo hướng dẫn của Gordon Ramage và cs.; xác định MIC
ex vivo trên mô hình móng nhiễm C albicans, biến đổi của mô hình gây nhiễm nấm móng thực nghiệm với T rubrum và T mentagrophytes
Kết quả: Kết quả nghiên cứu cho thấy 2-methoxy-1,4 naphthoquinon cho tác động kháng C albicans in
vitro và ex vivo tương đương cao BMT
Kết luận: Có thể sử dụng kết quả từ khảo sát tác động kháng C albicans dạng biofilm và ex vivo trên mô
móng để ước lượng liểu thử nghiệm in vivo của hợp chất này
Từ khóa: Cao Bông móng tay (BMT); 2-methoxy-1,4 naphthoquinon; Candida spp.; nồng độ tối thiểu ức
chế in vitro (MIC in vitro); MIC ex vivo
ABSTRACT
THE ANTIFUNGAL ACTIVITY AGAINST CANDIDA ALBICANS IN VITRO AND EX VIVO
OF 2-METHOXY-1,4-NAPHTHOQUINONE
Nguyen Dinh Nga, Mai Phuoc Tan, Quach Lam Tu Ai
* Y Hoc TP Ho Chi Minh* Vol 15 - Supplement of No 1 - 2011: 324 - 328
Background: To use a new substance (2-methoxy-1,4-naphtoquinone) as an antifungal agent, this
substance has been determined the antifungal activity in vitro and in vivo
Objective: To determine the antifungal activity in vitro and ex vivo of 2-methoxy-1,4 naphthoquinone, a
principle compound of balsam extract, extracted from Impatiens balsamina L Balsaminaceae which was synthesized against Candida spp compare with balsam extract and some other antifungal agents
Material and methods: The antifungal activity against Candida spp in vitro of these compounds were
determined by the dilution method according to the guidline of NCCLS M27-A2 The MICs of these compounds against Candida albicans biofilms were carried out as the detail techniques of Gordon Ramage and cs and MICs
ex vivo were determined by modified model using the experimental tinea unguium to evaluate the antifungal activity against Trichophyton rubrum and T mentagrophytes
Outcome: Data received from these experiments show the antifungal activities of 2-methoxy-1,4
naphthoquinone against Candida spp were equivalent to balsam extract
Conclusion: 2-methoxy-1,4 naphthoquinone could be studied further more in vivo to use as an antifungal
agent
*Khoa Dược-Đại học Y Dược TP HCM *Đại học Mở TP.HCM
Tác giả liên lạc: PGS TS Nguyễn Đinh Nga ĐT: 0908 83 69 69 Email: nganguyendinh@yahoo.com
Trang 2Keywords: balsam extract; 2-methoxy-1,4 naphthoquinon; Candida spp.; MIC in vitro; MIC ex vivo
ĐẶT VẤN ĐỀ
Khi khảo sát một chất kháng nấm mới để
đưa vào sử dụng, các vấn đề khó khăn mà các
nhà nghiên cứu thường gặp là không tìm thấy
sự tương đồng giữa tác động in vitro và hiệu
quả điều trị lâm sàng, hoặc khó khăn trong
việc tiên lượng nồng độ thử nghiệm in vivo từ
kết quả in vitro
Cao Bông móng tay (cao BMT) chiết xuất từ
cây Bông móng tay (Impatiens balsamina L
Balsaminaceae) với thành phần chính cho tác
động kháng nấm là 2-methoxy-1,4
naphthoquinon, đã được chứng minh tác động
kháng Candida albicans in vitro khá tốt(5) Tuy
nhiên để có thể sử dụng cao BMT làm thuốc
kháng nấm, hai vấn đề quan trọng cần phải giải
quyết là nguồn nguyên liệu ổn định và hiệu quả
