Mục tiêu nghiên cứu của bài viết nhằm đánh giá hiệu quả khử khuẩn của tia gamma lên các mảnh xương vòm sọ chó sau chiếu xạ và đánh giá sự biến đổi về cấu trúc vi thể ở các mảnh xương vòm sọ chó sau chiếu xạ.
Trang 1HIỆU QUẢ KHỬ KHUẨN VÀ ẢNH HƯỞNG CỦA TIA GAMMA LÊN CẤU TRÚC VI THỂ CỦA XƯƠNG VÒM SỌ CHÓ
BẢO QUẢN LẠNH SÂU
Nguyễn Phương Thảo Tiên, Trần Anh Hùng, Lê Văn Tâm, Phùng Hữu Thảo, Nguyễn Phan Quỳnh Anh
Trường Đại học Y Dược, Đại học Huế
Tóm tắt
Mục tiêu: Đánh giá hiệu quả khử khuẩn và ảnh hưởng của tia gamma lên cấu trúc vi thể ở những mảnh
xương vòm sọ chó sau chiếu xạ Đối tượng và phương pháp nghiên cứu: 50 cặp mảnh xương vòm sọ chó có
kích thước như nhau, được lấy đối xứng qua đường dọc giữa xương sọ Lô chứng gồm 50 mảnh, chỉ được bảo quản lạnh sâu, không chiếu tia gamma Lô thực nghiệm gồm 50 mảnh, được bảo quản lạnh sâu và chiếu tia gamma với liều 25kGy Đánh giá hiệu quả khử khuẩn và so sánh sự biến đổi về cấu trúc vi thể của các lô với
nhau Kết quả: Sau chiếu tia gamma với liều 25 kGy, tất cả các mảnh xương vòm sọ chó đều có kết quả cấy khuẩn âm tính Ở mức độ vi thể, không thấy có sự biến đổi cấu trúc ở các mảnh xương được chiếu xạ Kết
luận: Tia gamma với liều chiếu 25 kGy: (i) Có khả năng diệt khuẩn hoàn toàn đối với các chủng loại vi khuẩn
thường nhiễm trong các loại mô (ii) Không gây biến đổi cấu trúc của mô xương sọ ở mức độ cấu tạo vi thể
Từ khóa: Xương sọ chó, tia gamma, khử khuẩn
Abstract
THE EFFECT OF GAMMA STERILIZATION AND ITS EFFECT ON MICROSCOPIC STRUCTURE OF DEEP FROZEN DOG SKULL
Nguyen Phuong Thao Tien, Tran Anh Hung, Le Van Tam, Phung Huu Thao, Nguyen Phan Quynh Anh
Hue University of Medicine and Pharmacy, Hue University
Objective: To evaluate the effect of gamma sterilization and its effect on microscopic structure of deeply
frozen dog skull Subjects and methods: 50 pairs of dog skull fragments have the same size,which were taken
symmetrically through the midline of the skull, were divided into two lots Evidentlot consisting of 50 pieces are just deeply frozen, not irradicated Experimental lot which was composed of 50 pieces were deeply frozen and exposed to 25kGy of gamma radiation Afterwards, to evaluate the effect of gamma sterilization and
compare the alter of bone matrix between lot groups Results: After gamma irradiation, all dog skull fragments
were negative with bacteriological examination In microscopic scale, no difference was found between the
two lots and there was no structural change in the irradiated fragments of all dog skull Conclusion: Gamma
irradiation with 25 kGy: (i) It has the ability to kill bacteria completely in the type of bacteria commonly infected tissue (ii) It does not alter the structure of dog skull in microstructures
Key words: dog skull, gamma, sterilize
1 ĐẶT VẤN ĐỀ
Chiếu xạ bằng tia gamma là phương pháp vật lý
khử khuẩn phổ biến nhất hiện nay trong qui trình
xử lý, bảo quản lạnh sâu mô xương ở các ngân hàng
mô [2],[4],[7],[8] Hầu hết các sản phẩm mô ghép
cũng như các vật liệu sinh học thay thế mô đều được
khử trùng bằng tia gamma vì nó có ưu điểm: loại trừ
được mầm bệnh có trong mô, không phá huỷ mô
ở liều phù hợp và có thể giảm đáng kể tính kháng
nguyên của mô
Tại Việt Nam, các ngân hàng mô như Ngân hàng
mô Thành phố Hồ Chí Minh, Ngân hàng mô Học viện
