Xác định đột biến kháng thuốc thứ phát T790m trên gen EGFR ở bệnh nhân ung thư phổi không tế bào nhỏ kháng với thuốc điều trị đích

Các bệnh nhân này đã được xác định trước đó là có đột biến đáp ứng với thuốc TKI (xoá đoạn exon 19 hoặc L858R) trên gen EGFR. Trong nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành xác định đột biến kháng thuốc thứ phát T790M exon 20 trên gen EGFR ở 11 bệnh nhân ung thư phổi không tế bào nhỏ đã được xác định là có dấu hiệu kém đáp ứng với thuốc ức chế EGFR TKI

XÁC ĐỊNH ĐỘT BIẾN KHÁNG THUỐC THỨ PHÁT T790M TRÊN GEN EGFR Ở BỆNH NHÂN UNG THƯ PHỔI

KHÔNG TẾ BÀO NHỎ KHÁNG VỚI THUỐC ĐIỀU TRỊ ĐÍCH

Trần Huy Thịnh, Trần Vân Khánh, Trần Quốc Đạt

Trường Đại học Y Hà Nội

Khoảng 50% bệnh nhân ung thư phổi không tế bào nhỏ có xuất hiện đột biến kháng thuốc thứ phát T790M sau khoảng 10 - 20 tháng điều trị với thuốc ức chế hoạt tính tyrosine kinase (TKI, tyrosine kinase inhibitor) của EGFR (Epidermal Growth Factor Receptor) Các bệnh nhân này đã được xác định trước đó là

có đột biến đáp ứng với thuốc TKI (xoá đoạn exon 19 hoặc L858R) trên gen EGFR Trong nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành xác định đột biến kháng thuốc thứ phát T790M exon 20 trên gen EGFR ở 11 bệnh nhân ung thư phổi không tế bào nhỏ đã được xác định là có dấu hiệu kém đáp ứng với thuốc ức chế EGFR TKI DNA đã được tách chiết từ mẫu mô sinh thiết lại để xác định đột biến T790M exon 20 trên gen EGFR, kỹ thuật giải trình tự gen truyền thống và kỹ thuật Scorpions ARMS (Scorpions - Amplification Refractory Muta-tion System) với độ nhạy cao khoảng 0,01% đã được áp dụng để xác định đột biến.Kết quả cho thấy đã phát hiện được 5/11 (45%) bệnh nhân có đột biến kháng thuốc T790M exon 20 trên gen EGFR, trong đó 2 trường hợp có thể xác định được đột biến bằng cả 2 kỹ thuật giải trình tự gen và Scorpions ARMS và 3 trường hợp chỉ phát hiện được bằng kỹ thuật Scorpions ARMS Đây mới chỉ là nghiên cứu bước đầu, chúng tôi cần có một nghiên cứu với cỡ mẫu nghiên cứu lớn hơn để đưa ra một kết quả toàn diện hơn.

