Mục tiêu nghiên cứu của đề tài này nhằm phát hiện các gene blaOXA lưu hành trong các chủng AB ở bệnh viện Đa khoa Thống Nhất, Đồng Nai năm 2013. Mời các bạn cùng tham khảo bài viết để nắm rõ nội dung chi tiết của đề tài nghiên cứu này.
Trang 1PHÁT HIỆN CÁC GENE BLAOXA Ở ACINETOBACTER BAUMANNII
BẰNG PHƯƠNG PHÁP MULTIPLEX PCR‐ELISA
Nguyễn Sĩ Tuấn*, Lưu Trần Linh Đa*, Lê Duy Nhất*, Hứa Mỹ Ngọc*, Nguyễn Ngọc Thanh*,
Phạm Thị Thanh Thủy*, Phạm Văn Dũng*, Nguyễn Thúy Hương**
TÓM TẮT
Đặt vấn đề: Acinetobacter baumannii (AB) kháng đa kháng sinh bằng nhiều cơ chế, bao gồm giảm tính
thấm qua màng, biểu hiện quá mức bơm thải kháng sinh và sản xuất carbapenemase. Năm 2013, AB kháng carbapenem bùng phát mạnh ở nhiều bệnh viện. Tính kháng này có thể do sự sản xuất các carbapenemase, trong
đó các oxacillinase thủy phân carbapenem thuộc lớp D (OXA‐23, OXA‐40, OXA‐58 và OXA‐51) được công bố phổ biến nhất ở Châu Á – Thái Bình Dương.
Mục tiêu: Phát hiện các gene bla OXA lưu hành trong các chủng AB ở bệnh viện Đa khoa Thống Nhất, Đồng Nai năm 2013.
Phương pháp nghiên cứu: Multiplex PCR – ELISA được tiến hành để phát hiện các bla OXA mã hoá các oxacillinase thuỷ phân carbapenem ở AB và sau đó, kết quả được kiểm tra bằng multiplex PCR truyền thống.
Kết quả: Trong 66 chủng AB thử nghiệm, có 83,3% kiểu gene kháng carbapenem là bla OXA‐23 và 16,67% bla OXA‐58 Có tới 97% các chủng AB mang gene bla OXA‐51
Kết luận: Cần tiến hành cách ly các bệnh nhân nhiễm trùng do AB có lưu hành các bla OXA , đặc biệt là các gene nằm trên plasmid, nhằm ngăn ngừa sự phát tán gene kháng thuốc.
Từ khóa: Acinetobacter baumannii, carbapenem, carbapenemase,bla OXA‐23 , bla OXA‐51, bla OXA‐58.
ABSTRACT
DETECT BlaOXA GENES OF ACINETOBACTER BAUMANNII BY MULTIPLEX PCR – ELISA
METHOD
Nguyen Si Tuan, Luu Tran Linh Da, Le Duy Nhat, Hua My Ngoc, Nguyen Ngoc Thanh,
Pham Thi Thanh Thuy, Pham Van Dung, Nguyen Thuy Huong
* Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 18 ‐ Supplement of No 6‐ 2014: 458 – 462
Background: Acinetobacter baumannii (AB) multiple antibiotic resistance by various mechanisms,
including decreased membrane permeability, antibiotic pump overexpression and carbapenemase production. In
2013, outbreak of carbapenem which are resistant to AB occured in many hospitals. This resistance may be due to the production of carbapenemase, in which the hydrolysis oxacillinase carbapenem class D (OXA ‐ 23, OXA ‐ 40, OXA ‐ 58 and OXA ‐ 51) was documented most in Asian Pacific Ocean.
Objectives: To detect the gene bla OXA in AB strains accuired at Thong Nha‐ Dong Nai General Hospital in 2013.
Methods: Multiplex PCR ‐ ELISA was performed to detect bla OXA encoded oxacillinase in AB and then, the results were confirmed by multiplex PCR.
Result: In 66 AB strains tested, 83.3% genotypes resisted to carbapenem was bla OXA‐23 and 16.67% bla OXA‐58
Up to 97% of the AB strain was carrying bla OXA‐51 gene.
Conclusion: It is necessary to isolate patients infected AB carrying the bla OXA , especially the genes located on plasmid in order to prevent the spread of resistance genes.
*Bệnh viện Đa khoa Thống Nhất, Đồng Nai **ĐH Bách Khoa TP.HCM – Đại học Quốc gia TP.HCM
Tác giả liên lạc: Ths. Nguyễn Sĩ Tuấn ĐT: 0919563 323 Email: nsituan@gmail.com
Trang 2Key words: Acinetobacter baumannii, carbapenem, carbapenemase,bla OXA‐23 , bla OXA‐51, bla OXA‐58.
