Bài viết này nghiên cứu với mục đích nhằm đánh giá hiệu quả kháng ung thư của virut vắc xin sởi và quai bị dùng phối hợp trên chuột thiếu hụt miễn dịch mang khối ung thư đại trực tràng (UTĐTT) người.
Trang 1TÁC DỤNG KHÁNG UNG THƯ CỦA VIRUT VẮC XIN SỞI VÀ
QUAI BỊ DÙNG PHỐI HỢP TRÊN CHUỘT THIẾU HỤT MIỄN DỊCH MANG KHỐI UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG NGƯỜI
Lê Duy Cương*; Hồ Anh Sơn*; Ngô Thu Hằng*; Nguyễn Lĩnh Toàn*
TÓM TẮT
Mục tiêu: đánh giá hiệu quả kháng ung thư của virut vắc xin sởi và quai bị dùng phối hợp
trên chuột thiếu hụt miễn dịch mang khối ung thư đại trực tràng (UTĐTT) người Đối tượng và
phương pháp: virut vắc xin sởi và quai bị (MeV và MuV) được tách dòng từ vắc xin Priorix
(Hãng GlaxoSmithKline, Anh) Chuột nude (Hãng Charles River, Mỹ) 6 - 8 tuần tuổi, chia thành
4 nhóm (10 con/nhóm) được ghép u tế bào HT29 (10 6-7 tế bào/con) dưới da đùi, khi khối u có
kích thước khoảng 20 - 40 mm 3 (sau 7 - 10 ngày ghép), tiến hành tiêm virut vào khối u với liều
107 CFU/con, 2 lần/tuần, trong 3 tuần, nhóm chứng tiêm PBS Kết quả và kết luận: khối u ở
nhóm tiêm virut phát triển chậm và thời gian sống dài hơn có ý nghĩa thống kê (p < 0,05) so với
nhóm chứng; nhóm tiêm phối hợp virut có kích thước u phát triển chậm và thời gian sống dài
hơn có ý nghĩa thống kê (p < 0,05) so với nhóm tiêm đơn virut Như vậy, phối hợp vắc xin MeV
và MuV kháng u tế bào HT29 trên chuột nude tốt hơn so với từng loại virut
* Từ khóa: Ung thư đại trực tràng; Vắc xin virut sởi và quai bị; Tác dụng kháng ung thư
Assessing Anti-Cancer Efficacy of Measles and Mumps Virus Vaccine
Combination on Nude Mice Bearing Human Colorectal Cancer Tumors
Summary
Objectives: Evaluation of the anti-cancer effects of measles and mumps virus vaccine
combination on nude mice bearing human colorectal cancer tumor Materials and methods:
Measles and mumps virus vaccine (MeV and MuV) were separated from Priorix vaccine
(GlaxoSmithKline, UK) Nude mice (Charles River, USA), 6 - 8 weeks old, were divided into
injected by PBS Results and conclusions: The tumor size grew slowly and survival time of the
virus-treated groups was significantly long (p < 0.05) versus that of the control group The tumor
size grew slowly and survival time of the virus-treated combination group was significantly long
(p < 0.05) versus that of viral-treated single groups Thus, MeV and MuV combination virotherapy
treated colorectal tumor on nude mice was better than virus-treated single therapy
*Keywords: Colorectal cancer; Measles and mumps virus vaccine; Anti-cancer effect
* Học viện Quân y
Người phản hồi (Corresponding): Nguyễn Lĩnh Toàn (toannl@vmmu.edu.vn)
Ngày nhận bài: 03/01/2018; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 08/02/2018
Trang 2ĐẶT VẤN ĐỀ
Ung thư đại trực tràng là một gánh
nặng rất lớn cho sức khỏe cộng đồng
Trên thế giới, đây là loại ung thư phổ biến
thứ ba ở nam giới và thứ hai ở nữ Ở các
nước phương Tây, hàng năm khoảng
917.000 trường hợp mắc UTĐTT, là nguyên
nhân đứng hàng thứ hai gây tử vong do
ung thư [1] Hiện nay, có nhiều phương
pháp điều trị UTĐTT, bao gồm cả các
phương pháp điều trị đích và sản phẩm