Từ khóa: Ung thư phổi không tế bào nhỏ, Kháng TKI, Đột biến T790M

Địa chỉ liên hệ: Trần Huy Thịnh, Bộ môn Hóa sinh, Trường

Đại học Y Hà Nội

Email: huytihinhda@yahoo.com

Ngày nhận: 10/10/2015

Ngày được chấp thuận: 26/02/2016

I ĐẶT VẤN ĐỀ

Hiện nay, trên toàn thế giới và tại Việt

Nam, ung thư phổi là loại ung thư phổ biến

nhất và có tỷ lệ tử vong cao nhất [1], với 80

-90% là thể không tế bào nhỏ, còn lại là thể tế

bào nhỏ.Thụ thể yếu tố phát triển biểu mô

EGFR (epidermal growth factor receptor) đã

trở thành đích nhắm cho liệu pháp điều trị mới

đối với nhóm bệnh ung thư phổi không tế bào

nhỏ [2] Ung thư phổi không tế bào nhỏ có đột

biến gen EGFR đáp ứng tốt với thuốc ức chế

tyrosine kinase của EGFR (EGFR TKI), là cơ

sở cho liệu pháp điều trị trúng đích [3] Nhiều

nghiên cứu cho thấy bệnh nhân ung thư phổi

không tế bào nhỏ giai đoạn muộn mang đột

biến gen EGFR làm tăng tính nhạy cảm với EGFR TKI có tỷ lệ đáp ứng với thuốc EGFR TKI rất cao, trên 60%, và kéo dài được thời gian sống bệnh không tiến triển (PFS) trung bình trên 9 tháng [4] Tuy nhiên, dưới áp lực chọn lọc của các tế bào khối u với thuốc, sau khoảng 10 - 20 tháng điều trị, bệnh tiến triển trở lại ở hầu hết các bệnh nhân có đáp ứng tốt ban đầu, thể hiện tình trạng “trơ” của tế bào khối u với thuốc [5] Y học đã ghi nhận một số

cơ chế gây nên tình trạng kháng thuốc EGFR TKI; trong đó có sự xuất hiện một số đột biến mới tại chính phân tử EGFR (đột biến T790M tại exon 20, đột biến L747S hoặc D761Y tại exon 19, đột biến T854A tại exon 21…), sự khuếch đại gen cMET (gen mã hóa thụ thế yếu tố phát triển tế bào gan), sự chuyển dạng biểu mô - trung mô hoặc sự chuyển từ dạng không tế bào nhỏ sang dạng tế bào nhỏ Đột biến thứ phát T790M trên exon 20 gen EGFR

là nguyên nhân phổ biến nhất, chiếm khoảng

50% các trường hợp [6; 7] Chẩn đoán phân

tử thông qua tái sinh thiết khối u để xác định

cơ chế kháng thuốc từ đó lựa chọn hướng

điều trị mới cho bệnh nhân đóng vai trò quan

trọng Có nhiều kỹ thuật phát hiện đột biến

kháng thuốc T790M exon 20 trên gen EGFR

và độ nhạy của mỗi kỹ thuật phụ thuộc vào

mật độ tế bào ung thư trong mẫu mô Hai kỹ

thuật đang được sử dụng phổ biến là giải trình

tự gen và Scorpion ARMS Kỹ thuật giải trình

tự gen có giá thành cạnh tranh hơn nhưng

không phát hiện được đột biến gen nếu mẫu

mô có ít tế bào đột biến Kỹ thuật Scorpions

ARMS có độ nhạy cao hơn có thể phát hiện

đột biến gen EGFR khi alen đột biến chiếm tỷ

lệ nhỏ, nhưng giá thành rất cao [8] Đề tài

được thực hiện với mục tiêu: Xác định đột

biến T790M trên gen EGFR ở bệnh nhân ung

thư phổi không tế bào nhỏ bằng kỹ thuật giải

trình tự gen và Scorpions ARMS

II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP

1 Đối tượng

Mẫu mô sinh thiết lại hoặc khối tế bào của

11 bệnh nhân ung thư phổi không tế bào nhỏ

được thu thập tại Bệnh viện K Trung ương,

Bệnh viện Hữu Nghị và Bệnh viện Bạch Mai

Các bệnh nhân này được chẩn đoán xác định

ung thư phổi biểu mô tuyến giai đoạn từ IIIB

-IV dựa vào đặc điểm lâm sàng và kết quả mô

bệnh học Bệnh nhân đã được xét nghiệm gen

EGFR ở mẫu mô sinh thiết lần 1 trước khi

điều trị đích và đã được xác định có đột biến

đáp ứng với với thuốc ức chế EGFRTKI (6

bệnh nhân có đột biến mất đoạn điển hình

LREA tại exon 19 và 5 bệnh nhân có đột biến

L858R tại exon 21), ngoài ra không phát hiện

thêm bất cứ đột biến nào khác trên gen

EGFR Bệnh nhân được sử dụng thuốc ức

chế EGFRTKI, được theo dõi đáp ứng thuốc

theo tiêu chuẩn RECIST v1.1 và được đánh giá tình trạng kháng thứ phát thuốc EGFR TKI theo tiêu chuẩn của Jackman và cộng sự [9] Địa điểm nghiên cứu: Trung tâm Nghiên cứu Gen - Protein, Trường Đại học Y Hà Nội

