Tình hình nghiên cứu và mục tiêu của đề tài đề cập về: Công thức thuốc có nguồn gốc từ bài thuốc điều trị mất ngủ do GS. Bùi Chí Hiếu đề xướng, gồm 4 vị Bình vôi, Lạc tiên, Lá sen, Lá vông nem. Công thức trên cần phải được khẳng định tính an toàn cũng như các tác dụng dược lý bằng các mô hình dược lý thực nghiệm. Và nghiên cứu với mục tiêu nhằm khảo sát độc tính và tác dụng an thần của cao chiết nước Bình vôi-Lạc tiên-Lá sen-Lá vông nem.
Trang 1NGHIÊN CỨU ĐỘC TÍNH VÀ TÁC DỤNG AN THẦN CỦA CAO BÌNH VÔI – LẠC TIÊN – LÁ SEN – LÁ VÔNG NEM
TRÊN CHUỘT NHẮT TRẮNG
Nguyễn Văn Đàn*, Phan Quan Chí Hiếu*
TÓM TẮT
Đặt vấn đề: Công thức thuốc có nguồn gốc từ bài thuốc điều trị mất ngủ do GS Bùi Chí Hiếu đề xướng,
gồm 4 vị Bình vôi, Lạc tiên, Lá sen, Lá vông nem Công thức trên cần phải được khẳng định tính an toàn cũng như các tác dụng dược lý bằng các mô hình dược lý thực nghiệm
Mục tiêu nghiên cứu: Khảo sát độc tính và tác dụng an thần của cao chiết nước Bình vôi-Lạc tiên-Lá sen-Lá
vông nem
Phương pháp nghiên cứu: Trong nghiên cứu này, các tác dụng an thần và độc tính của cao chiết nước Bình
vôi-Lạc tiên-Lá sen-Lá vông nem được đánh giá với các mô hình thử nghiệm trên thú vật Tác động an thần được đánh giá bằng cách đo lường việc kéo dài thời gian ngủ mê của chuột gây ra bởi thiopental và tác dụng giải lo âu đánh giá bằng mô hình hai ngăn sáng tối
Kết quả: Cao chiết liều 1,97 g/kg không có tác dụng kéo dài thời gian gây ngủ của thiopental sau 30 phút sử
dụng, chỉ thể hiện sau 60 phút sử dụng Trong khi liều 3,94 g/kg khẳng định tác dụng sau 30 và 60 phút sử dụng Sau 60 phút, cao chiết liều 3,94 g/kg hiệu quả gây ngủ tăng hơn gấp 1,9 lần so với Sen vông-R liều 40 mg/kg Cả hai liều không thể hiện tác dụng giải lo âu tại thời điểm 30 và 60 phút sử dụng Chưa xác định được LD 50 và độc tính bán trường diễn trên chuột nhắt trắng theo đường uống
Kết luận: Cao chiết nước Bình vôi-Lạc tiên-Lá sen-Lá vông nem có tác dụng hợp đồng gây ngủ với thiopental
Từ khóa: Bình vôi, Lạc tiên, Lá sen, Lá vông nem, an thần, giải lo âu, mất ngủ
ABSTRACT
RESEARCH ON THE TOXICITY AND SEDATIVE-HYPNOTIC EFFECTS
OF TUBER STEPHANIAE - HERBA PASSIFLORAE FOETIDAE - FOLIUM ERYTHRINAE -
FOLIUM NELUMBINIS EXTRACT ON MICE
Nguyen Van Dan, Phan Quan Chi Hieu
* Y Hoc TP Ho Chi Minh * Vol 18 - Supplement of No 1 – 2014: 130 - 135
Background: Formulation proposed by Ph.D Hieu Bui Chi, including Tuber Stephaniae- Herba Passiflorae
foetidae - Folium Erythrinae - Folium Nelumbinis for the treatment of insomnia It is necessary to evaluate
pharmacological activities and toxicity of this formula in animal models
Aims of study: Evaluate the hypnotic-anxiolytic effects and toxcity of Tuber Stephaniae- Herba Passiflorae
foetidae - Folium Erythrinae - Folium Nelumbinis extract on mice
Materials and Method: In this present study, the anxiolytic-hypnotic effects of extract were evaluated in
animal models when administered oral route The light-dark test were used to evaluate the anxiolytic effect The hypnotic effect was evaluated by measuring potentiation of thiopental sleeping time in mice.