thuốc có hoạt tính sinh học như kháng
thể đặc hiệu kháng nguyên… Virotherapy
trị ung thư mới, là phương pháp biến sự
nhân lên của virut thành vũ khí tiêu diệt tế
bào ung thư mà không ảnh hưởng đến
các tế bào lành Có ít nhất 11 loại virut,
bao gồm: adenovirus, vaccinia virut,
coxsackievirut, reovirus, virut sởi (MeV),
virut quai bị (MuV)… đang được nghiên cứu
và thử nghiệm lâm sàng điều trị nhiều loại
ung thư khác nhau Hiện nay, virut Herpes
(T-VEC/Talimogene Laherparepvec) đã
được phê chuẩn điều trị bệnh nhân (BN)
bị ung thư hắc sắc tố tái phát sau điều trị
phẫu thuật ở Mỹ và các nước liên minh
châu Âu [2]
Virut vắc xin sởi và quai bị (MeV và
MuV) thuộc gia đình Paramyxoviridae có
tiềm năng ly giải tế bào u cao Chúng có
nhiều đặc điểm tự nhiên rất thích hợp để
phát triển thành tác nhân điều trị ung thư
như: tính ổn định gen cao, độ an toàn cao
đối với con người [2], kết hợp với tiềm
năng biến đổi gen tạo ra MeV và MuV tái
tổ hợp có các thuộc tính trị liệu ung thư
rất tốt Lợi thế ly giải tế bào u rất lớn
của MeV và MuV là khả năng hình thành
hợp bào, đó là sự hợp nhất tế bào bị nhiễm virut với tế bào lân cận không nhiễm virut, đây là cơ chế tạo cho chúng lây lan mà không cần giải phóng các hạt virut trưởng thành ra ngoài tế bào Sự hợp nhất các tế bào hình thành hợp bào (50 - 100 tế bào) tương quan với tiềm năng ly giải tế bào u của chúng Sự hình thành hợp bào góp phần vào hiệu quả virut gây ly giải tế bào u, làm cho virut nhân lên và hạn chế tiếp xúc với kháng thể trung hòa trong máu vật chủ Hợp bào tiết ra một lượng lớn “syncytiosome”,
đó là các túi giống như exosome biểu hiện kháng nguyên khối u (TAA) cao qua các phân tử MHC Ngoài ra, các tế bào
DC trình diện chéo TAA được tăng cường mạnh bởi glycoprotein hợp màng của MeV
và MuV Một lợi thế nữa của MuV và MeV
là protein HN và N hoạt động như một sialidase, có khả năng loại bỏ dư lượng axít sialic từ bề mặt tế bào khối u làm giảm tăng trưởng tế bào ác tính, kích hoạt các tế bào NK và bài tiết của IFN-γ [4] Tuy nhiên, đến nay chưa có nghiên cứu
in vivo đánh giá hiệu quả phối hợp vắc xin MeV và MuV điều trị UTĐTT người Do đó, chúng tôi tiến hành đề tài này nhằm:
Đánh giá hiệu quả phối hợp virut vắc xin sởi và quai bị kháng khối u tế bào dòng UTĐTT người (HT29) trên chuột nude
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU
1 Đối tượng nghiên cứu
- Tế bào Vero và HT29: được nuôi cấy trong phòng thí nghiệm với môi trường nuôi cấy DMEM hay RPMI (thêm 10% foetal bovine serum, 1% glutamine và 1% kháng sinh), duy trì tế bào ở tủ ấm 370C, 5% CO2
Trang 3- Vắc xin MeV và MuV sống, giảm độc
lực: phân lập, tăng sinh MeV và MuV
nguồn gốc từ vắc xin priorix (Hãng
GlaxoSmithKline, Anh), thực hiện tại
Trường Đại học Quốc gia Singapore
- Chuột thiếu hụt miễn dịch (nude mice):
chuột nude 6 - 8 tuần tuổi (Hãng Charles
River, Mỹ) được nuôi trong phòng sạch
2 Phương pháp nghiên cứu
* Chuẩn độ virut (TCID50):
- Nhiễm virut tế bào Vero trên đĩa
96 giếng: gieo tế bào Vero vào các giếng
trên đĩa 96 giếng với nồng độ tế bào
104 tế bào/200 l/giếng, duy trì tế bào trên đĩa 96 giếng ở tủ ấm 370C, 5% CO2
Sau 24 giờ, kiểm tra dưới kính hiển vi thấy tế bào Vero bám đáy tốt Tiến hành nhiễm virut vào các giếng theo hàng A, B,