2 Phương pháp

- Kỹ thuật tách chiết DNA: mẫu mô được

lựa chọn chính xác vùng tế bào ung thư Parafin được loại bỏ bằng xylen DNA được tách chiết theo qui trình phenol/chloroform (protein được phân huỷ bằng Proteinase K với nồng độ 1 mg/mL) Nồng độ và độ tinh sạch của DNA được xác định bằng máy Nano -Drop, những mẫu DNA đạt giá trị OD 280/ OD260 ≥ 1,8 được sử dụng để phân tích

- Kỹ thuật giải trình tự gen: sau khi

khuyếch đại exon 19, và exon 21 của gen EGFR bằng kỹ thuật PCR, sản phẩm PCR được tinh sạch từ gel agarose, sử dụng Promega Wizard SV gel clean-up system (Promega, USA) và sau đó được đưa vào giải trình tự bằng phương pháp BigDye terminator sequencing (Applied Biosystems, Foster city, USA) Trình tự gen được đối chiếu và so sánh với trình tự Genebank của gen EGFR

- Kỹ thuật Scorpions ARMS: là sự kết

hợp của kỹ thuật khuếch đại đặc hiệu alen đột biến (ARMS) và công nghệ Scorpions trong phản ứng real - time PCR để phát hiện các đột biến gen EGFR và đột biến kháng thuốc T790M ở exon 21 Quy trình kỹ thuật theo Kit của hãng QIAGEN [10]

3 Đạo đức trong nghiên cứu

Nghiên cứu tuân thủ chặt chẽ đạo đức nghiên cứu trong Y học Bệnh nhân hoàn toàn

tự nguyện tham gia vào nghiên cứu Bệnh nhân có quyền rút lui khỏi nghiên cứu khi không đồng ý tiếp tục tham gia vào nghiên cứu Các thông tin cá nhân sẽ được đảm bảo

bí mật

III KẾT QUẢ

Sử dụng kỹ thuật giải trình tự gen và

Scor-pion ARMS để phát hiện đột biến gen EGFR

cho đối tượng nghiên cứu Kết quả cho thấy đã

phát hiện được 5/11 (45%) bệnh nhân có đột

biến kháng thuốc T790M exon 20, trong đó 2 trường hợp xác định được đột biến bằng cả 2

kỹ thuật giải trình tự gen và Scorpions ARMS

và 3 trường hợp chỉ phát hiện được đột biến bằng kỹ thuật Scorpions ARMS (bảng 1)

Bảng 1 Kết quả phát hiện đột biến gen EGFR trước và sau điều trị EGFR TKI

MS Chẩn đoán

lâm sàng

Đột biến gen trước điều trị EGFR TKI

Đột biến gen sau điều trị EGFR TKI Giải trình tự gen Scorpions ARMS

Tại thời điểm trước điều trị EGFR TKI, khi phân tích mẫu DNA bằng kỹ thuật giải trình tự gen

và Scorpion ARMS, bệnh nhân có đột biến L858R exon 21, không có đột biến gen EGFR nào khác, chứng tỏ tại thời điểm này, bệnh nhân chỉ có đột biến L858Rexon 21 làm tăng tính nhạy cảm với thuốc EGFR TKI

Tại thời điểm bệnh tiến triển, khi phân tích mẫu DNA bằng kỹ thuật giải trình tự gen và Scorpion ARMS, ngoài đột biến L858R exon 21 đã phát hiện trước khi điều trị, xuất hiện thêm đột biến T790M exon 20, chứng tỏ tại thời điểm này, bệnh nhân đã xuất hiện thêm đột biến thứ phát T790M gây kháng thuốc EGFR TKI (hình 1)

Kết quả giải trình tự gen

Kết quả Scorpion ARMS

Hình 1 Kết quả xác định đột biến gen EGFR của bệnh nhân MS5 trước điều trị (A)

và sau khi điều trị (B)