ĐẶT VẤN ĐỀ
Trong suốt thế kỷ trước, sự bùng phát các vụ
dịch Acinetobacter baumannii đa kháng thuốc gây
nhiễm khuẩn bệnh viện, đặc biệt ở những bệnh
nhân suy giảm miễn dịch trong các đơn vị Hồi
sức Cấp cứu (ICU), đã được ghi nhận ở khắp các
vùng địa lý khác nhau trên toàn thế giới(1,10).
Những nhiễm trùng này bao gồm nhiễm trùng
huyết, nhiễm trùng vết mổ, viêm màng não thứ
cấp, nhiễm trùng đường niệu và viêm phổi liên
quan thở máy(1,10). Tuy nhiên, sự phát triển gần
đây của các chủng Acinetobacter baumannii sản
xuất Carbapenemase lớp D (chủ yếu là
oxacillinase), là mối quan tâm lớn nhất đối với
cộng đồng khoa học quốc tế, kể từ khi
Carbapenem được sử dụng thường xuyên để
điều trị nhiễm các chủng Acinetobacter baumannii
đa kháng kháng sinh(2,8). Vì những lý do này, đề
nghị cần thiết phải có một chương trình giám sát
trong đó bao gồm theo dõi sự kháng kháng sinh
và các nhiễm trùng mắc phải tại ICU (là gì?), với
việc sử dụng các phương pháp nhanh chóng,
hiệu quả và đáng tin cậy. Multiplex PCR –
ELISA là một phương pháp chẩn đoán mới để
trực tiếp phát hiện các gene mã hóa OXA –
carbapenemase trong các bệnh phẩm lâm sàng.
Mục tiêu nghiên cứu
Xác định tỷ lệ các nhóm gene blaOXA lưu hành
ở Acinetobacter baumannii tại bệnh viện Đa khoa
Thống Nhất, Đồng Nai năm 2013 bằng multiplex
PCR‐ELISA.
Xác định lại kết quả bằng phương pháp
multiplex PCR.
ĐỐI TƯỢNG ‐ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Bệnh phẩm lâm sàng và chủng vi khuẩn
66 mẫu bệnh phẩm, bao gồm: 4 ca cấy máu
dương tính, 6 ca cấy mủ vết thương, 2 ca cấy
nước tiểu và 54 ca cấy đàm, được thu thập trong
năm 2013 tại Bệnh viện Đa khoa Thống Nhất,
Đồng Nai. Các bệnh phẩm được phân lập trên
môi trường MacConkey (MC). Định danh được
tiến hành bằng bộ định danh API 20NE, Biomerieux, Pháp.
Kiểm tra nhạy cảm kháng sinh
Các chủng Acinetobacter baumannii thuần
được thử nghiệm nhạy cảm kháng sinh bằng phương pháp Kirby‐Bauer với đĩa kháng sinh
(Imipenem và Meropenem), quinolon, và polymycine (colistin) của hãng Biomerieux, Pháp. Các chủng kháng carbapenem được tiến hành thử nghiệm nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của imipenem và meropenem bằng phương pháp E‐TEST, Biomerieux, Pháp.
Tách chiết DNA và blaOXA PCR
Các khuẩn lạc đơn – thuần khiết (một khuẩn lạc) được huyền phù trong 500 μl multiplex lysis buffer. Lysis buffer được ủ 10 phút trong thermoblock ở 990C.Sau đó ly tâm 1000 vòng/ 2 phút, hút 5 μl dịch nổi để tiến hành PCR. Các gene mã hóa oxacillinase được xác định bằng cách sử dụng kỹ thuật multiplex PCR với các
mồi đặc hiệu cho blaOXA‐23, blaOXA‐40, blaOXA‐51, blaOXA‐
5’GATCGGATTGGAGAACCAGA3’; OXA‐23R: 5’–ATTTCTGACCGCATTTCCAT–3’; OXA‐40F: 5’–
GGAATTCCATGAAAAAATTTATACTTCC–3’;
CIIIATCCCGTTAAATGATTCCAAGAIIIICTA
5’–TGGATTGCACTTCATCTTGG–3’; OXA‐58F:
58R: 5’–CCCCTCTGCGCTCTACATAC–3’). Mỗi phản ứng multiplex PCR gồm 5 μl dịch nổi/5 μl chứng âm, 1 μl dung dịch Nucleotide, 2 μl dung dịch mồi, 5 μl PCR buffer 10x, 0.2 μl DNA polymerase 1U, thêm H2O cất 2 lần cho đủ 50 μl.
