Mục tiêu nghiên cứu của bài viết nhằm đánh giá hiệu quả thuốc chống nấm là rất cấp thiết, cả in vitro và in vivo. Bài viết tiến hành nghiên cứu này nhằm xây dựng mô hình bệnh nấm hệ thống do Candida albicans để áp dụng trong thực tiễn.
Trang 1NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG MÔ HÌNH BỆNH NẤM HỆ THỐNG DO
Lê Trần Anh*; Nguyễn Tuấn Quang*
TÓM TẮT
Mục tiêu: nhu cầu nghiên cứu và đánh giá hiệu quả thuốc chống nấm là rất cấp thiết, cả in vitro
và in vivo Chúng tôi tiến hành nghiên cứu này nhằm xây dựng mô hình bệnh nấm hệ thống do
Candida albicans để áp dụng trong thực tiễn Phương pháp: gây nhiễm chuột nhắt trắng không
suy giảm miễn dịch qua đường tĩnh mạch Kết quả: liều chết tối thiểu của C albicans là 4 x 10 4
tế bào (TB)/chuột Liều LD 10 là 4 x 104; liều LD 90 là 7,5 x 105 TB/chuột Tại ngày thứ 3 (D3) và D8 sau gây nhiễm, mật độ nấm tại thận là 4,52 và 4,06 log10 CFU (đơn vị hình thành khuẩn lạc)/gam, cao hơn so với mật độ nấm tại gan (3,77 và 2,74 log10 CFU/gam) và lách (2,93 và
2,58 log10 CFU/gam) K ết luận: áp dụng mô hình trong đánh giá thấy amphotericin B có tác dụng
kéo dài thời gian sống của chuột nhiễm liều LD 90 và giảm mật độ nấm ở thận nhiễm liều LD 10
* Từ khóa: Candida albicans; Chuột; Amphotericin B; In vivo
Develop a Murine Model of Disseminated Candidiasis to Evaluate the Efficacy of Antifungals in Vivo
Summary
Objectives: To evaluate the efficacy of anti-fungal drugs are urgently needed, both in vitro and in vivo We conducted this study to develop a model of systemic mycosis caused by Candida albicans to apply in practice Methods: Immunocompetent mice were intravenously infected Results: The minimal lethal dose of C albicans was 10 4 cells/mouse LD 10 dose was
4 x 10 4 ; LD 90 dose was 7.5 x 10 5 cells/mouse At day 3 (D3) and D8 after infection, the fungal burden in kidney were 4.52 and 4.06 log10 CFU (colony forming units)/g respectively, higher than that in the liver (3.77 and 2.74 log10 CFU/g) and spleen (2.93 and 2.58 log10 CFU/g) Conclusion: Applying the model to evaluate the efficacy of amphotericin B showed that amphotericin B reduced mortality rate and the fungal burden in kidneys of mice receiving LD 90
and LD 10 , respectively
* Key words: Candida albicans; Mouse; Amphotericin B; In vivo
ĐẶT VẤN ĐỀ
Các bệnh do nấm đang có xu hướng
ngày càng gia tăng, do đó đòi hỏi phải có
thuốc điều trị bệnh an toàn, hiệu quả
Thuốc sản xuất ra trước khi đưa vào áp dụng điều trị cần được đánh giá hiệu quả một cách khách quan, khoa học Trong đánh giá hiệu quả thuốc có kỹ thuật đánh
giá in vitro và in vivo Đánh giá in vitro có thể
* Học viện Quân y
Người phản hồi (Corresponding): Lê Trần Anh (anh lt@vmmu.edu.vn)
Ngày nhận bài: 27/08/2015; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 25/11/2015
Trang 2cung cấp thông tin ban đầu về hiệu quả
thuốc, tuy nhiên thuốc có tác dụng tốt
in vitro không đảm bảo có hiệu lực cao
càng đặc biệt quan trọng trong giai đoạn
tiền lâm sàng nghiên cứu hiệu quả phối
hợp thuốc, các thuốc mới, đánh giá hiệu
quả in vivo cũng như độc tính cấp, mạn
của chúng [4, 6] Candida sp là một trong
những tác nhân gây bệnh nấm hệ thống
hay gặp nhất, trong đó C albicans là căn
nguyên phổ biến, do đó được nhiều tác
giả quan tâm nghiên cứu Việt Nam là
nước có khí hậu nhiệt đới nóng ẩm, thuận
lợi cho nấm và các bệnh nấm phát triển