Tại thời điểm trước điều trị EGFR TKI, khi phân tích mẫu DNA bằng kỹ thuật giải trình tự gen

và Scorpion ARMS, bệnh nhân có đột biến xóa đoạn LREA exon 19, không có đột biến gen EGFR nào khác, chứng tỏ tại thời điểm này, bệnh nhân chỉ có đột biến LREA exon 19 làm tăng tính nhạy cảm với thuốc EGFR TKI

Tại thời điểm bệnh tiến triển, khi phân tích mẫu DNA bằng kỹ thuật giải trình tự gen thấy có tín hiệu nghi ngờ của đột biến T790M exon 20 Khi kiểm tra lại bằng kỹ thuật Scorpion ARMS, ngoài đột biến LREA exon 19 đã phát hiện trước khi điều trị, xuất hiện thêm đột biến T790M exon 20, chứng tỏ tại thời điểm này, bệnh nhân đã xuất hiện thêm đột biến thứ phát T790M exon 20 gây kháng thuốc EGFR TKI (hình 2)

Hình 2 Kết quả xác định đột biến gen EGFR của bệnh nhân MS9 trước điều trị (A)

và sau khi điều trị (B)

Kết quả giải trình tự gen Kết quả Scorpion ARMS

IV BÀN LUẬN

Cơ chế kháng thuốc điều trị đích đầu tiên ở

bệnh nhân ung thư phổi không tế bào nhỏ

được chứng minh là sự xuất hiện đột biến

điểm T790M tại exon 20 gen EGFR Phát hiện

này được công bố bởi hai nhóm nghiên cứu

độc lập của Kobayashi và Pao năm 2005 sau

khi tiến hành phân tích những bệnh nhân

mang đột biến LREA, L858R xuất hiện tính

kháng sau khoảng thời gian ban đầu đáp ứng

tốt với thuốc điều trị đích [10; 11] Sự biến đổi cấu trúc tại vùng giữ chức năng tyrosine kinase (exon 18 21) của protein EGFR gây giảm ái lực của protein EGFR với ATP tại khe gắn ATP Do đó, phân tử thuốc EGFR TKI không phải cạnh tranh với ATP và EGFR trở nên nhạy cảm hơn với thuốc [12] Theo thời gian tiếp xúc liên tục với thuốc điều trị đích EGFR TKI, gen EGFR của tế bào ung thư đã

xuất hiện một đột biến mới là đột biến điểm

T790M ở exon 20, sự biến đổi cấu trúc protein

EGFR tại vị trí đột biến T790M không tạo ra

sự phong tỏa về vị trí không gian đối với thuốc

TKI mà nó làm hồi sinh ái lực của EGFR với

ATP, đối kháng lại cơ chế ức chế kinase theo

kiểu cạnh tranh ATP của TKI [13] Theo đó,

các TKI ức chế thuận nghịch như erlotinib

hoặc gefitinib có hiệu quả rất giới hạn với thể

đột biến T790M, trong khi các TKI không

thuận nghịch như afatinib có thể vượt qua

hiện tượng này nhờ hình thành các nối cộng

hóa trị với vùng gắn ATP, do đó giúp kéo dài

hiệu quả ức chế hoạt tính tyrosine kinase [14]