* Khoa Y học cổ truyền, Đại học Y dược TP Hồ Chí Minh
Trang 2Results: Extract given orally at the dose of 1.97 g/kg prolonged the thiopental induced sleep time after 60
minutes and the dose of 3.94 g/kg prolonged the thiopental induced sleep time after 30 minutes and 60 minutes, both of them did not shown to have anxiolytic activities After 60 minutes, extracts at dose of 3.94 g/kg of hypnotic effect more than 1.9 times the Sen vong-R at the dose of 40 mg/kg LD50 and chronic toxicity has not been determined by orally
Conclusion: Tuber Stephaniae- Herba Passiflorae foetidae - Folium Erythrinae - Folium Nelumbinis extract
were found to have the hypnotic activity.
Keywords: Tuber Stephaniae, Herba Passiflorae foetidae, Folium Erythrinae, Folium Nelumbinis,
anxiolytic effect, hypnotic effect, insomnia
ĐẶT VẤN ĐỀ
Hiện nay, chứng mất ngủ ngày càng phổ
biến với nhiều yếu tố nguy cơ và nguyên nhân
Tác động tích lũy lâu dài của mất ngủ liên quan
với nhiều hậu quả sức khỏe nguy hiểm và tác
động kinh tế quan trọng Tuy có nhiều phương
pháp điều trị khác nhau như: vệ sinh giấc ngủ,
dùng thuốc, nhưng đơn trị liệu thường kém hiệu
quả, thời gian điều trị và theo dõi dài, tỉ lệ tái
phát cao Việc điều trị với các nhóm thuốc an
thần, chủ yếu là nhóm bezodiazepin gây nhiều
tác dụng phụ Do vậy, việc tìm kiếm các phương
pháp điều trị hiệu quả, ít hoặc không gây tác
dụng phụ, giảm chi phí y tế là rất cần thiết Từ
bài thuốc điều trị mất ngủ do GS Bùi Chí Hiếu
đề xướng, gồm Bình vôi, Lạc tiên, Lá sen, Lá
vông nem(1), là những vị thuốc có tác dụng an
thần theo kinh nghiệm dân gian, tuy nhiên công
thức trên chưa đánh giá bằng các nghiên cứu, vì
vậy mục tiêu nghiên cứu này nhằm khảo sát tính
an toàn và hiệu quả an thần của công thức trên
thực nghiệm, đó sẽ là cơ sở cho các nghiên cứu
lâm sàng tiếp theo
PHƯƠNG TIỆN- PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN
CỨU
Nguyên liệu
Cao chiết nước hỗn hợp Bình vôi-Lạc tiên-Lá
sen-Lá vông nem (1,5-1-1-1), ký hiệu CAT Hiệu
suất chiết 11,59 %, độ ẩm 16,72 % ± 0,02, độ tro
toàn phần 1,3 % ± 0,15, độ tro không tan trong
acid hydrochloric 0, 14% ± 0,01, định tính bằng
phương pháp sắc ký lớp mỏng cho các vết có
màu sắc và Rf tương tự với mẫu đối chiếu Bình vôi, Lạc tiên, Lá sen, Lá vông nem
Hóa chất – Thuốc thử nghiệm - Dụng cụ
Diazepam (Valium) liều 5mg/Kg (PO) là
thuốc đối chiếu trong mô hình hai ngăn sáng tối
Thiopental liều 40mg/Kg (IV) là thuốc dùng trong mô hình kéo dài thời gian ngủ Sen vông-R
(cao lá Sen, lá Vông nem, Rotundin), sản phẩm của Công ty cổ phần dược phẩm trung ương 2, là thuốc so sánh trong mô hình hai ngăn sáng tối