C, D, E, F, I, tương ứng với nồng độ 10-2 đến 10-8 của stock virut, cột 11 và 12 là nhóm chứng (không nhiễm) Kiểm tra tế bào Vero nhiễm virut ở các giếng trên đĩa
96 giếng hàng ngày dưới kính hiển vi Đến ngày thứ 6 nhiễm virut, các giếng có hình ảnh nhiễm virut rõ, tiến hành nhuộm xanh methylen và tính TCID50 theo công thức:
I: Tính khoảng tỷ lệ (PD):
(% CPE ở nồng độ pha loãng có % CPE > 50%) - (50%) (% CPE ở nồng độ pha loãng có % CPE > 50%) - (% CPE ở nồng độ pha loãng có % CPE < 50%)
II: Tính (-Log) nồng độ pha loãng có % CPE > 50% (10-3 sẽ là 3)
TCID50/ml = 10I+II/ml (CPE: giếng có tế bào nhiễm virut)
Đổi chuẩn độ TCID50 sang CFU: CFU/ml = 0,7 x TCID50/ml
* Tạo khối u trên chuột nude và điều trị:
Tiêm tế bào HT29 (107 tế bào/chuột) vào dưới da đùi chuột nude Sau 7 - 10 ngày tiêm tế bào u, kích thước khối u đạt khoảng 20 - 30 mm3, chuột có khối u được chia ngẫu nhiên thành 4 nhóm (10 con/1 nhóm), 3 nhóm được điều trị bằng tiêm virut nội u lần lượt là MeV + MuV, MuV và MeV, nhóm chứng tiêm bằng dung dịch PBS Liều điều trị là 107 CFU/con, 2 lần/tuần, trong 3 tuần Dùng thước kẹp đo khối u (2 lần/tuần) Thực hiện các bước thí nghiệm trên chuột tuân theo hướng dẫn sử dụng và chăm sóc động vật thí nghiệm
Công thức tính thể tích khối u:
Chiều rộng2 (mm) x chiều dài (mm)
Thể tích khối u (mm3) =
2
Tiêm tế bào HT29 vào
đùi chuột gây u
Đo kích thước khối u ở đùi chuột
Trang 4* Phương pháp phân tích kết quả:
Dùng các thuật toán thống kê, sử dụng phần mềm STATVIEW và SPSS
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
1 Kích thước u
n g à y 1 n g à y 4 n g à y 8 n g à y 1 1 n g à y 1 5 n g à y 1 8 n g à y 2 2 n g à y 2 5 n g à y 2 9
0
2 0 0 0
4 0 0 0
6 0 0 0
8 0 0 0
M e V
M u V
C o n t r o l
Thời gian sau điều trị
Kích thước u Thể tích khối u
P<0.05
Kết quả cho thấy tiêm virut đã ngăn chặn khối u phát triển, quan sát thấy rõ từ ngày thứ ba đến ngày thứ 29 sau điều trị Thể tích khối u (mm3) ở các nhóm điều trị virut tăng chậm có ý nghĩa thống kê (p < 0,05) so với nhóm chứng (ở ngày thứ 29: 1.988,7 ± 885,8; 4.790,4 ± 1.924,8; 4.655,4 ± 1.042,1 so với 9.326,7 ± 2.713,4) Thể tích khối u ở nhóm điều trị phối hợp virut tăng chậm hơn nhóm điều trị đơn virut có ý nghĩa thống kê (p < 0,05)
Thể tích khối u của hai nhóm điều trị bằng MeV và MuV khác biệt không có ý nghĩa thống kê (p > 0,05)
2 Thời gian sống của chuột nude
M e
M u M u M e
c
tr o l 0
2 0
4 0
6 0
p<0.05
Thời gian sống trung bình
MuV+MeV MuV MeV Control
Thời gian sống trung bình (ngày)
Nhóm
Trang 5Sau thời gian điều trị, thời gian sống
trung bình của chuột nude ở các nhóm
tiêm virut (MeV và MuV) dài hơn có ý nghĩa
thống kê so với nhóm chứng (p < 0,05)
theo dõi) ở các nhóm tiêm virut (100%;
60%; 60%) nhiều hơn có ý nghĩa thống kê
(p < 0,05) so với nhóm chứng (0%) (hình 3b)
Đặc biệt, ở nhóm tiêm phối hợp virut
có thời gian sống trung bình dài hơn và tỷ
lệ chuột còn sống nhiều hơn (sau 43 ngày
theo dõi) có nghĩa thống kê (p < 0,05) so với
nhóm tiêm đơn virut
Thời gian sống và tỷ lệ chuột chết ở
2 nhóm tiêm MeV, MuV khác biệt không
có ý nghĩa thống kê (p > 0,05)
BÀN LUẬN
Với những tiến bộ của công nghệ sinh