Hiện nay ở Việt Nam chưa có cơ sở nào
thực hiện gây bệnh nấm hệ thống trên
động vật thực nghiệm để đánh giá hiệu
quả thuốc điều trị Chúng tôi tiến hành đề
tài này với mục tiêu: Xây dựng quy trình
gây bệnh nấm hệ thống do Candida
albicans trên động vật thực nghiệm và áp
dụng đánh giá hiệu quả điều trị bệnh nấm
hệ thống in vivo của amphotericin B để
thử nghiệm mô hình
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU
1 Đối tượng nghiên cứu
- Động vật: chuột nhắt trắng, không phân
biệt đực cái, trọng lượng 20 ± 2 gam
- Nấm: C albicans, chủng ATCC- 90028
2 Vật liệu nghiên cứu
* Dụng cụ:
- Dụng cụ nuôi chuột, giữ chuột để tiêm
tĩnh mạch, bơm tiêm 1 ml, kim 27G
- Dụng cụ nuôi cấy, định lượng nấm: buồng cấy vô trùng, hộp lồng petri, ống nghiệm, que cấy nấm, đèn cồn, kính hiển vi, buồng đếm tế bào Neubauer, máy
ly tâm
- Dụng cụ xác định lượng nấm trong tạng: cân điện tử Mettler Toledo (Thụy Sĩ), chày, cối thủy tinh
* Hóa chất:
- Dung dịch NaCl 0,9%; glucose 5%; gentamicin, formol
- Môi trường Sabouraud (Bio Rad, Pháp)
- Thuốc amphotericin B (amphotret, Bharat Serums and Vaccines Ltd, Ấn Độ)
3 Các kỹ thuật sử dụng trong nghiên cứu
- Nấm C albicans nuôi cấy trong môi trường Sabouraud, ở nhiệt độ phòng theo
kỹ thuật thường quy Vào ngày gây nhiễm, thu hồi nấm bằng nước muối sinh lý, ly tâm hút bỏ dịch 3 lần để rửa Đếm trong buồng đếm tế bào tính toán mật độ nấm
- Tiêm tĩnh mạch đuôi chuột: chuột được giữ trong dụng cụ, bộc lộ đuôi chuột, mỗi lần tiêm 0,2 ml dung dịch nấm/thuốc vào tĩnh mạch đuôi chuột
- Kỹ thuật xác định mật độ nấm trong tạng: lấy tạng bằng phương pháp vô trùng, nghiền trong 2 ml dung dịch NaCl 0,9%
có kháng sinh (gentamycin 160 mg/l) bằng chày/cối vô trùng; hòa loãng 1/10; 1/100 và 1/1.000 lần; cấy trải 0,2 ml trên hộp lồng petri có môi trường Sabouraud, nuôi cấy ở nhiệt độ phòng, đếm khuẩn lạc sau 48 giờ
Trang 3- Kỹ thuật làm tiêu bản mô bệnh học:
lấy ra tạng cố định ngay vào dung dịch
formol, gửi Bộ môn Giải phẫu Bệnh, Học
viện Quân y làm và đọc tiêu bản
4 Chỉ tiêu nghiên cứu và cách theo
dõi
- Liều chết 10% (LD10), LD90 (tế bào/chuột):
sau khi gây nhiễm chuột được theo dõi
sau 14 ngày để đánh giá, tính toán liều
dựa trên phần mềm
- Mật độ nấm ở các tạng: log10 CFU/
gam tạng
- Hiệu quả điều trị: tỷ lệ sống của chuột
nhiễm liều LD90, mật độ nấm ở thận nhiễm
liều LD10 Chuột được gây nhiễm (ngày D0),
tiêm tĩnh mạch amphotericin B liều 1 mg/kg
thể trọng từ D1 đến D7, theo dõi chuột
đến D14
* Xử lý số liệu: số liệu được xử lý bằng
phần mềm SPSS 16.0
* Thời gian, địa điểm nghiên cứu:
- Thời gian nghiên cứu: 10 - 2014 đến
7 - 2015
- Địa điểm nghiên cứu: Labo Nấm, Bộ
môn Ký sinh trùng, Học viện Quân y
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ
BÀN LUẬN
1 Xây dựng quy trình bệnh nấm hệ
thống do C albicans
Bảng 1: Xác định liều nấm C albicans
thấp nhất gây chết chuột
(TB/chuột)
Tình trạng sống/chết
Liều tối thiểu gây chết chuột là 104 TB
Gây nhiễm bệnh nấm hệ thống trên động vật thực nghiệm có thể có nhiều mục đích khác nhau và có thể áp dụng
mô hình khác nhau Chúng tôi lựa chọn
mô hình gây nhiễm C albicans qua đường tĩnh mạch để tạo bệnh nấm hệ thống trên chuột không suy giảm miễn dịch,
vì C albicans là nguyên nhân phổ biến
nhất của bệnh nấm Candida hệ thống và được nghiên cứu nhiều nhất trên động vật; chuột nhắt trắng có nhiều ưu điểm như chi phí thấp, dễ nuôi, điều kiện kỹ thuật tương đối dễ dàng, dễ mua từ các nhà cung cấp