kháng nấm in vivo Trong phạm vi đề tài, chúng
tôi khảo sát tác động kháng Candida albicans in
vitro; C albicans dạng biofilm và MIC ex vivo trên
mô hình gây nhiễm bệnh Candida trên mô móng
tay của người khỏe mạnh cắt rời của
2-methoxy-1,4 naphthoquinon (hoạt chất chính cho tác
động kháng nấm của Bông móng tay) nguồn
tổng hợp, nhằm xác định hướng sử dụng
2-methoxy-1,4 naphthoquinon như nguồn nguyên
liệu kháng nấm
ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Đối tượng nghiên cứu
Vi nấm
22 chủng Candida albicans và 12 chủng
Candida non albicans phân lập từ bệnh nhân
nhiễm bệnh Candida niêm mạc
Candida albicans ATCC 10231
Chất kháng nấm
2-methoxy-1,4-naphthoquinon do Bộ môn
Hóa Dược, Khoa Dược, Đại học Y Dược TP
HCM tổng hợp và cung cấp
Chất đối chiếu
Cao Bông móng tay (BMT) chiết từ vỏ quả
Balsaminaceae) có độ ẩm < 10% (xác định bằng máy đo độ ẩm - Moisture Analyzer offers halogen heating của Bộ môn Dược Liệu – Khoa Dược – Đại Học Y Dược TP HCM) Chứa khoảng 70% 2-methoxy-1,4-naphthoquinon, định lượng bằng phương pháp đo quang
Ketoconazole chất chuẩn đối chiếu, lô
50030107, hàm lượng 99,63%
Terbinafin HCl (SHRUTI BULK Drug PVT LTD)
Nystatin, lô 4011316, do công ty cổ phần dược phẩm 3/2 cung cấp
Phương pháp nghiên cứu
Tác động kháng Candida albicans và Candida non albicans dạng nấm men (MIC in vitro) của các
chất kháng nấm được thực hiện bằng phương pháp pha loãng, theo hướng dẫn của NCCLS M27-A2, sử dụng môi trường canh thang Mueller Hinton bổ sung glucose và xanh methylen
Tác động kháng Candida albicans ex vivo được thực hiện trên dạng biofilm của Candida albicans và trên Candida albicans nhiễm nấm
móng thực nghiệm
Phương pháp xác định tác động kháng
Candida albicans dạng biofilm trên bảng nhựa
polystyren: Một trong những đặc điểm liên quan
đến độc tính và khả năng kháng thuốc của C albicans là sự tạo màng sinh học (biofilm) trên các vật liệu trơ Sự tạo thành biofilm của C albicans trên bảng nhựa polystyren sẽ tương tự
như biofilm do vi nấm tạo thành ở dụng cụ y khoa như ống thông, răng giả,… các chất cho
hiệu quả kháng dạng biofilm của Candida sẽ có tiềm năng cho hiệu quả in vivo(1,3)
Tác động kháng C albicans dạng biofilm được thực hiện qua các giai đoạn sau:
Sự tạo biofilms của C albicans trên bảng nhựa polystyren, sử dụng môi trường glycin-glucose(2)
Sau khi Candida albicans tạo biofilm và gắn dính
vào bảng nhựa, rửa giếng 3 lần bằng dung dịch sinh lý-đệm phosphat vô trùng, thấm khô để
Trang 3loại bỏ những tế bào nấm men lơ lửng trong môi
trường Dùng kính hiển vi nghịch đảo để khảo
sát sự tạo thành biofilm của C albicans trên bảng
nhựa (vi nấm ở dạng sợi bám dính vào đáy
bảng nhựa, không bị mất đi ở giai đoạn rửa)
Khảo sát hoạt tính của chất kháng nấm lên
dạng biofilm của C albicans
Tác nhân kháng nấm là được pha loãng với
môi trường YPG (yeast extract 5 g, pepton 10
g, glucose 20 g; nước cất 1000 ml) thành dãy
nồng độ từ cao đến thấp vào các giếng đã có