và mô hình kéo dài thời gian ngủ
Xét nghiệm công thức máu: Máy huyết học hoàn toàn Sysmex KX-21, Nhật
Xét nghiệm Glucose, Urea, Creatinin, AST, ALT máu: Máy sinh hóa Eos Bravo W (Hospitex diagonosis – Italy)
Giải phẫu mô học gan, thận được thực hiện tại Khoa Giải phẫu bệnh -Bệnh viện Chợ Rẫy – Thành phố Hồ Chí Minh
Đối tượng nghiên cứu
Chuột nhắt trắng đực chủng Swiss albino,
khỏe mạnh, 6 - 8 tuần tuổi, trọng lượng trung bình 25 - 32g, cung cấp bởi Viện Pasteur TP Hồ Chí Minh Chuột được nuôi trong điều kiện ổn định về dinh dưỡng và đảm bảo chu kỳ 12/12 giờ sáng tối Chuột được làm quen với điều kiện phòng thí nghiệm ít nhất 24 giờ Kích thích âm thanh, mùi ở phòng thí nghiệm được hạn chế ở mức thấp nhất Tất cả các thử nghiệm được tiến hành từ 9:00 đến 16:00, ở điều kiện ổn định về nhiệt độ và độ ẩm
Phương pháp khảo sát độc tính cấp (4)
Thử nghiệm thực hiện qua 2 giai đoạn:
Trang 3Giai đoạn thăm dò (mỗi lô dò liều 6 chuột):
Khởi đầu từ liều cao nhất có thể bơm được qua
kim đầu tù cho uống Xác định liều LD0 (liều tối
đa không gây chết) và liều LD100 (liều tối thiểu
gây chết 100%)
Giai đoạn xác định: chuột được chia lô và
cho sử dụng thuốc ở các liều trong khoảng LD0
và LD100 chia theo cấp số nhân
Theo dõi các biểu hiện về hành vi và vận
động của chuột trong vòng 72 giờ sau khi
dùng thuốc Ghi nhận số chuột chết trong
từng lô Xác định LD50 (nếu có) theo phương
pháp Karber-Behrens
Phương pháp khảo sát độc tính bán
trường diễn (2)
Chuột thử nghiệm được chia ngẫu nhiên
thành 2 lô:
- Lô chứng (n=10): Được cho uống nước cất
hàng ngày trong 60 ngày
- Lô thử (n=10): Uống cao CAT với liều 3,94 g
cao khô/kg chuột (tương đương 16,42 g cao
khô/kg người) trong 60 ngày
Thể tích cho chuột uống là 0,2ml/10g thể
trọng
Cuối thử nghiệm, ghi nhận và so sánh các chỉ
số: số lượng hồng cầu (triệu/mm3), số lượng bạch
cầu (ngàn/mm3), tiểu cầu (ngàn/mm3),
hemoglobin (g/L), hematocrit (%), AST(U/L),
ALT(U/L), creatinin (mg/dL), glucose máu
(mg/dL), vi thể gan và thận
Thử nghiệm tác dụng gây ngủ (5, 7)
Sau 30 hoặc 60 phút dùng thuốc thử hay chất
chứng, tiêm tĩnh mạch thiopental 30 mg/kg
chuột Thời gian chuột ngủ mê được tính từ
lúc chuột mất phản xạ thăng bằng cho đến khi
chuột có lại phản xạ thăng bằng Chuột được
chia ngẫu nhiên thành 7 lô như sau:
- Lô 1 (n=10): Lô chứng uống nước cất
- Lô 2 (n=10): Uống Sen vông-R liều 40 mg/kg
(tính theo cao khô lá sen) (dựa theo nhóm tác giả
Nguyễn Lan Thùy Ty, Võ Phùng Nguyên,
Nguyễn Hữu Đức (2008))
- Lô 3 (n=10): Uống cao CAT với liều 1,97 g cao khô/kg chuột (tương đương 8,21 g cao khô/ người 50 kg)