Quân Y, Trung tâm Công nghệ mô ghép Đại học Y
Hà Nội và Đơn vị Bảo quản Mô- Bệnh viện Đại học
Y Dược Huế đều dùng tia gamma để khử trùng mô ghép, nhất là mô xương sọ Tuy nhiên, bên cạnh khả năng tiêu diệt vi khuẩn, tia gamma liều cao cũng
có thể làm biến đổi cấu trúc, thậm chí phá hủy mô ghép [1],[2] Do đó,việc đánh giá chất lượng của các mảnh xương sọ sau quá trình bảo quản lạnh sâu có chiếu tia gamma là rất cần thiết Trên thực tế, có rất
ít nghiên cứu được thực hiện trên xương sọ người
do những hạn chế về vấn đề đạo đức y học
Chúng tôi tiến hành đề tài nghiên cứu thực
Địa chỉ liên hệ: Nguyễn Phương Thảo Tiên, email: npthaotien@gmail.com
Ngày nhận bài: 16/8/2017, Ngày đồng ý đăng: 16/3/2018; Ngày xuất bản: 27/4/2018
Trang 2nghiệm “Đánh giá hiệu quả khử khuẩn và ảnh
hưởng của tia gamma lên cấu trúc vi thể của vòm
sọ chó bảo quản lạnh sâu”, với 2 mục tiêu:
1/ Đánh giá hiệu quả khử khuẩn của tia gamma
lên các mảnh xương vòm sọ chó sau chiếu xạ;
2/ Đánh giá sự biến đổi về cấu trúc vi thể ở các
mảnh xương vòm sọ chó sau chiếu xạ.
2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 Đối tượng nghiên cứu
- Động vật: 50 chó ta khỏe mạnh, không phân
biệt đực cái có cân nặng 10 – 12 kg/con
- Tạo các mảnh xương sọ có kích thước khoảng
4x4cm ở đỉnh đầu, theo nguyên tắc đối xứng
- Sau khi được cắt rời khởi cơ thể sống, các
mảnh xương được xử lý theo quy trình xử lý xương
sọ và bảo quản ở nhiệt độ - 85oC tại Đơn vị Bảo quản
Mô, Bệnh viện Trường Đại học Y Dược Huế
2.2 Phân lô nghiên cứu
- Mỗi xương vòm sọ chó được cưa theo đường
dọc giữa chia vòm sọ ra thành hai phần trái (lô A) và
phải (lô B)
- Lô A (lô chứng): chỉ bảo quản lạnh sâu -85ºC,
không chiếu xạ
- Lô B (lô thực nghiệm): bảo quản lạnh sâu
-85ºC, sau đó chiếu xạ với liều chiếu 25 kGy
2.3 Phương pháp nghiên cứu: Nghiên cứu thực
nghiệm
2.3.1 Chiếu xạ:
- Tại Trung tâm chiếu xạ quốc gia (Hà Nội)
- Thời gian chiếu xạ: 24 giờ
- Chọn liều chiếu 25kGy là liều chiếu xạ được
Hiệp Hội Ngân Hàng Mô Châu Á- Thái Bình Dương
khuyến cáo
2.3.2 Phương pháp đánh giá hiệu quả khử
trùng của tia gamma
- Cấy tìm khuẩn lạc ở các mảnh xương sọ ngay
trước khi bắt đầu quy trình xử lý mảnh xương sọ và sau khi mảnh xương sọ chó đã được bảo quản lạnh sâu và chiếu xạ
- Quy trình thực hiện tại Khoa Vi sinh- Bệnh viện Đại học Y Dược Huế
2.3.3 Phương pháp nghiên cứu mô học
- Kỹ thuật làm tiêu bản mô học: thực hiện tại Bộ môn Mô Phôi, Trường Đại học Y Dược Huế
• Cố định mẫu và khử canxi bằng dung dịch formol 8% và acid HNO3 8%
• Chuyển mẫu theo quy trình
• Đúc mô
• Cắt lát mỏng 4 - 5μm
• Nhuộm Hematoxylin – Eosin (H.E)
- Quan sát và chụp ảnh vi thể bằng kính hiển vi truyền hình chụp ảnh:
• Sử dụng kính hiển vi truyền hình chụp ảnh Nikon
• Quan sát cấu trúc vi thể của mảnh xương vòm
sọ chó trước và sau chiếu xạ ở độ phóng đại x 100
và x 400
3 KẾT QUẢ 3.1 Kết quả khử khuẩn của tia gamma ở liều 25 kGy lên mô xương sọ
Trước chiếu xạ, có 39 mẫu xương sọ (78%) có kết quả cấy khuẩn dương tính, 11 mẫu có kết quả âm tính (tỷ lệ 22%) Sau chiếu xạ, tất cả 50 mẫu được kiểm tra cấy khuẩn lại đều cho kết quả âm tính (tỷ
lệ 100%)
Loại mẫu Kết quả
Trước chiếu xạ n=50 Sau chiếu xạn=50
Bảng 1 Kết quả cấy khuẩn các mẫu xương vòm sọ chó
Biểu đồ 1 Kết quả kiểm tra vi khuẩn sau liều chiếu 25 kGy.