biofilm, cụ thể: 2-methoxy-1,4-naphthoquinon
từ 256 µg/ml đến 0,125 µg/ml; cao BMT: 256
µg/ml - 0,125 µg/ml; nystatin: 32 µg/ml – 0,015
µg/ml; ketoconazol: 10 µg/ml – 0,00094 µg/ml
Ủ ở 37 oC, sau 24-48 h đọc kết quả bằng cách
quan sát sự phát triển trở lại của vi nấm gây
đục môi trường
Mô hình gây nhiễm Candida albicans lên mô
móng tay cô lập (4,6)
Móng tay được cắt từ người tình nguyện
không sử dụng sơn móng tay hay các chất
đánh bóng khác, không bị các bệnh về móng
Móng tay được trữ trong lọ bijou 8 ml, dán
nhãn và để trong tủ lạnh đến khi sử dụng Cắt
móng tay thành các mảnh 3 x 3 mm Khi sử
dụng, rửa bằng ethanol 70 %, lắc rung 3 lần,
mỗi lần 1 phút và dịch sinh lý vô trùng, lắc
rung 2 lần, mỗi lần 1 phút Sau khi được rửa
sạch, móng được để khô tự nhiên trong
laminar ở nhiệt độ phòng
Gây nhiễm móng
Nấm men C albicans được hoạt hóa trên
thạch YPG, ủ 37 oC Sau 48 h lấy một vòng cấy
nấm phân tán đều trong nước muối sinh lý có bổ
sung 0,05 % Tween 80 để đạt 107 CFU/ ml Số
lượng tế bào nấm men được xác định bằng
buồng đếm Neubauer
Pha loãng dịch treo nấm trong môi trường
thạch nước (thành phần của môi trường thạch
nước gồm K2HPO4 0,2%; MgSO4 0,005%; CaCl2
0,005%; agar 1,5%, nước cất 1 lit) sao cho mật độ
nấm men là 106 CFU/ ml và cho thạch nước chứa
nấm vào đĩa petri vô trùng Đặt phần nền móng
đã được xử lý vào đĩa Petri sao cho phần nền móng tiếp xúc với mặt thạch chứa nấm Như
vậy, Candida albicans chỉ sử dụng móng là nguồn
dinh dưỡng duy nhất ủ đĩa Petri ở 37 oC / 7
ngày Kiểm tra sự phát triển của Candida albicans
trên móng bằng kính hiển vi quang học, ở vật kính x10 và x40
Chuẩn bị chất kháng nấm
Các chất kháng nấm được hòa tan trong dung dịch Polyethylen glycol – cồn ethyl (75:25) với nồng độ gấp 10 lần nồng độ thử nghiệm, rồi được pha loãng 10 lần trong môi trường thạch YPG có bổ sung 0,05 % Tween 80 thành dãy nồng độ thử nghiệm: Terbinafin từ
2 – 0,06 %; Ketoconazole: 2 – 0,06 %; Cao bông móng tay: 0,5 – 0,015 %; 2-methoxy-1,4-naphthoquinon: 0,5 – 0,015 %
Móng sau khi được gây nhiễm nấm được chuyển sang đĩa petri môi trường chứa chất kháng nấm, đặt lưng móng tiếp xúc với môi trường, nền móng hướng lên trên, ủ 37 oC Sau
từ 5 – 7 ngày quan sát sự phát triển của Candida albicans quanh móng bằng mắt thường để xác
định nồng độ tối thiểu ức chế vi nấm
Sau khi đọc kết quả, các móng không thấy
có vi nấm phát triển quanh móng sẽ được chuyển đĩa petri có chứa môi trường thạch Sabouraud mới, ủ 37 oC trong 2 ngày để xác định nồng độ tối thiểu diệt nấm (MFC) trên
mô móng
KẾT QUẢ
Nồng độ tối thiểu ức chế sự phát triển của
Candida albicans và Candida non albicans in vitro
của 2-methoxy-1,4-naphthoquinon so với cao BMT và ketoconazol
Kết quả ở bảng 1 cho thấy
2-methoxy-1,4-naphthoquinon cho tác động kháng Candida spp
in vitro tương đương cao BMT, và tác động trên những chủng C albicans nhạy trung gian với
ketoconazol
Trang 4Bảng 1 Tác động kháng Candida spp của
2-methoxy-1,4-naphthoquinon in vitro
Phân bố các chủng theo khoảng MIC ( μg/ml)