- Lô 4 (n=10): Uống cao CAT với liều 3,94 g cao khô/kg chuột (tương đương 16,42 g cao khô/ người 50 kg)
- Lô 5 (n=10): Uống thuốc Sen vông-R liều 40 mg/kg (tính theo cao khô lá sen)
- Lô 6 (n=10): Uống cao CAT với liều 1,97 g cao khô/kg chuột (tương đương 8,21 g cao khô/ người 50 kg)
- Lô 7 (n=10): Uống cao CAT với liều 3,94 g cao khô/kg chuột (tương đương 16,42 g cao khô/ người 50 kg)
Chuột được cho uống 30 phút trước thử nghiệm đối với lô 1, 2, 3, 4 Đối với lô 5,6, 7 chuột được cho uống 60 phút trước thử nghiệm Thể tích uống là 0,2 ml/10 g chuột Sau đó tiêm thiopental đường tĩnh mạch đuôi chuột
Thử nghiệm giải lo âu với mô hình hai ngăn sáng tối (5, 7)
Thiết bị thử nghiệm Panlab Black and White box–Tây Ban Nha gồm hộp nhựa Perspex được chia thành hai ngăn: sáng (250 x 250 x 240 mm, lắp bóng đèn trắng 100W) và ngăn tối (160 x 250
x 240 mm, lắp bóng đèn đỏ 40W) Hai bóng đèn cách sàn 370 mm Hai ngăn thông nhau bởi một cửa có kích thước 70 x 70 mm ở bên dưới, chính giữa hộp Thời gian và số lần chuột di chuyển vào các ngăn được máy tính ghi nhận thông qua phần mềm chuyên dụng (PPC Win v2.0.03) Chuột được chia ngẫu nhiên thành 4 lô thử nghiệm như sau:
- Lô 1 (n=10): Lô chứng, uống nước cất
- Lô 2 (n=10): Lô đối chiếu, uống Diazepam liều 5 mg/kg chuột
- Lô 3 (n=10): Uống cao CAT với liều 1,97 g cao khô/kg chuột (tương đương 8,21.g cao khô/kg người)
- Lô 4 (n=10): Uống cao CAT với liều 3,94 g cao khô/kg chuột (tương đương 16,42 g cao khô/kg người)
Trang 4Chuột được cho uống 30 phút trước thử
nghiệm Thể tích uống là 0,2 ml/10 g chuột
Chuột được đặt ở cửa ngăn cách vùng sáng
và tối, hướng ra ngăn sáng Sau đó chuột được
tự do khám phá trong 5 phút Ghi nhận lại số lần
ra vùng sáng của chuột và thời gian ở vùng sáng
Chuột được tính là ra vùng sáng khi cả 4 chân
vượt qua lằn phân cách giữa 2 vùng
Ghi nhận tại các thời điểm 30 phút và 60
phút sau khi uống thuốc đối với các lô 3, 4 Còn
lô 1 và 2 chỉ ghi nhận tại thời điểm 30 phút sau
khi uống
Phương pháp xử lý thống kê số liệu thực
nghiệm
Các dữ liệu được trình bày dưới dạng
Mean ± SEM, xử lý bằng phần mềm SPSS
phiên bản 16.0 với phép kiểm Student cho 2
dãy số liệu độc lập So sánh sự khác nhau giữa
các nhóm có tác dụng gây ngủ bằng phép
kiểm ANOVA một chiều, một yếu tố Sự khác nhau được xem là có ý nghĩa khi giá trị p < 0,05 Đồ thị được vẽ theo giá trị Mean ± SEM bằng phần mềm MS EXCEL 2007
KẾT QUẢ Độc tính cấp
D max là 19,7 g cao khô/kg chuột (khoảng
169,95 g dược liệu khô) gấp 257 lần liều thường
