Xác định biofilm trong viêm amiđan mạn tính ở trẻ em

Nội dung bài viết với mục tiêu xác định tỷ lệ màng sinh học biofilm trong amiđan mạn tính bằng phương pháp nhuộm HE và soi qua kính hiển vi quét SEM, tìm mối tương quan giữa việc dùng kháng sinh, thời gian viêm amiđan với việc phát hiện ra biofilm.

XÁC ĐỊNH BIOFILM TRONG VIÊM AMIĐAN MẠN TÍNH Ở TRẺ EM

Nhan Trừng Sơn* Phú Quốc Việt**

TÓM TẮT

Mục tiêu: Xác định tỷ lệ màng sinh học biofilm trong amiđan mạn tính bằng phương pháp nhuộm HE và soi qua kính hiển vi quét SEM, tìm mối tương quan giữa việc dùng kháng sinh, thời gian viêm amiđan với việc phát hiện ra biofilm

Phương pháp thực hiện: Cắt ngang mô tả trên 70 bệnh nhi có chỉ định cắt amiđan tại BV Nhi Đồng 1 Kết quả: Bằng phương pháp nhuộm HE: số bệnh nhân phát hiện ra màng sinh học biofilm là 38 (54,3%), không phát hiện ra biofilm là 32 (45,7%) Bằng phương pháp SEM: số bệnh nhân phát hiện ra biofilm là 30 (42,86%), không phát hiện ra biofilm là 40 (57,14%), không thấy sự liên quan giữa tổng thời gian bệnh của bệnh nhân với việc tạo màng biofilm, cũng như sự liên quan giữa việc dùng kháng sinh quá ngắn ngày, hay dài ngày với việc tạo ra biofilm của vi khuẩn

Kết luận: Phương pháp nhuộm HE và phương pháp soi bằng SEM là 2 phương pháp rất triển vọng để xác định biofilm Phương pháp nhuộm HE là phương pháp dễ thực hiện tại cơ sở, giá thành thấp, nhưng hiệu quả trong việc xác định biofilm Phương pháp soi bằng kính hiển vi điện tử quét đòi hỏi mẫu phải được xử lý kỹ trước khi đi soi, mẫu cần vận chuyển đến trung tâm có máy SEM để soi, giá thành khá cao, nhưng đây cũng là phương tiện rất tốt để xác định biofilm

Từ khóa: Màng sinh học, viêm amiđan

ABSTRACT

THE PRESENCE OF BACTERIAL BIOFILM IN CHRONIC TONSILLITIS IN CHILDREN

Nhan Trung Son, Phu Quoc Viet * Y Hoc TP Ho Chi Minh * Vol 17 - Supplement of No 1 - 2013: 29 - 33

Background: The presence of bacterial biofilms in inflamed tonsils may explain the chronicity and recurrent characteristic of tonsillitis

Objective: To assess biofilm rate in chronic tonsilitis by Hematoxyllin- Eosin (HE) staining and by Scanning Electron Microscopy (SEM), and to clarify if there are relations among using antibiotics, tonsillitis time and biofilm detection

Methods: Cross-sectional study on 70 paediatric patients undergone tonsillectomy at Children 1 Hospital Results: Biofilms were identified in 38 patients (54.3%) by using HE method and in 30 (42.86 %) patients

by using SEM method There was neither relation between tosillitis time and biofilm forming nor relation between using antibiotics (short-term (from 1to 5 days) or long-term (from 6-10 days) ) and biofilm forming

Conclusion: HE and SEM are two potential methods for detecting biofilms HE is a low-cost method, effective to detect biofilm and easy to apply at hospital SEM is a high-cost method It requires careful prepararion samples before scanning and transportation to SEM center

Từ khóa: Biofilm, tonsillitis

* Bộ môn Tai Mũi Họng, Trường Đại Học Y Khoa Phạm Ngọc Thạch

** Khoa Tai Mũi Họng, Bệnh viện Nhi Đồng 1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Amiđan là một tổ chức bạch huyết của vòng

bạch huyết Waldeyer ở ngã tư đường ăn đường

thở Sự tiếp xúc thường xuyên với môi trường

bên ngoài của họng là điều kiện làm cho vi

khuẩn dễ tấn công vùng này Chính vòng bạch

huyết Waldeyer là một pháo đài chống lại sự tấn

công này thông qua chức năng miễn dịch của nó

Viêm amiđan là một thuật ngữ được chỉ đến

viêm amiđan khẩu cái Đây là bệnh lý thường

gặp trong lâm sàng các chuyên khoa Nội Nhi nói

chung và chuyên khoa Tai Mũi Họng Nhi nói

riêng ở Việt Nam và trên toàn thế giới Tại Việt

Nam, theo niên giám thống kê của Bộ Y tế năm

2002, trong các bệnh mắc cao nhất trên toàn

quốc, viêm họng và viêm amiđan cấp đứng hàng

thứ 2 (251,39 trường hợp mắc trên 100.000 dân)