Trang 3Kết quả nghiên cứu cấu trúc vi thể mô xương
giữa lô chứng và lô chiếu xạ liều 25 kGy cho thấy
không có sự thay đổi cấu trúc mô xương khi quan
sát trên tiêu bản nhuộm H.E Chất căn bản ưa acid
Cấu trúc các lá xương tương đối rõ, có lá xương chạy
theo hướng thẳng, có lá chạy xiên Trên các lá xương
có nhiều ổ xương Các ổ xương hình tròn hay hình
bầu dục chứa tế bào xương, bào tương tế bào ưa
acid có thể nhìn thấy nhân bắt mầu tím, nhân tròn
hạt nhân rõ Tùy vị trí cắt mà ta có thể nhìn thấy
rõ bào tương, nhân tế bào xương Có vị trí trong ổ
xương ta không nhìn thấy tế bào xương, hoặc chỉ
nhìn thấy một phần tế bào Hình thái cấu tạo của sợi
collagen trong chất căn bản của mô xương không
quan sát được ở mức độ vi thể
4 BÀN LUẬN
4.1 Về hiệu quả khử khuẩn của tia gamma ở
liều 25 kGy lên mô xương sọ
Kết quả cấy khuẩn kiểm tra các mẫu trong cùng
một điều kiện, các mẫu xương sọ sau chiếu xạ đều
âm tính Kết quả này phù hợp với nghiên cứu của Lê
Thị Hồng Nhung (2006) Tia gamma là tia có bước
sóng ngắn nhưng mang năng lượng lớn, đủ sức tiêu
diệt hầu hết vi sinh vật trên đường đi của nó Theo
một số tác giả, ở liều chiếu từ 10 kGy trở lên, tia
gamma đã có khả năng diệt khuẩn [8] Tuy nhiên,
tính kháng xạ của các vi sinh vật là khác nhau, do đó,
vật phẩm bị nhiễm bởi vi sinh vật có tính kháng xạ
cao thì phải dùng liều bức xạ ion hóa cao hơn để khử trùng Mặt khác, việc khống chế nhiễm các vi sinh vật ban đầu cũng gặp nhiều khó khăn mặc dù mô được lấy trong điều kiện vô trùng ngoại khoa, song quá trình vận chuyển, xử lý, đóng gói cũng có thể gây nhiễm Các chủng loại vi sinh vật thường nhiễm trong mô không đa dạng và thường ít kháng xạ [1] Tại Mỹ, các ngân hàng mô thuộc Hiệp hội Ngân hàng
mô Hoa Kỳ (AATB) đều sử dụng liều chiếu 15 kGy Tại Việt nam và các nước có Ngân hàng mô thuộc Hiệp Hội Ngân hàng mô Châu Á- Thái Bình Dương đều sử dụng liều chiếu 25 kGy [4],[7] Sử dụng liều chiếu cao hơn có thể phá hủy mô Do đó, chúng tôi lựa chọn sử dụng liều chiếu an toàn là 25kGy
4.2 Về sự biến đổi về cấu trúc vi thể xương vòm
sọ sau chiếu xạ
Kết quả nghiên cứu cấu trúc vi thể mô xương giữa lô chứng và lô chiếu xạ liều 25 kGy cho thấy không có sự thay đổi cấu trúc mô xương khi quan sát trên tiêu bản nhuộm H.E Kết quả nghiên cứu của chúng tôi phù hợp với nghiên cứu của Lê Thị Hồng Nhung (2010) và Bùi Thanh Thủy (2016) Ngoài ra, chúng tôi chưa tìm thấy công trình nghiên cứu nào chỉ ra sự biến đổi cấu trúc hình thái vi thể của mô xương chiếu xạ và không chiếu xạ Theo chúng tôi,
sự thoái hóa tế bào, thoái hóa mô chỉ có thể quan sát được sau một thời gian dài chiếu tia xạ lên một
cơ thể sống Mẫu mô nghiên cứu của chúng tôi khi chiếu xạ đã là mẫu mô chết Sự biến đổi nếu có chỉ