Chủng nấm Chất kháng nấm
<8 8-16 >16
Ketoconazole 16 5 0 Cao BMT 0 20 1
Candida
albicans (n=21)
2-methoxy-1,4-naphthoquinon 0 20 0 Ketoconazole 12 0 0 Cao BMT 0 12 0
Candida non
albicans (n=12)
2-methoxy-1,4-naphthoquinon 0 11 1
Tác động kháng Candida albicans dạng
biofilm của 2-methoxy-1,4-naphthoquinon so
với cao BMT và ketoconazol
Bảng 2 So sánh MIC của các chất kháng nấm trên
dạng biofilm và dạng nấm men của C albicans
Chất kháng nấm MIC biofilm (µg/ml) MIC in vitro (µg/ml)
2-methoxy-1,4-naphthoquinon 32 8
Ketoconazol 0,9 0,06 - 0,125
Ghi chú: Số liệu nhận được là trung bình của 9 lần lập lại
thử nghiệm
Kết quả bảng 2 cho thấy, nồng độ tối thiểu
ức chế C albicans dạng biofilm của ketoconazol
là 0,9 µg/ ml, cao hơn nồng độ MIC in vitro
khoảng 10 lần.2-methoxy-1,4-naphthoquinon và
cao Bông móng tay có nồng độ ức chế tối thiểu
C albicans dạng biofilm là 32 x 10-3 mg/ml, gấp
2-4 lần MIC in vitro Riêng Nystatin là chất cho tác
dụng diệt nấm Candida albicans nên cho MIC
biofilm tương đương MIC in vitro.
Tác động kháng Candida albicans trên mô
móng của 2-methoxy-1,4-naphthoquinon so với
cao BMT, ketoconazol và terbinafin
Bảng 3 Tác động kháng C albicans ở mô hình móng
của các chất kháng nấm
Nồng độ chất thử (mg/ml) Chất thử
MIC
(in vitro)
MIC
(ex vivo)
MFC
(ex vivo)
Ketoconazol 0,03 x 10 -3 10 20
Cao Bông móng tay 0,016 1,25 2,5
Nồng độ chất thử (mg/ml) Chất thử
MIC
(in vitro)
MIC
(ex vivo)
MFC
(ex vivo)
2-methoxy-1,4-naphtoquinon 0,008 1,25 5
Ghi chú: (-) không thử Các nồng độ MIC và MFC ex vivo được thực
hiện với ít nhất 6 mẫu móng tay khác nhau cho mỗi chất kháng nấm
Thí nghiệm được thực hiện song song với lô chứng gồm 6 mẫu móng tay được gây nhiễm nhưng không tiếp xúc với các chất kháng nấm
BÀN LUẬN
Tác động kháng Candida spp của
2-methoxy-1,4-naphthoquinon, cao BMT và
ketoconazol in vitro:
Kết quả ở bảng 1 cho thấy: Tỉ lệ các chủng
Candida phân lập từ bệnh nhân nhiễm Candida
niêm mạc nhạy với ketoconazol, với khoảng MIC < 8 μg/ml là 16/21, chiếm 76,19%; 5/21 chủng có độ nhạy trung gian với MIC từ 8-16 μg/ml chiếm 23,81%; không có chủng kháng ketoconazol
2-methoxy-1,4-naphthoquinon cho tác động
kháng Candida spp in vitro tương đương cao BMT và tác động trên những chủng C albicans
nhạy trung gian với ketoconazol
Tác động kháng Candida albicans dạng
biofilm của 2-methoxy-1,4-naphthoquinon
so với cao BMT và ketoconazol
Kết quả khảo sát tác động của các chất
kháng nấm trên C albicans dạng biofilm được tạo trên bảng nhựa polystyren cho thấy: Nystatin là chất cho tác dụng diệt nấm Candida albicans nên cho MIC biofilm tương đương MIC
in vitro Các chất thử nghiệm còn lại đều có nồng
độ tối thiểu tác động trên C albicans dạng biofilm cao hơn MIC in vitro Ketoconazol là chất kìm nấm cho nồng độ tối thiểu ức chế C albicans dạng biofilm cao hơn nồng độ MIC in vitro
khoảng 10 lần.2-methoxy-1,4-naphthoquinon và cao Bông móng tay ức chế được dạng biofilm
của C albicans với nồng độ ức chế tối thiểu cao