Theo thống kê của bệnh viện Tai Mũi Họng TP

HCM năm 2007, viêm amiđan chiếm 21% trong

các bệnh Tai Mũi Họng

Từ lâu, các vi khuẩn gây bệnh trong viêm

amiđan mạn tính đã được xác định bởi các tác

giả trong và ngoài nuớc Việc sử dụng kháng

sinh hợp lý trong các trường hợp viêm amiđan

mạn tính song viêm amiđan vẫn tái đi tái lại, vì

vậy chúng tôi cho rằng có khả năng vi khuẩn đã

hình thành biofilm để chống lại tác dụng của

kháng sinh và sự đề kháng của ký chủ

Vì vậy, chúng tôi mạnh dạn tiến hành thực

hiện nghiên cứu đề tài: “Xác định biofilm trong

viêm amiđan mạn tính ở trẻ em bằng phương

pháp nhuộm Hematoxylin - Eosin (HE) và soi

qua kính hiển vi điện tử quét Scanning Electron

Microscope (SEM)”

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

Biofilm là một tập hợp các tế bào vi sinh vật

kết hợp với nhau và bám trên bề mặt Những tổ

chức có biofilm thường khác so với những tổ

chức tương tự trong việc giải mã gen, đề kháng

kháng sinh và đề kháng hệ thống miễn dịch của

con người(1,3)

Chúng tôi cho rằng việc sử dụng kháng sinh lâu dài nhưng không đạt hiểu quả có khả năng

do vi khuẩn kháng kháng sinh qua cơ chế tạo màng biofilm, nên chúng tôi đi sau vào việc xác định màng biofilm ở bề mặt mô amiđan Trước đây, đã có nhiều nghiên cứu về màng biofilm trên mô amiđan:

Khalid (2008) nghiên cứu trên 76 trường hợp trẻ em có độ tuổi trung bình là 5,7 tuổi bị viêm amiđan và VA thì 46 trường hợp tìm thấy biofilm của vi khuẩn bằng phương pháp soi qua kính điện tử quét (SEM) (chiếm 61%) Trong 26 bệnh nhi phải cắt amiđan và nạo VA vì tình trạng nhiễm trùng mạn tính thì có 22 trường hợp tìm thấy biofilm (85%)

Richard (2008) nghiên cứu trên 19 bệnh nhân

bị viêm amiđan mạn tính thì có 15 bệnh nhân có biofilm (79%)

Rafael Ramirez(6) nghiên cứu trên 9 bệnh nhân với tiền sử bệnh viêm amiđan tái đi tái lại cần phải cắt amiđan, mẫu mô được quan sát bằng kính hiển vi điện tử quét thông thường và kính hiện vi điện tử quét phù hợp môi trường Kết quả 8/9 bệnh nhân được phát hiện có biofilm trên bề mặt amiđan

R R Diaz (2010)(4) 36 bệnh nhân được chọn

để cắt amiđan, tuổi từ 1 đến 6 tuổi, không bệnh nhân nào sử dụng kháng sinh quá 30 ngày trước khi cắt amiđan Mẫu amiđan được nhuộm Hematoxylin – eosin, nhuộm gram, soi kính hiển

vi huỳnh quang, và soi kín h hiển vi laser cùng tiêu điểm,có 77.28% bệnh nhân có biofilm trong amiđan(4)

Galli J(5) (2007) 10 trường hợp cắt amiđan, đây là những bệnh nhân viêm amiđan và VA mạn tính, hay viêm tái hồi nhiều lần, không còn đáp ứng với kháng sinh và kháng viêm liệu pháp Nghiên cứu này nhằm phát hiện biofilm ở mẫu mô, mẫu mô được cấy và được soi bằng kinh hiển vi điện tử quét, kết quả cho thấy có 15/15 mẫu VA và 6/10 mẫu amiđan có thấy vi khuẩn dạng hình cầu bám trên bề mặt mô và tập trung thành từng khúm nhỏ(5)