học và hiểu biết về virut ly giải tế bào ung
thư đã thúc đẩy các nhà nghiên cứu
khám phá nhiều loài virut kháng ung thư
có hiệu quả Trong nghiên cứu này, để
đánh giá hiệu quả phối hợp vắc xin virut
MeV và MuV ly giải tế bào UTĐTT người
HT29 in vivo, chúng tôi đã ghép u tế bào
HT29 khu trú dưới da đùi chuột nude, phù
hợp cho liệu pháp điều trị tiêm virut nội u,
gia tăng khả năng virut tiếp xúc và xâm
nhập vào khối u
Số lượng thụ cảm thể được chứng
minh là yếu tố quan trọng quyết định đến
tính lây nhiễm hay hiệu quả lan truyền của
virut vào các tế bào u đích [5] Sử dụng
nhiều loại tế bào biểu hiện từ thấp đến
cao mức thụ thể CD46, đã xác định khả
năng lây nhiễm virut sởi tăng lên theo
số lượng thụ cảm thể Hợp bào ít ở mức
thụ cảm thể biểu hiện thấp và đòi hỏi mức tới hạn thụ cảm thể CD46 để tạo hợp bào lớn hơn, gây tổn thương phá hủy tế bào đáng kể [5] Chúng ta đã biết thụ cảm thể CD46, Nectin-4 của virut sởi và thụ cảm thể MuV-JL của virut quai bị Ngoài ra, axít sialic có nhiều ở tế bào ác tính làm cho chúng lây nhiễm tế bào ung thư có tính chọn lọc cao hơn Tế bào ung thư biểu hiện mức cao CD46, Nectin-4 hay axít sialic nhằm bảo vệ chúng khỏi hoạt động ly giải tế bào qua con đường bổ thể [5] Mức độ phong phú của thụ cảm thể xác định tính đặc hiệu và hiệu quả lây nhiễm của virut vào tế bào u Tính đặc hiệu khối u đối với virut có thể xảy ra ở mức nội bào sau khi virut xâm nhập vào
tế bào, virut có thể tận dụng được các yếu tố khiếm khuyết gen (interferon, kích hoạt Ras, p53, Rb) chỉ có duy nhất ở tế bào khối u, làm cho chúng có tính chọn lọc tế bào khối u và không xảy ra ở các tế bào bình thường [5] Trong khi đó, nhiều tài liệu cho thấy virut ly giải tế bào khối u tận dụng được những khiếm khuyết gen trong tế bào khối u để khuếch đại bộ gen của chúng và tăng biểu hiện bộ gen đó Tuy nhiên, vẫn chưa rõ phạm vi mà MeV
và MuV tận dụng con đường khiếm khuyết gen để ly giải tế bào u như thế nào, cần có nhiều nghiên cứu sâu hơn về vấn
đề này
Nghiên cứu của chúng tôi cũng cho thấy virut MeV và MuV có tác dụng làm chậm phát triển khối u tế bào HT29 trên đùi chuột nude bắt đầu vào ngày thứ ba
sau khi tiêm virut (hình 2) Khả năng virut
lây lan tạo ra hoạt động kháng u là do virut nhân lên trong tế bào đích và “bắt kịp” với
Trang 6quá trình tăng sinh tế bào u, hầu hết các
khối u được điều trị bằng MeV và MuV
cho thấy giảm và không phát triển kích
thước Kết quả của chúng tôi phù hợp với
những nghiên cứu khác sử dụng vắc xin
virut sởi và quai bị sống giảm độc lực
điều trị ung thư [6, 7] Bên cạch đó, việc
phân chia liều lượng, với liều 107 PFU
virut và liệu trình điều trị như vậy là cần
thiết để tăng khả năng ly giải tế bào khối
u của virut [6, 7] Chúng tôi cũng thấy
tiêm nội u tạo ra lây nhiễm sớm virut vào
các tế bào khối u và lây lan virut có giới
hạn trong khối u đã làm tăng khả năng ly
giải tế bào khối u Tiêm virut nội u nhiều
lần hiệu quả hơn so với tiêm tổng liều duy
nhất [6, 7] Kết quả này rất có giá trị định
hướng phương pháp phối hợp MeV và
MuV tiêm nội u điều trị ung thư cho các
nghiên cứu trong tương lai
Điểm nổi bật của nghiên cứu này là
việc phối hợp hai vắc xin MeV và MuV