Thử nghiệm in vitro cho thấy nồng độ Gefitinib

hoặc Erlotinib tối thiểu để ức chế protein

EGFR - T790M cao gấp 300 lần nồng độ để

cần thiết để ức chế protein EGFR-LREA,

L858R [15; 16] Hệ quả là dòng tế bào ung

thư phổi mang đột biến T790M exon 20 (dòng

H1975) có khả năng chịu Gefitinib, Erlotinib tốt

hơn nhiều so với dòng mang đột biến LREA

(dòng H3255) và L858R (dòng HCC827) Hiện

nay có 2 cơ chế được các nhà khoa học đề

xuất nhằm giải thích mối liên quan giữa đột

biến T790M và tính kháng của tế bào ung thư

phổi: i) Ở mức độ cấu trúc, sự thay đổi

Threonin thành Methionin gây biến đổi vị trí

tương tác của vùng kinase, ức chế hoàn toàn

sự bám của Erlotinib và Gefitinib ii) Ở góc độ

tương tác giữa các phân tử sinh học, đột biến

T790M khôi phục lại ái lực của vùng kinase

với ATP trong khi giảm ái lực với Erlotinib và

Gefitinib [10, 13] Tiến hành phân tích trên số

lượng lớn bệnh nhân ung thư phổi không tế

bào nhỏ, các nhà khoa học phát hiện thấy đột

biến T790M chiếm 50% trường hợp kháng

thuốc sau điều trị Gefitinib hoặc Erlotinib, các

dạng đột biến còn lại chiếm dưới 5% [10, 17]

Trong nghiên cứu này, đột biến T790M đã

được phát hiện ở 5/11 (45%) bệnh nhân ung

thư phổi không tế bào nhỏ sau khi sử dụng thuốc ức chế TKI EGFR và được đánh giá tình trạng kháng thứ phát thuốc EGFR TKI theo tiêu chuẩn của Jackman và cộng sự [9] Nghiên cứu có sử dụng cả 2 kỹ thuật giải trình

tự gen và Scorpion ARMS (kỹ thuật có độ nhạy cao 0,01%) nhưng tỷ lệ phát hiện đột biến T790M thấp hơn so với một số nghiên cứu trước đây có thể do cỡ mẫu hạn chế [10; 17] Đặc biệt, có 3 bệnh nhân không phát hiện được đột biến kháng thuốc T790M exon 20 (hoặc có tín hiệu nghi ngờ) bằng kỹ thuật giải trình tự gen mà chỉ phát hiện được bằng kỹ thuật Scorpion ARMS, điều này có thể lý giải

do lượng tế bào ung thư phổi mang đột biến T790M exon 20 thu thập được từ mẫu mô nghiên cứu hạn chế Chúng tôi cần có một nghiên cứu tiếp theo với cỡ mẫu lớn hơn để đưa ra một kết quả nghiên cứu toàn diện hơn

V KẾT LUẬN

Sử dụng cả 2 kỹ thuật giải trình tự gen và Scorpions ARMS đã phát hiện được 5/11 (45%) bệnh nhân ung thư phổi không tế bào nhỏ có đột biến kháng thuốc thứ phát T790M exon 20 trên gen EGFR

Lời cảm ơn

Nhóm nghiên cứu trân trọng cảm ơn Bệnh viện K Trung ương, Bệnh viện Hữu Nghị và Trung tâm Y học hạt nhân và Ung bướu, Bệnh viện Bạch Mai đã giúp đỡ trong quá trình thực hiện nghiên cứu Đề tài được thực hiện với sự

hỗ trợ kinh phí của đề tài cấp nhà nước

“Nghiên cứu những biến đổi trong bộ gen tế bào ung thư phổi và lơ-xê-mi kinh dòng hạt kháng thuốc điều trị đích” thuộc chương trình KC.04.16/11-15

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1 Jemal A, Bray F, Ward E et al (2011).

Global cancer statistics CA Cancer J Clin, 61

(2), 69 - 90.

2 Chu Hồng Thắng, Lê Trần Ngoan, Lê

Hoài Chương, Vũ Thị Nguyệt Ánh (2013).

Tình hình tử vong do ung thư tại Hà Nội và

Thái Nguyên, 2005 - 2008 Tạp chí Thông Tin

Y Dược, 4, 50 - 54.

3 Pao W, Miller VA (2005) Epidermal

growth factor receptor mutations,

small-molecule kinase inhibitors, and non-small-cell

lung cancer: current knowledge and future

directions J Clin Oncol, 23(11), 2556 - 2568.

4 Ohashi K., Maruvka Y., Michor F and

Pao W (2013) Epidermal Growth Factor

Re-ceptor Tyrosine Kinase Inhibitor– Resistant

Disease J Clin Oncol, 31, 1 - 12.

5 Nurwidya F., Takahashi F., Murakami

A., et al (2014).Acquired resistance of

non-small cell lung cancer to epidermal growth

factor receptor tyrosine kinase inhibitors

Respiratory Investigation, 52(2), 81 - 91.