sử dụng trong ngày (khoảng 24 - 42 g/ngày), không có chuột chết trong vòng 72 giờ Liều thử nghiệm dò liều tác dụng dược lý trong trường hợp chưa xác định được LD50 trên chuột nhắt trắng theo đườn g uống gồm liều 1/20, 1/10 và 1/5 D max.(4) Liều có hiệu quả tác dụng dược lý sẽ được lấy làm liều thử độc tính bán trường diễn Sau khi dò liều có hai liều 1/10 D max (1,97 g cao khô/kg chuột) và 1/5 D max (3,94 g cao khô/kg chuột) thể hiện tác dụng dược lý
Độc tính bán trường diễn
Bảng 1: Trị số huyết học, sinh hóa của chuột nhắt sau uống thuốc liều 3,94 g cao khô/kg trong 60 ngày
Trị số huyết học và sinh hóa của chuột nhắt
uống cao CAT liều 3,94 g cao khô/kg chuột, sau
60 ngày đều không có sự khác biệt có ý nghĩa
thống kê so với lô chứng uống nước cất (p> 0,05)
Hình ảnh giải phẫu mô học gan, thận của
chuột uống cao CAT liều 3,94 g cao khô/kg chuột
sau 60 ngày không có sự khác biệt so với lô
chứng uống nước cất
Cao CAT không có tác dụng hiệp lực gây
ngủ với thiopental ở liều 1,97 g/kg ở thời điểm 30
phút nhưng có tác dụng ở thời điểm 60 phút
sau khi sử dụng
Cao CAT có tác dụng hiệp lực gây ngủ với thiopental ở liều 3,94 g/kg ở cả hai thời điểm
30 phút và 60 phút sau khi sử dụng (p<0,01)
Lô dùng cao CAT liều 3,94 g cao khô/kg chuột tại thời điểm 60 phút khác biệt có ý nghĩa thống kê với 3 lô dùng Sen vông-R liều
40 mg/kg chuột tại thời điểm 60 phút, lô dùng cao an thần liều 1,97 g cao khô/kg chuột tại thời điểm 60 phút và lô dùng cao an thần liều 3,94 g cao khô/kg chuột tại thời điểm 30 phút (p < 0,01)
Trang 5Tác dụng kéo dài thời gian ngủ gây bởi thiopental
Hình 1 Ảnh hưởng hiệp lực với thiopental trên thời gian ngủ mê ở các lô uống cao CAT và Sen-Vông-R sau 30
phút và 60 phút sử dụng thuốc, **p <0,01 so với lô chứng DW: Nước cất SV1: Sen vông 40mg/kg, sau 30 phút SV2: Sen vông 40mg/kg, sau 60 phút.CAT1: Cao an thần 1,97 g/kg, sau 30 phút CAT2: Cao an thần 1,97 g/kg, sau 60 phút.CAT3: Cao an thần 3,94 g/kg, sau 30 phút.CAT4: Cao an thần 3,94 g/kg, sau 60 phút
Hình 2 Ảnh hưởng hiệp lực với thiopental trên thời gian ngủ mê ở các lô có hiệu lực
Tác dụng giải lo âu trên mô hình hai ngăn sáng tối
Hình 3 Số lần ra ngăn sáng của các lô trong thử nghiệm ngăn sáng - tối, (** p < 0,01 so với lô chứng)
DW: Nước cất DZP: Diazepam 5 mg/kg CAT1: Cao an thần 1,97 g/kg, sau 30 phút CAT2: Cao an thần 1,97 g/kg, sau 60 phút CAT3: Cao an thần 3,94 g/kg, sau 30 phút CAT4: Cao an thần 3,94 g/kg, sau 60 phút
Trang 6So với lô chứng uống nước cất, chỉ có
diazepam liều 5 mg/kg (p.o) có tác dụng làm
tăng số lần ra ngăn sáng của chuột thử nghiệm
Hình 4 Thời gian chuột ở ngăn sáng của các lô (s) trong thử nghiệm ngăn sáng-tối, * p < 0,05 so với lô
chứng
So với lô chứng uống nước cất, chỉ có