điều trị khối u tế bào HT29 trên chuột
nude rất có hiệu quả MeV và MuV sống,
giảm độc lực đã cộng hưởng cơ chế hoạt
động kháng ung thư Nhiều nghiên cứu
trước đây đã chứng minh hoạt tính của virut
quai bị (chủng Urabe) trên hơn 290 BN bị
các khối u ác tính khác nhau BN được
điều trị với nồng độ lên đến 108-9 PFU virut
theo các đường tiêm khác nhau (nội u,
trong phúc mạc hoặc tiêm tĩnh mạch) [8]
Một nghiên cứu khác về MuV với kết quả
lâm sàng rất ít độc tính, khối u đáp ứng
điều trị từng phần hoặc thoái lui toàn bộ
ở 37/90 BN [9] và cổ trướng mất đi ở
26/37 BN Mặc dù dữ liệu lâm sàng rất
đáng khích lệ, nhưng các nhà nghiên cứu
vẫn chưa thực hiện thử nghiệm lâm sàng
MuV ly giải tế bào u rộng rãi Có thể do lo
ngại về độ an toàn khi sử dụng Chủng Urabe của MuV gây ra các biến chứng trên hệ thần kinh trung ương với tần suất lên đến 1% tiêm chủng vắc xin, tiêm trong não khỉ đuôi sóc gây viêm não và viêm màng não [10] Nghiên cứu của chúng tôi
sử dụng 107 PFU virut vắc xin quai bị hoặc sởi để điều trị khối u ở chuột nude, liều này cao gấp 103 lần so với liều thông thường (103-4 PFU) được sử dụng để tiêm chủng Chúng ta đã có rất nhiều kinh nghiệm sử dụng vắc xin đơn hoặc phối hợp trong chương trình chủng ngừa bệnh sởi, Rubella… với hồ sơ an toàn của hai loại vắc xin này trên hàng triệu trẻ em Tuy nhiên, cần có đánh giá tác dụng phụ
và độc tính của những virut này khi dùng liều cao điều trị ung thư
KẾT LUẬN
Kết quả của chúng tôi đã chứng minh dùng phối hợp virut vắc xin MeV và MuV rất có hiệu quả kháng khối u tế bào đại tràng HT29 trên chuột nude Khối u phát triển chậm, thời gian sống của chuột mang khối u ở nhóm tiêm phối hợp virut dài hơn đáng kể so với nhóm tiêm đơn virut
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1 Mathers C, Boschi-Pinto C Global
burden of cancer in the year 2000: Version 1 estimates Geneva: World Health Organization
2006
2 FDA FDA approves first-of-its-kind
product for the treatment of melanoma 2015
3 Fielding A.K Measles as a potential
oncolytic virus Rev Med Virol 2005,15 (2), pp.135-142
Trang 74 Cohen M, Elkabets M, Perlmutter M,
Porgador A, Voronov E, Apte R.N et al
Sialylation of 3methylcholanthrene-induced
fibrosarcoma determines antitumor immune
responses during immunoediting J Immunol
2010, 185, pp.5869-5878 [PubMed: 20956342]
5 Olga V Matveeva, Zong S Guo,
Svetlana A Shabalina, Peter M Chumakov
Oncolysis by paramyxovirutes: Multiple
mechanisms contribute to therapeutic efficiency
Mol Ther Oncolytics 2015
6 Rae Myers et al Oncolytic activities of
approved mumps and measles vaccines for
therapy of ovarian cancer Cancer Gene
Therapy 2005, 12, pp.593-599
7 Arun Ammayappan, Stephen J Russell, Mark J Federspiel Recombinant mumps virut
as a cancer therapeutic agent Molecular Therapy - Oncolytics 2016, 3, p.16019
8 Shimizu Y, Hasumi K, Okudaira Y et al
Immunotherapy of advanced gynecologic cancer patients utilizing mumps virut Cancer Detect Prev 1988, 12, pp.487-495
9 Asada T Treatment of human cancer
with mumps virut Cancer 1974, 34,
pp.1907-1928
10 Saika S, Kidokoro M, Aoki A et al
Neurovirulence of mumps virut: Intraspinal inoculation test in marmosets Biologicals
2004, 32, pp.147-152