Romain E Kania (2007) khi ông so sánh hình

ảnh thấy vi khuẩn và chất glycocalyx bằng kính

hiển vi quét laser đồng tiêu điểm (CLSM) kết

hợp với phương pháp nhuộm đôi để so sánh với

kết quả bằng kính hiển vi điện tử quét (SEM)

trên những mẫu mô amiđan Kết quả có 17/24

(70,8%) trường hợp thí nghiệm cho thấy sự hiện

diện màng sinh học vi khuẩn

Richard A Chole(2) (2003) Nghiên cứu tháng

6/2003 trên 15 bệnh nhân bị viêm amiđan tái đi

tái lại, kết quả có 11/15 trường hợp tìm thấy

biofilm (73%) và 3/4 trường hợp amiđan quá

phát có biofilm (75%) Bằng kính hiển vi điện tử

Hình 1: (A) Biofilm ở amiđan (hình hoa thị)

nhuộm với hematoxylin- eosin và mô viêm thâm

nhiễm xung quanh (hình mũi tên), hình ảnh vật

kính x400 (B) Nhìn toàn cảnh của khe hốc amiđan

với biofilm (mũi tên) với nhiều nang giãn nở không

có xơ hóa (hình hoa thị), xem ở vật kính x32 (C)

Đáy của hốc amiđan với rất nhiều khúm vi khuẩn

(hình mũi tên) và quá trình viêm mạnh mẽ, hình

ảnh vật kính x100 (D) Đáy của hốc amiđan với

chất á sừng (hình hoa thị) và nhiều biofilm (hình

mũi tên) hình ảnh vật kính x150

Hình 2: Biofilm của mẫu amiđan quan sát bằng

kính hiển vi điện tử quét

ĐỐI TƯỢNG – PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tượng nghiên cứu

Tiêu chuẩn chọn mẫu

Tất cả các bệnh nhi từ 5 đến 15 tuổi khám tại phòng khám Tai Mũi Họng Bệnh Viện Nhi đồng

I có triệu chứng viêm amiđan tái đi tái lại hơn 5 lần/ năm, từ 10-2011 đến 31-07-2012

Tiêu chuẩn loại trừ

Bệnh nhân có chống chỉ định cắt amiđan Các mẫu được xác nhận bằng giải phẫu bệnh

lý không phải là viêm amiđan mạn sẽ bị loại trừ Viêm amiđan tái đi tái lại ít hơn 5 lần/ năm

Phương pháp nghiên cứu

Thiết kế nghiên cứu

Nghiên cứu cắt ngang mô tả

Mẫu nghiên cứu

Cỡ mẫu được xác định phù hợp theo nghiên cứu mẫu nhỏ N = 70

N= C2 x (C =1,96 ; p = 90% ; ε = 7%)

Cách tiến hành nghiên cứu

Thực hiện phẫu thuật cắt amiđan

Lấy mô amiđan lưu giữ trong 2 lọ formol 10%

Một lọ gửi làm giải phẫu bệnh và tìm biofilm bằng nhuộm HE

Một lọ sau khi được xử lý khô gửi Viện công nghệ Nano, mẫu sẽ được bọc platinium sau đó được đem đi chụp biofilm bằng máy SEM Phân tích thống kê bằng phần mềm Stata/SE

10

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Đặc điểm của mẫu nghiên cứu

Tổng số bệnh nhân 70 bệnh nhân (21 nữ (30%), 49 nam(70%))

Tuổi trung bình 92,15 tháng ± 33 (tuổi nhỏ nhất 55 tháng, tuổi lớn nhất 184 tháng)

Về nơi ở: 43 bệnh nhân ở tỉnh, 27 bệnh nhân

ở thành phố Hồ Chí Minh

Tổng thời gian bị viêm amiđan: 53,57

tháng ± 32,9 tháng (thời gian bị viêm amiđan

ngắn nhất là 15 tháng, thời gian bị amiđan dài

nhất là 144 tháng)

Thời gian sử dụng kháng sinh ngắn nhất

trong 1 đợt điều trị: trung bình là 2 ngày ± 1 ngày

(ngắn nhất là 1 ngày, dài nhất là 5 ngày)

Thời gian sử dụng kháng sinh dài nhất trong

1 đợt trong 1 đợt điều trị: trung bình là 6 ngày ± 1

ngày (ngắn nhất là 4 ngày, dài nhất là 10 ngày)

Số lần viêm amiđan trung bình là: 6 lần ± 1

lần (ít nhất là 5 lần, nhiều nhất là 9 lần)

Bảng 1: Độ lớn amiđan

Độ amiđan Nam Nữ Tổng số

Xơ teo 0 0 0

Độ 1 5 (10,2%) 2 (9,52%) 7 (10%)

Độ 2 16 (32,65%) 11 (52,38%) 27 (38,57%)

Độ 3 28 (57,14% 8 (38,1%) 36 (51,43%)