diazepam liều 5 mg/kg (p.o) có tác dụng làm
tăng thời gian ở ngăn sáng của chuột thử nghiệm
của chuột thử nghiệm
BÀN LUẬN
Cao thuốc nghiên cứu thể hiện tác dụng như
một thuốc an thần, gây ngủ, không thể hiện tác
dụng như một thuốc giải lo âu Điểm khác của
công thức là có thêm Lạc tiên, đã được nghiên
cứu có tác dụng ức chế kênh Na+/Ca++, thụ thể
GABA và NMDA ở não (8), điều này có thể góp
phần giải thích hiệu quả tăng tác dụng gây ngủ
của công thức thuốc thông qua tác dụng hiệp
đồng với các dược liệu khác Đồng thời, qua
định tính có sự hiện diện của
L-tetrahydropalmatin có trong cao chiết, qua y văn
cho thấy L-tetrahydropalmatin có tác dụng gây
ngủ do tác động lên các tế bào thần kinh thể vân
ở não như là một chất đối kháng dopaminergic
và có thể ức chế dẫn truyền (block) cả hai thụ thể
tiền và hậu synap của thụ thể dopaminergic (6).
Theo Y học cổ truyền, công thức thuốc có
vị đắng, tính bình và mát, qui kinh Can, Tâm,
Tỳ, Vị(3) Về mặt lý thuyết, tác dụng phối ngũ
của bài thuốc giúp thanh nhiệt, tả hỏa, an thần
thỏa pháp trị của bệnh danh Can khí uất nhiệt,
tuy nhiên cần nghiên cứu thêm ở các mô hình
khác nhau
KẾT LUẬN
Cao chiết nước Bình vôi-Lạc tiên-Lá sen-Lá vông nem có tác dụng hợp đồng gây ngủ với thiopental Về độc tính, chưa xác định được LD50
và độc tính bán trường diễn trên chuột nhắt trắng theo đường uống
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1 Bùi Chí Hiếu (1994) Dược lý trị liệu thuốc nam Nhà xuất bản
Đồng Tháp, tr 22 - 35
2 Bộ Y tế (1996) Quy chế đánh giá tính an toàn và hiệu lực của thuốc cổ truyền (Ban hành kèm theo quyết định số 371/BYT-QĐ ngày 12/3/1996 của Bộ trưởng Bộ Y tế) Tạp chí Dược học số 241,
tr 3 – 9
3 Bộ Y tế (2009) Dược điển Việt Nam IV Nhà xuất bản Y Học, tr
696 697, 810 811, 882 883, 930 931, PL 182 183, PL 236
-237
4 Đỗ Trung Đàm (1996) Phương pháp xác định độc tính cấp của thuốc Nhà xuất bản Y học, Hà Nội, tr 50 - 57
5 Gerhard Vogel (ed.) (2002) Drug Discovery and Evaluation:
-496
L-tetrahydropalmatine on dopamine release and metabolism in the rat striatum” Psychopharmacology (Berl)., Vol.89 (1), pp
89-93
7 Nguyễn Lan Thùy Ty, Võ Phùng Nguyên, Nguyễn Hữu Đức (2008) Đánh giá tác dụng an thần-gây ngủ của 2 chế phẩm có
nguồn gốc dược liệu Y Học TP HCM, tập 12( 2), tr 106 - 111.
8 Pavan Kumar Reddy K., Bhagavan Raju M., Sreedevi P., Pranali Pandit,Veena Rani I., Veena G (2009) Phytochemical screening antiepileptic& analgesic activity of leaf extract of passiflora foetida Pharmacologyonline 3, pp 576 - 580
Ngày nhận bài báo: 28/09/2013 Ngày phản biện nhận xét bài báo: 10/10/2013, 04/11/2013
Ngày bài báo được đăng: 02/01/2014