PCR – ELISA
Sản phẩm PCR được lai đặc hiệu với các oligonucleotide trong hệ thống ELISA.
Trang 3
Hình 1. Lưu đồ PCR‐ELISA phát hiện oxacillinase ở Acinetobacter baumannii
Thống kê, phân tích số liệu
Nghiên cứu được tiến hành theo phương
pháp cắt ngang mô tả, mẫu không xác suất và
thuận tiện. Số liệu được nhập bằng Epi‐data 3.1
và xử lý bằng phần mềm Stata 11.0.
KẾT QUẢ
Trong nghiên cứu trước trong năm 2013, 369
chủng Acinetobacter baumannii (16,13%) được
phân lập từ các bệnh phẩm đàm, mủ, máu và nước tiểu trong số 2.288 mẫu cấy dương tính.
Chọn ngẫu nhiên 66 chủng để tiến hành thử nghiệm, bao gồm: 4 chủng từ cấy máu, 2 chủng
từ cấy catheter thông tiểu, 6 chủng từ mủ vết thương hậu phẫu và 54 chủng từ đàm.
Bảng 1: Tỷ lệ đề kháng kháng sinh của 66 chủng A. Baumannii thử nghiệm
Amino glycoside
Cephem
β-lactam/ức chế β-lactamase
Ticarcillin/ clavulanic acid 89,19 5,41 5,41
Trang 4Từ bảng 1 thấy, đa số A. baumannii thử
nghiệm kháng cao với hầu hết các kháng sinh,
kháng trung bình với tetracycline và β‐
lactam/sulbactam và nhạy 100% lipopeptide
(colistin).
Hình 2: Phương pháp multiplex PCR – ELISA phát
hiện Oxacillinase ở A. baumannii.
Bảng 2: MIC Meropenem và Imipenem ở 66
Acinetobacter baumannii thử nghiệm
Số chủng
A baumannii
MIC của Meropenem
MIC của Imipenem
2 0,125 0,25
1 0,38 0,38
1 0,75 0,5
1 4 0,19
1 14 2
60 >32 >32
Từ bảng 2 cho thấy, đa số các chủng trong lô
thử nghiệm (> 92%) có MIC (carbapenem) >14
μg/ml. Đây là các chủng Acinetobacter baumannii
có kiểu hình kháng carbapenem bằng E‐TEST.
Bảng 3: Các nhóm gene bla OXA trong số 66 chủng A.
baumannii nghiên cứu
PCR-ELISA
BỆNH PHẨM
MÁU
NƯỚC
Từ hình 3 và bảng 3 cho thấy, các nhóm gene
blaOXA‐23(kích thước 501 bp), blaOXA‐58 (kích thước
599 bp) và blaOXA‐51 (kích thước 353 bp) được phát hiện khi tiến hành điện di sản phẩm DNA khuếch đại trên agarose gel. Nhóm đầu tiên trong các chủng thử nghiệm dương tính với cả OXA‐51 và OXA‐23 (83,3%). Nhóm thứ hai dương tính với cả OXA‐51 và OXA‐58 (16,67%). Nhóm thứ ba, chỉ dương tính với OXA‐58 (2 ca, chiếm 0,03%).
Hình 3: Kết quả được thiết lập sau khi multiplex PCR
được tiến hành, sử dụng agarose gel 2% để phát hiện các gene bla OXA trong các Acinetobacter baumannii.
BlaOXA‐51 là một gene nội tại của A.
Baumannii (6). Đây là gene nằm trên nhiễm sắc thể, cần thiết để điều hoà vùng thượng nguồn bởi
ISAba1 để kích thích tính kháng carbapenem. Tỷ lệ
blaOXA‐51 trong các chủng Acinetobacter baumannii
phân lập từ lâm sàng trong thử nghiệm này là gần 97%. Số liệu này thấp hơn các phát hiện trong nghiên cứu được tiến hành ở Iran bởi Feizabadi và cộng sự (2008), theo đó có 100%
chủng có gene blaOXA‐51 (3).
Tỷ lệ blaOXA‐23 ở các chủng AB phân lập từ lâm
sàng trong nghiên cứu này là 83,3%. Phát hiện
này cao hơn nhiều so tỷ lệ blaOXA‐23 chung là 66,5% phát hiện ở các quốc gia Châu Á‐Thái Bình Dương (Ấn Độ, Trung Quốc, Thái Lan, Singapore, Hồng Kông và Hàn Quốc; không có Việt Nam)(5). Tuy nhiên, dựa trên nghiên cứu khác được tiến hành bởi Feizabadi và cộng sự
(2008), cho thấy có 36,5% các chủng Acinetobacter
baumannii phân lập từ lâm sàng có tỷ lệ mang
gene blaOXA‐23 khác biệt nhau ở trên thế giới(3).