Độ 4 0 0 0

Tổng số 49 (100%) 21 (100%) 70 (100%)

Bằng phương pháp nhuộm HE:

Số bệnh nhân phát hiện ra màng sinh học

biofilm là 38

Số bệnh nhân không phát hiện ra màng sinh

học biofilm là 32

Bằng phương pháp SEM:

Số bệnh nhân phát hiện ra màng sinh học

biofilm là 30

Số bệnh nhân không phát hiện ra màng sinh

học biofilm là 40

Bảng 2: Tỷ lệ phát hiện Biofilm

Phương pháp HE (+) HE (-)

SEM (+) 25 (65,79%) 5 (15,63%) 30

SEM (-) 13 (34,21%) 27 (84,37%) 40

38 32 70

Nếu ta coi SEM là chuẩn vàng và đánh giá

độ nhạy, độ đặc hiệu của HE

Tính độ nhạy của HE là 83,3% (KTC 95% và

độ đặc hiệu của HE là 67,5% (KTC 95% 81,4%)

Tỷ lệ đồng thuận giữa 2 phương pháp

Bảng 3: Mức độ đồng thuận là để đánh giá xem HE cho kết quả giống SEM bao nhiêu phần trăm

Tỷ lệ đồng thuận Hệ số Kappa P 74,29% 0,49 0,000

KẾT LUẬN

Qua nghiên cứu về biofilm của vi khuẩn ở những bệnh nhi tại bệnh viện Nhi Đồng 1 TPHCM bằng hai phương pháp nhuộm Hematoxylin – Eosin và soi bằng kính hiển vi điện tử quét, chúng tôi thu nhận được một số kết quả Từ đó, chúng tôi có một số kết luận và đề xuất sau:

Phương pháp nhuộm Hematoxylin – Eosin

và phương pháp soi bằng kính vi điện tử quét là

2 phương pháp rất triển vọng để xác định màng biofilm của vi khuẩn

Phương pháp nhuộm Hematoxylin – Eosin

là phương pháp dễ thực hiện tại cơ sở, giá thành thấp, nhưng hiệu quả trong việc xác định màng biofilm vi khuẩn

Phương pháp soi bằng kính hiển vi điện tử quét đòi hỏi mẫu phải được xử lý kỹ trước khi đi soi, mẫu cần vận chuyển đến trung tâm có máy SEM để soi, giá thành khá cao, nhưng đây cũng

là phương tiện rất tốt để xác định màng biofilm của vi khuẩn, phương tiện này đã được sử dụng rất lâu trên thế giới và nay đã được chúng tôi sử dụng lần đầu tiên tại TPHCM để xác định màng biofilm của vi khuẩn

Hiện nay trên thế giới ít công trình nghiên về thời gian bệnh liên quan tới việc tạo ra biofilm, cũng như sự liên quan của việc dùng kháng sinh ngắn ngày, hay dài ngày trong việc tạo ra biofilm của vi khuẩn

Trong nghiên cứu của chúng tôi, chúng tôi không thấy sự liên quan giữa tổng thời gian bệnh của bệnh nhân với việc tạo màng biofilm Chúng tôi cũng không ghi nhận được sự liên quan giữa việc dùng kháng sinh quá ngắn ngày, hay quá dài ngày trong 1 đợt điều trị viêm amiđan với việc tạo ra biofilm của vi khuẩn

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1 Al-Mazrou KA, Al-Khattaf AS “Adherent biofilms in

adenotonsillar diseases in children” Arch Otolaryngol Head Neck

Surg, 2008; 134(1):20-23

2 Chole RA, Faddis BT “Anatomical evidence of microbial

biofilms in tonsillar tissues: a possible mechanism to explain

chronicity” Arch Otolaryngol Head Neck Surg

2003;129(6):634-636

3 Costerton JW, Stewart PS, Greenberg EP “Bacterial biofilms: a

common cause of persistent infections” Science

1999;284(5418):1318-1322

4 Diaz RR , Picciafuoco S et al “Relevance of biofilms in pediatric tonsillar disease” Eur J Clin Microbiol Infect Dis 2011; 30:1503–

1509

5 Galli J, Calo L, Ardito F et al “Biofilm formation by

Haemophilus influenzae isolated from adeno-tonsil tissue

samples, and its role in recurrent adenotonsillitis” Acta

Otorhinolaryngol Ital 2007;27(3):134-8

6 Ramírez-Camacho R, González-Tallón AI et al

“Environmental scanning electron microscopy for biofilm

detection in tonsils” Acta Otorrinolaringol Esp 2008;59(1):16-20