6 Engelman J.A., Zejnullahu K.,

Mitsu-domi T et al (2007) MET amplification leads

to gefitinib resistance in lung cancer by

activating ERBB3 signaling Science, 316, 1039

-1043

7 Sequist L.V., Waltman B.A.,

Dias-Santagata D et al (2011) Genotypic and

histological evolution of lung cancers acquiring

resistance to EGFR inhibitors Sci Transl Med,

375, 26.

8 Pao W and Ladanyi M (2007)

Epider-mal Growth Factor Receptor Mutation Testing

in Lung Cancer: Searching for the Ideal

Method.Clin Cancer Res,13, 4954 - 4955.

9 Jackman D., Pao W., Riely G.J (2010).

Clinical definition of acquired resistance to

epidermal growth factor receptor tyrosine

kinase inhibitors in non-small-cell lung cancer

J Clin Oncol, 28(2), 357 - 360.

10 Kobayashi S, Boggon TJ, Dayaram T (2005) EGFR mutation and resistance of non

small-cell lung cancer to gefitinib N Engl J

Med, 352, 786 – 792.

11 Pao W., Millere VA., Politi KA

Acqui-red resistance of lung adenocarcinomas to gefitinib or erlotinib is associated with a se-cond mutation in the EGFR kinase

do-main PLoS Med, 2, 73.

12 Dienstmann R., Martinez P., Felip E (2011) Personalizing therapy with targeted

agents in non-small cell lung cancer

Oncotarget, 2(3), 165 - 177.

13 Yun C.H., Mengwasser K.E., Toms A.V et al (2008) The T790Mmutation in

EGFR kinase causes drug resistance by

in-creasingthe affinity for ATP Proceedings of the National Academy of Sciences of the

United States of America, 105(6), 2070–2075.

14 Li D., Ambrogio L., Shimamura T., (2008). BIBW2992, anirreversible EGFR/ HER2 inhibitor highly effective in preclinical

lung cancer models Oncogene, 27(34), 4702

-4711

15 Kosaka T, Yatabe Y, Endoh H (2006).

Analysis of epidermal growth factor receptor gene mutation inpatients with non-small cell lung cancer and acquired resistance to

gefiti-nib Clin Cancer Res, 12, 5764 – 5769.

16 Avizienyte E, Ward RA, Garner AP (2008) Comparison of the EGFR resistance

mutation profiles generated by EGFR targeted tyrosine kinase inhibitors and the impact of

drug combinations Biochem J, 415,197 - 206.

17 Oxnard GR, Miller VA, Robson ME (2012) Screening for germline EGFR T790M

mutations through lung cancer genotyping J

Thorac Oncol, l7, 1049 - 1052.

Summary IDENTIFICATION OF A SECONDARY EGFR T790M MUTATION BY REBIOPSY OF NON-SMALL CELL LUNG CANCER PATIENTS WITH ACQUIRED RESISTANCE TO TYROSINE KINASE INHIBITOR

Approximately 50% of non-small cell lung cancer patients with epidermal growth factor receptor (EGFR) - mutations (deletion in exon 19 or L858R) who develop acquired resistance to EGFR tyrosine kinase inhibitors (TKIs) reportedly carry a secondary EGFR T790M mutation This phenomenon prevails after 10 - 20 months of treatment in most of patients This study investi-gated 11 EGFR-mutant patients who had undergone rebiopsy after TKI failure DNA was extracted from tumor tissues and examined for the presence of T790M, using a standard sequencing based method followed by Scorpions ARMS (Scorpions - Amplification Refractory Mutation System) method with an analytical sensitivity of approximately 0.01% Analysis of 11 patients detected 5 mutants (45%), including 2 mutants can detect by both sequencing and Scor-pions ARMS method and 3 mutants only can detect by ScorScor-pions ARMS method due to limited cancer tissues after rebiopsy We need to study more with larger number of patients to confirm this result

Keywords: Non-small cell lung cancer, TKI acquired resistance, Secondary T790M mutation