BlaOXA‐23 là một gene đề kháng carbapenem mắc
phải nằm trên plasmid của Acinetobacter
baumannii, vì thế có một tỷ lệ khác nhau được
Trang 5phát hiện so với gene blaOXA‐51 là gene kháng
carbapenem xuất hiện tự nhiên nằm trên nhiễm
sắc thể của AB (6,7) Tỷ lệ blaOXA‐58 trong các AB phân
lập từ lâm sàng trong nghiên cứu này chiếm
16,67%. Số liệu này cao hơn tỷ lệ 15% blaOXA‐58 ở
AB trong nghiên cứu của Feizabadi và cộng sự tại
Iran năm 2008(3). BlaOXA‐58 là gene vừa nằm trên
nhiễm sắc thể, vừa nằm trên plasmid nên các tỷ lệ
phân lập trên thế giới có sự khác biệt(7).
Các kết quả này cũng phù hợp với các tổng
kết gần đây của Tada và cộng sự công bố năm
2013 tại chính 2 bệnh viện Bạch Mai và Chợ Rẫy,
theo đó trong cơ chế tiết enzyme phá hủy kháng
sinh carbapenem, các OXA‐carbapenemase lớp
D (Ambler carbapenemase lớp D) phổ biến trên
toàn thế giới và khu vực Châu á – Thái Bình
Dương lưu hành chủ yếu các chủng Acinetobacter
baumannii mang gene mã hóa nhóm OXA‐23(9).
KẾT LUẬN
Acinetobacter baumannii kháng cao với hầu
hết các kháng sinh, kháng trung bình với
tetracycline và β‐lactam/sulbactam và nhạy
100% lipopeptide.
Sau khi hoàn thành nghiên cứu này, có bằng
chứng rõ ràng rằng các nhóm gene blaOXA
(carbapenemase lớp D) là một vấn đề trong các
chủng Acinetobacter baumannii phân lập từ lâm
sàng tại bệnh viện Đa khoa Thống Nhất, Đồng
Nai. Các nhóm blaOXA nằm trên plasmid (OXA‐23
và có thể là OXA‐58) có tỷ lệ khác biệt so với các
nghiên cứu khác trên thế giới.
Kỹ thuật multiplex PCR‐ELISA được chứng
minh là kỹ thuật nhanh và chính xác để kiểm tra
nhạy cảm kháng sinh. Tuy nhiên, vẫn còn nhiều
việc phải cải tiến để có thể áp dụng kỹ thuật
multiplex PCR như là 1 chọn lựa thay thế cho
các xét nghiệm nhạy cảm kháng sinh hiện nay.
KIẾN NGHỊ
Khả năng Acinetobacter baumannii tăng trưởng
trong màng biofilms đặt ra một mối đe doạ liên
quan tới khả năng lây lan của chủng vi khuẩn này, theo đó phát tán các gene kháng thuốc, cần được điều tra nghiên cứu trong tương lai.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
epidemiological features. Clinical microbiology Reviews. 9(2) 148.
Acinetobacter baumannii from four continents. Clinical
Microbiology And Infection. 11(4), 326‐329.
Antimicrobial susceptibility patterns and distribution of blaOXA genes among Acinetobacter spp. isolated from
patients at Tehran hospitals. J Infect Dis. 61(4). 274‐8.
Carbapenem resistance in Acinetobacter baumannii. Expert
Rev Anti Infect Ther. 11(4). 395 – 409.
(2009). Emergence and widespread dissemination of OXA‐23.
‐24/40 and –58 carbapenemases among Acinetobacter spp in Asia‐Pacific nations: report from the SENTRY Surveillance
Program. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 63. 55‐59.
genes are ubiquitous and vary within a strain in
Acinetobacter baumannii. International Journal Of Antimicrobial
Agents. 28(2). 110‐113.
Bonomo RA, (2007). Global challenge of multidrug‐resistant
chemotherapy. 51(10). 3471‐3484.
Acinetobacter baumannii: mechanisms and epidemiology.
Clinical microbiology and infection. 12(9). 826‐836.
rRNA methylase‐producing Acinetobacter baumannii and Pseudomonas aeruginosa isolates in hospitals in Vietnam.
BMC infectious diseases. 13(1). 251.
10 Villegas MV, Hartstein AI (2003). Acinetobacter Outbreaks.
1977‐2000. Infection control and hospital epidemiology. 24(4). 284‐
295.
Ngày nhận bài báo: 10/5/2014 Ngày phản biện nhận xét bài báo: 16/6/2014 Ngày bài báo được đăng: 14/11/2014