Kết quả tìm được liều chết tối thiểu của chủng C albicans là 104 TB/chuột
Bảng 2: Liều gây chết của C albicans
(TB/chuột)
Liều LD10 là 4 x 104; liều LD90 là 7,5 x 105 TB/chuột
Sau khi lựa chọn được điều kiện thí nghiệm, cần xác định liều gây nhiễm Kết quả tìm LD10 và LD90 của chúng tôi phù hợp với một số tác giả khác C albicans ATCC 90028 có độc lực khá cao, khi gây
Trang 4nhiễm liều 5 - 6,8 x 105 cfu/chuột trung vị,
thời gian sống của chuột 7 ngày [10]
Graybill và CS (1996) thấy liều LD10 là 2,7 x
104 CFU/chuột [5] Liều 1 x 106 CFU/chuột
là liều chuẩn (LD90) trong các nghiên cứu
so sánh hiệu lực kéo dài thời gian sống
[4, 10]
Bảng 3: Mật độ C albicans tại các
tạng sau gây nhiễm liều LD10 (mean ± SE,
log10 CFU/g, n = 5)
Thời
gian
Thận
(1)
Gan (2)
Lách (3)
D3 4,52 ± 0,16 3,77 ± 0,10 2,93 ± 0,25 < 0,05
D8 4,06 ± 0,26 2,74 ± 0,19 2,58 ± 0,32 < 0,05
Tại các thời điểm mật độ nấm ở thận
đều cao hơn ở gan, lách
Kết quả nghiên cứu mật độ nấm tại
một số tạng chuột của chúng tôi phù hợp
với đa số các tác giả: thận là nơi có mật
độ nấm cao nhất Nghiên cứu của Chin
và CS (2014) cho thấy mật độ nấm ở
phổi, gan giảm rất nhanh (2 logs và 1 log
sau 24 - 168 giờ gây nhiễm), mật độ nấm
ở thận tăng 2 logs từ 24 - 72 giờ và giảm
nhẹ sau 168 giờ [3] Theo Leunk và CS
(1979), sau khi gây nhiễm nấm C albicans
vào tĩnh mạch đuôi của chuột, sau 30 phút
thấy nấm tập trung chủ yếu ở phổi (23%),
gan (7,5%), nhưng khi chuột chết, lượng
nấm phân lập được tại thận chiếm tới
98,2% [7] Nghiên cứu của Odds và CS
(2000) thấy thận là cơ quan có mật độ
nấm C albicans cao nhất, khoảng 105cfu/g
trong 4 ngày đầu, 106 - 107 (cfu/g) ngày 14
Tại phổi, gan, lách: 103 ± 105cfu/g ngày 1;
giảm xuống dưới < 100 cfu/g ngày thứ 7
sau gây nhiễm; mật độ C albicans ở não
chuột thấp [9] Chính vì lý do mật độ nấm
ở thận cao nhất nên đa số các nghiên
cứu đều đánh giá hiệu quả thuốc điều trị đến mật độ nấm ở thận
x 100 lần
x 400 lần
(PAS, x 630 lần)
Các tế bào nấm men nảy chồi, màu tím đỏ
Trang 5Làm tiêu bản mô bệnh học để đánh giá
tổn thương các tạng cho thấy tại thận,
gan xuất hiện ổ viêm với những tế bào
nấm men, chứng tỏ nấm lan tràn đến
thận, gan Theo Ashman (1996), tại thận
thấy viêm thận cấp (acute pyelonephritis), các tế bào nấm men, sợi nhìn rõ ở thận chuột có biểu hiện viêm nặng, ở chuột viêm nhẹ không thấy thâm nhiễm tế bào bạch cầu đa nhân [2]
2 Đánh giá hiệu quả của amphotericin B trong điều trị bệnh nấm hệ thống do
C albicans
Thuốc
(p < 0,001)
Biểu đồ 1: Tỷ lệ sống theo thời gian của chuột gây
nhiễm C albicans liều LD90 và điều trị
Kết quả nghiên cứu cho thấy amphotericin B có hiệu quả điều trị, thể hiện bằng kéo
dài thời gian sống ở chuột gây nhiễm C albicans liều LD90 (p < 0,001)
Trong đánh giá hiệu quả của thuốc, 2 chỉ tiêu chính hay sử dụng là tác dụng kéo dài
thời gian sống của động vật khi gây nhiễm liều LD90 và giảm mật độ nấm ở tạng khi
gây nhiễm liều LD10 [4, 6] Nghiên cứu của chúng tôi tiến hành theo khuyến cáo của một
Trang 6số nhà nghiên cứu để đánh giá thời gian sống chuột được gây nhiễm liều LD90%, điều trị thuốc sau 24 giờ và kéo dài 7 ngày, theo dõi chuột chết trong vòng 2 tuần [6] Khi sử dụng đường cong Kaplan-Meier cho thấy sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p < 0,001)
CFU/g, n = 5)
< 0,01
< 0,01
(Non parametric test, Mann-Whitney U test)
