Mục tiêu nghiên cứu của bài viết nhằm đánh giá hiệu quả quy trình thu gom, chiết tách khối tế bào gốc (TBG) từ dịch tủy xương bằng phương pháp ly tâm theo phân lớp tỷ trọng tế bào. Mời các bạn cùng tham khảo tài liệu.
Trang 1HIỆU QUẢ CỦA PHƯƠNG PHÁP LY TÂM PHÂN LỚP TỶ TRỌNG
PHÂN LẬP TẾ BÀO GỐC TỦY XƯƠNG SỬ DỤNG CHO ĐIỀU TRỊ
MỘT SỐ TỔN THƯƠNG XƯƠNG VÀ KHỚP
Dương Văn Toàn*; Lý Tuấn Khải**
Tóm tắt
Nghiờn cứu này nhằm đỏnh giỏ hiệu quả quy trỡnh thu gom, chiết tỏch khối tế bào gốc (TBG) từ
dịch tủy xương bằng phương phỏp ly tõm theo phõn lớp tỷ trọng tế bào 126 bệnh nhõn (BN) khớp
giả (KG), chậm liền xương (CLX) thõn xương dài, BN ngắn chi và mất đoạn chi điều trị kộo dài chi
theo nguyờn lý Ilizarov hết giai đoạn căng gión, BN hoại tử vụ khuẩn chỏm xương đựi giai đoạn I, II
(theo ARCO), mỗi BN được chọc hỳt lấy 250 ml dịch tủy xương từ xương chậu, tỏch lấy thành phần
tế bào đơn nhõn bằng phương phỏp ly tõm gradient tỷ trọng với dung dịch ficoll tỷ trọng 1,077 g/l
Kết quả: thể tớch khối TBG tủy xương thu được là 32,19 ± 5,62 ml, số lượng tế bào cú nhõn 49,08 ±
30,79 G/L, tế bào đơn nhõn chiếm đa số (57,38 ± 13,86%); đậm độ tế bào gốc CD 34+
là 16,98 ± 9,89 G/L; tỷ lệ giữ tế bào đơn nhõn và tế bào CD 34+
tương ứng 34,89 ± 12,05% và 55,96 ± 30,46%;
đậm độ tế bào CD 34+
tăng 5,67 ± 3,15 lần; tỷ lệ loại bỏ hồng cầu và huyết sắc tố tương ứng 99,60 ± 0,48% và 99,32 ± 0,41%
* Từ khúa: Tế bào gốc tủy xương; Khớp giả; Chậm liền xương; Ly tõm phõn lớp tỷ trọng
EFFICACY OF GRADIENT DENSITY CENTRIFUGATION
METHOD IN ISOLATING BONE MARROW STEM CELLS FOR TREATMENT OF CERTAIN INJURED BONES AND JOINTS
Summary
The aims of this study was to assess the efficacy of the gradient density centrifugation method in
isolating bone marrow stem cells (BMSC) 126 patients with nonunion long bon es, shortened limbs,
aseptic femoral head osteonecrosis staged I, II (ARCO) were enrolled 250 ml bone marrow fluid
was aspirated from the pelvis of every patient Mononuclear cells were separated by the gradient
density centrifugation method using Ficoll solution 1.077 Results: Final BMSC suspension volume
was 32.19 ± 5.62 ml, the suspension cells concentration was 49.08 ± 30.79 G/L with 57.38 ± 13.86%
mononuclear cells; CD 34 + cell concentration was 16.98 ± 9.89 G/L; mononuclear cells and CD 34 +
cells recovering ratio were 34.89 ± 12.05% and 55.96 ± 30.46%, respectively; CD 34 + cell concentration
increased 5.67 ± 3.15 times; RBC and hemoglobin removing ratio were 99.60 ± 0.48% and 99.32 ±
0.41%, respectively
* Key words: Bone marrow stem cell; Nonuni on bone; Shortened limbs; Gradient density
centrifugation
* Trường Đại học Y Hà Nội
** Bệnh viện TWQĐ 108
Ng-ời phản hồi (Corresponding): Lý Tuấn Khải (lytuankhai108@gmail.com)
Ngày nhận bài: 31/7/2013; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 10/9/2013
Ngày bài báo đ-ợc đăng: 23/9/2013
Trang 2ĐẶT VẤN ĐỀ
Sử dụng TBG, TBG tạo máu trong điều
trị là một hướng đang được tập trung
nghiên cứu và đã thu được kết quả rất bất
ngờ không chỉ trong điều trị bệnh của tổ
chức tạo máu mà còn trong nhiều bệnh của
các cơ quan tổ chức khác với mục đích
phục hồi, tái tạo tổ chức Các TBG tạo máu
của tủy xương cũng như của máu tuần
hoàn được nghiên cứu rất sâu và ứng dụng
rộng rãi trong lâm sàng với kết quả tốt Đã
có một số nghiên cứu chứng minh bằng cấy
ghép TBG tủy xương tự thân có thể điều trị
thành công những trường hợp gãy xương
không liền, mất đoạn xương cũng như tái
tạo các mô xương bị hoại tử trên người
Dịch tủy xương có chứa TBG với số lượng
hạn chế, còn lại đa số là tế bào đang
trưởng thành hoặc đã trưởng thành không
có vai trò trong tạo xương Vì vậy, để đạt
yêu cầu điều trị, dịch tủy xương sau khi thu
gom được xử lý cô đặc để tập trung số
lượng TBG với đậm độ cần thiết cho quá
trình liền xương và loại bớt các thành phần
tế bào đã trưởng thành Vì vậy chúng tôi
tiến hành đề tài này nhằm mục tiêu: Đánh
giá hiệu quả quy trình thu gom, chiết tách