3.2 Sự biến đổi về cấu trúc vi thể xương vòm sọ sau chiếu xạ.
Hình 1 Hình ảnh vi thể mô xương sọ lô chứng (A: HE x 100; B: HE x 400), lô hấp thụ
tia gamma liều 25 kGy (C: HE x 100; D: HE x 400)
1 Tế bào xương, 2 Chất căn bản, 3 Hốc tủy
Trang 4xảy ra theo hướng lý học: tổn thương vì nhiệt độ
tăng lên khi chiếu xạ Với liều chiếu 25kGy, theo
tính toán nhiệt độ tăng lên là 600C Tuy nhiên, mẫu
mô khi chiếu xạ được bảo quản trong đá khô (đá
C02) để duy trì nhiệt độ - 700C trong khi chiếu nên
khả năng tổn thương do nhiệt không thể xảy ra [1]
Một số công trình nghiên cứu đã chỉ ra rằng, với liều
chiếu từ 25 kGy trở lên, quan sát dưới kính hiển vi
điện tử quét ở mức độ siêu cấu trúc, có thể nhận
thấy được sự đứt gãy các sợi collagen trong chất căn
bản xương [1], [5] Sợi collagen tham gia trực tiếp
vào độ chịu lực cơ học của xương, do đó tổn thương
sợi collagen sẽ làm giảm độ bền của mô xương [6] Ngoài ra sợi collagen còn tham gia dẫn tạo xương trong quá trình sinh xương Trong thực hành lâm sàng, mô ghép xương tỏ ra chậm liền khi bị chiếu xạ liều cao > 50kGy [5]
5 KẾT LUẬN
Tia gamma với liều chiếu 25 kGy:
- Có khả năng diệt khuẩn hoàn toàn đối với các chủng loại vi khuẩn thường nhiễm trong các loại mô
- Không gây biến đổi cấu trúc của mô xương sọ
ở mức độ cấu tạo vi thể
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1 Lê Thị Hồng Nhung (2006) “Nghiên cứu thực nghiệm
lựa chọn liều chiếu tia gamma khử trùng cho mảnh xương sọ
bảo quản lạnh sâu”, Luận văn Thạc sĩ Y học.
2 Ngô Duy Thìn, Lê Thị Hồng Nhung (2012), “Khử
khuẩn bằng tia gamma và ảnh hưởng đến độ bền mô
xương vòm sọ chó bảo quản lạnh sâu”, Tạp chí Nghiên cứu
Y học, Phụ trương 80, số 3C, trang 135-139.
3 Bùi Thanh Thủy (2015), “Đánh giá hiệu quả của
phương pháp ghép tự thân mảnh
xương sọ bảo quản lạnh sâu trên thực nghiệm và ở
người”, Luận án Tiến sĩ Y học
4 AATB (2008), Standards for Tissue Banking,
American Association of Tissue banks, Virgina.
5 Burchardt H (1997), “Biology of bone
transplantation” Orthop Clin North Am.18, pp: 187-196.
6 Loty B, Courpied JP, Tomeno B, Postel M, Forest M, Abelanet R (2005), “Bone allografts sterilised by irradiation Biological properties, procurement and results of 150
massive allografts” Scand J Surg 94 (1), pp: 67 – 70
7 Thai association of tissue banking Bangkok biomaterial center (2001), Advance tissue banking guideline ( 20 years experience of tissue banking in Thailand)
8 Thomas F Baker, Chad J.Ronholdt, MBA and Simon Bogdansky, Ph.D (2005), “Validating low dose gamma sterilization for allografts using iso 111337 method 2B”,
Cell and Tissue Banking 6, pp: 271 -275.