Trang 5gấp 2-4 lần MIC in vitro, nên là một ứng viên có
thể nghiên cứu tiếp theo để sử dụng như nguồn
nguyên liệu làm thuốc kháng nấm
Khảo sát tác động kháng C albicans trên
mô móng tay của các chất kháng nấm
So sánh tác động kháng C albicans in vitro và
tác động kháng Candida albicans trên mô móng
tay (ex vivo) của ketoconazol, có thể thấy sự khác
biệt về nồng độ ức chế nấm giữa hai phương
pháp thử rất lớn, MIC ex vivo của ketoconazol
cao hơn MIC in vitro khoảng 33 ngàn lần Nồng
độ MIC và MFC ex vivo của ketoconazol phù
hợp với nồng độ trong chế phẩm dung ngoài
đang lưu hành trên thị trường (kem Nizoral*
chứa hoạt chất ketoconazol 2 %)
Nồng độ MIC và MFC ex vivo của terbinafin
cũng nằm trong khoảng nồng độ của chế phẩm
Lamisil* đang lưu hành trên thị trường (kem
lamisil* chứa hoạt chất Terbinafin 1 %)
Nồng độ MIC và MFC ex vivo của cao Bông
móng tay và 2-methoxy-1,4-naphthoquinon cao
hơn MIC in vitro từ 156 – 625 lần
2-methoxy-1,4-naphthoquinon tuy có MIC in vitro và ex vivo
thấp hơn cao Bông móng tay, nhưng MFC ex
vivo lại cao hơn gấp đôi, điều này có thể do khả
năng thấm vào móng của cao Bông móng tay tốt
hơn 2-methoxy-1,4-naphthoquinon, hoạt chất
riêng rẽ
Do có sự khác biệt lớn giữa nồng độ tác
động kháng C albicans của chất thử in vitro và
ex vivo, đồng thời có sự phù hợp giữa nồng độ tác động kháng C albicans ở móng và nồng độ
của chất thử trong các chế phẩm đang lưu hành trên thị trường nên có thể áp dụng mô
hình này để phỏng đoán liều thử nghiệm in vivo của một số chất kháng nấm mới nhằm
giảm được thời gian dò liều, giảm số thú thử nghiệm và giảm chi phí
Cảm ơn: Nhóm nghiên cứu chân thành cảm ơn Khoa Dược, Đại học Y Dược TP HCM đã cung cấp kinh phí và tạo điều kiện nghiên cứu
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1 Ernst J.E và Rogers P.D (2007), Methods in Molecular
medicine, Antifungal agent - methods and protocols, Vol.188,
Humana Press Inc, Totowa, NJ, 71-75
2 Gülhan Vardcer-Ünlü, (1998) A comparison of germ tube
production by Candida albicans in three media, Tr J of
Biology, 22, 2005-2010
3 Jain N., Kohli R., Cook E., Gialanella P., Chang T., and Fries B.C (2007), Biofilm formation by and antifungal susceptibility
of Candida isolate from urine, Applied and enviromental
microbiology, ASM 1697-1703
4 Nguyen Đinh Nga, Nguyen Vu Giang Bac, Nguyen Thu Guong (2009) Using the experimental tinea unguium model
to evaluate the antifungal activity against Trichophyton of
some plant extracts Pharma Indochina VI-(The development
of Indochina Pharmacy in context of Global economic Recession) Proceeding of the sixth Indochina Conference on Pharmaceutical Sciences 771-775
5 Trần Thành Đạo, Nguyễn Đinh Nga (2009) Tổng hợp và tác dụng kháng nấm của methyl lawson, thành phần chính của cây bông móng tay Tạp chí dược học, 49(395), 29-32
6 Yazdanparast S.A and Bartin C.R (2006), Athroconidia
production in Trichophyton rubrum and new ex vivo model of onychomycosis, Journal of Medical Microbiology, 55,
1577-1581