Mật độ nấm ở thận chuột sau gây nhiễm C albicans liều LD10 ở D3 và D8 tiêm amphotericin B giảm rõ ràng so với nhóm chứng
Trong nghiên cứu này chúng tôi đánh
giá mật độ nấm ở hai thời điểm giữa đợt
điều trị (D3) và sau khi kết thúc điều trị 24
giờ theo hướng dẫn của Viện Nghiên cứu
Bệnh Dị ứng và Truyền nhiễm Quốc gia
Mỹ (NIAID) [8] và được áp dụng trong
một số nghiên cứu [4, 6]
Kết quả nghiên cứu cho thấy ở cả hai
thời điểm, amphotericin B đều làm giảm
rõ rệt mật độ nấm tại thận, ở D8 một số
chuột không thấy nấm Nghiên cứu cũng
cho thấy mật độ nấm giảm rõ ràng, có
những chuột không thấy nấm mọc nữa,
nhưng không phải tất cả chuột đều sạch
nấm Theo một số tác giả, mặc dù thuốc
chống nấm có tác dụng rất nhanh trên in
vitro nhưng không một loại thuốc nào (kể
cả polyene như amphotericin B) làm sạch
nấm hoàn toàn in vivo; có thể do môi
trường in vivo có tác dụng bảo vệ nấm
khỏi thuốc hay thuốc khó tiếp cận nấm gây bệnh [1]
KẾT LUẬN
- Chúng tôi đã xây dựng được mô hình chuột thực nghiệm mắc bệnh hệ thống
do C albicans qua gây nhiễm tĩnh mạch
đuôi chuột không suy giảm miễn dịch
- Liều tối thiểu C albicans gây chết là
104 TB/chuột Liều LD10 là 4 x 104; LD90 là 7,5 x 105 TB/chuột Tại ngày thứ 3 (D3)
và D8 sau gây nhiễm, mật độ nấm tại thận là 4,52 và 4,06 log10 CFU/gam, cao hơn so với mật độ nấm tại gan (3,77 và 2,74 log10 CFU/gam) và lách (2,93 và 2,58 log10 CFU/gam)
- Áp dụng mô hình trong đánh giá thấy amphotericin B có tác dụng kéo dài thời gian sống của chuột nhiễm liều LD90 và giảm mật độ nấm ở thận nhiễm liều LD10
Trang 7TÀI LIỆU THAM KHẢO
1 Anaissie EJ, McGinnis MR, Pfaller MA,
Anstead GM, Arora A Clinical Mycology
(second edi.) Elsevier Inc 2009
2 Ashman RB, Fulurija A, Papadimitriou JM
Strain-dependent differences in host response
to Candida albicans infection in mice are related
to organ susceptibility infectious load Infection
and Immunity 1996, 64 (5), pp.1866-1869
3 Chin VK, Foong KJ, Maha A, Rusliza B,
Norhafizah M, Chong PP Multi-step pathogenesis
and induction of local immune response by
systemic Candida albicans infection in an
intravenous challenge mouse model International
Journal of Molecular Sciences 2014, 15 (8),
pp.14848-14867 doi:10.3390/ijms150814848
4 Graybill J The role of murine models in
the development of antifungal therapy for systemic
mycoses Drug Resistance Updates 2000, 3,
pp.364-383 doi:10.1054/drup.2000.0171
5 Graybill JR, Bocanegra R, Fothergill A,
Rinaldi MG Bleomycin therapy of experimental
disseminated candidiasis in mice Antimicrobial
Agents and Chemotherapy 1996, 40 (3), pp.816-818
6 Kavanagh K Medical Mycology: Cellular
and Molecular Techniques West Sussex, England: John Wiley & Sons 2007
7 Leunk RD, Moon RJ Physiological and
metabolic alterations accompanying systemic candidiasis in mice Infect Immun 1979, 26 (3), pp.1035-1041
8 NIH/NIAID (n.d.) Standard Operating
Procedure (SOP) Candida albicans Murine
Invasive Candidiasis Model NIH/NIAID Task Order A13
9 Odds FC, Nuffel L Van, Gow NA R
Survival in experimental Candida albicans
infections depends on inoculum growth conditions
as well as animal host Microbiology 2000,
146 (8), pp.1881-1889
10 Wiederhold NP, Najvar LK, Bocanegra Ra, Kirkpatrick WR, Patterson TF Caspofungin
dose escalation for invasive candidiasis due
to resistant Candida albicans Antimicrobial
Agents and Chemotherapy 2011, 55 (7), pp.3254-3260 doi:10.1128/AAC.01750-10