khối TBG từ dịch tủy xương bằng phương
pháp ly tâm theo phân lớp tỷ trọng tế bào
trong điều trị một số tổn thương xương,
khớp khó hồi phục
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU
1 Đối tượng nghiên cứu
126 BN KG, CLX thân xương dài, BN
ngắn chi và mất đoạn chi dưới điều trị kéo
dài chi theo nguyên lý Ilizarov hết giai đoạn
căng giãn, BN hoại tử vô khuẩn chỏm
xương đùi giai đoạn I, II (theo ARCO), BN
tuổi từ 15 - 66 được điều trị bằng ghép TBG
tủy xương tại Viện Chấn thương Chỉnh
hình, Bệnh viện TWQĐ 108 và Viện Chấn
thương Chỉnh hình - Bệnh viện Việt Đức từ tháng 01 - 2008 đến 03 - 2011
2 Phương pháp nghiên cứu
* Thiết kế nghiên cứu: tiến cứu mô tả cắt
ngang
* Các kỹ thuật sử dụng trong nghiên cứu:
- Kỹ thuật thu gom dịch tủy xương: thu
gom dịch tủy xương bằng phương pháp chọc hút qua da, dưới gây tê tủy sống Tiến hành thủ thuật tại phòng mổ trong điều kiện
vô khuẩn Vị trí chọc hút là gai chậu sau trên, tổng số dịch tủy xương lấy 250 ml
- Kỹ thuật tách chiết, cô đặc TBG từ dịch
tủy xương: bằng phương pháp ly tâm theo phân lớp tỷ trọng tế bào, pha loãng dịch tủy xương theo tỷ lệ 6:1 với dung dịch đệm (nước muối sinh lý hoặc dung dịch PBS, 6V dịch tủy xương + 1V dung dịch đệm) tách thành phần tế bào đơn nhân (MNC) dịch tủy xương (trong đó có chứa TBG) bằng cách ly tâm theo gradient tỷ trọng sử dụng dung dịch ficoll tỷ trọng 1,077 g/cm3
, huyền dịch khối TBG này trong 30 ml nước muối sinh lý
- Kỹ thuật xác định thành phần và chất lượng khối TBG:
+ Đếm số lượng tế bào có nhân và thành phần tế bào bằng máy huyết học tự động CELL-DYN 1800 (Abbott, Hoa Kỳ) kết hợp với phương pháp tế bào học kinh điển + Xác định TBG tạo máu bằng kỹ thuật đếm số lượng tế bào CD34+ trên thiết bị
phân tích tế bào dòng chảy FACS-Calibur
(Hoa Kỳ) với phần mềm CellQuest theo quy trình ISHAGE, sử dụng bộ sinh phẩm của
hãng Becton - Dickinson (Hoa Kỳ)
* Thu thập và xử lý số liệu: phân tích và
xử lý bằng chương trình thống kê SPSS 18.0
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ
BÀN LUẬN
Trang 3Bảng 1: Đặc điểm BN nghiên cứu (n = 126)
Trung
bình ± SD
37,70 ± 11,98 35,56 ± 11,97 > 0,05
36,52 ± 12,26
Trong tổng số 126 khối TBG của BN
nghiên cứu, 95 khối TBG được tách từ BN
nam và 31 khối TBG từ BN nữ Nghiên cứu
tiến hành ở 126 bệnh nhân có tuổi trung
bình 36,52 ± 12,26, tuổi trung bình của BN
ở hai nhóm nghiên cứu khác nhau không có
ý nghĩa thống kê (p > 0,05) BN nhỏ tuổi
nhất 15 và cao nhất 66 tuổi; bao gồm 69 BN
KG, CLX thân xương dài, 29 BN ngắn chi
và mất đoạn chi dưới điều trị kéo dài chi
theo nguyên lý Ilizarov hết giai đoạn căng
giãn, 28 BN hoại tử vô khuẩn chỏm xương
đùi giai đoạn I, II (theo ARCO), những BN
này được điều trị bằng ghép TBG tủy
xương BN được chẩn đoán bệnh dựa trên
các tiêu chuẩn về lâm sàng và cận lâm
sàng theo từng mặt bệnh tương ứng
Bảng 2: Các chỉ số tế bào của dịch tủy
xương trước tách ở BN nghiên cứu (n = 126)
ChØ sè Ьn
vÞ
Gi¸ trÞ thÊp nhÊt
Gi¸ trÞ cao nhÊt
Gi¸ trÞ trung b×nh
SD
Thể tích dịch
tủy xương
trước tách
12,49
Số lượng tế bào
có nhân trong
dịch tủy xương
Lấy dịch tủy xương: qua thăm khám cho
thấy đa phần xương chậu của BN không
quá to, phần gai chậu trước trên không dày,
tiên lượng có thể gặp khó khăn khi chọc
kim lấy tủy, tất cả 126 BN đều được lấy tủy xương ở gai chậu sau trên hai bên Do vậy,
tư thế bệnh nhân đều đặt nằm sấp Một số tác giả đã ứng dụng ghép trực tiếp tủy xương vào ổ CLX, KG thân xương chày với thể tích thay đổi khác nhau Healey (1990) [7] ghép trung bình 50 ml tủy xương để điều trị BN bị CLX, KG sau lấy u xương chày Connolly (1991) [4] ghép từ 100 - 150 ml tủy xương cho 20 trường hợp KG xương chày Tuy nhiên, có rất ít nghiên cứu ghép tủy xương sau khi tách khối TBG để điều trị CLX, KG trên lâm sàng Hernigou (2006) [8] lấy trung bình 306 ml tủy xương trước khi tách Do vậy, rất khó để chúng tôi có thể tham khảo lấy bao nhiêu dịch tủy xương ở người Việt Nam trưởng thành khỏe mạnh là vừa đủ để đạt hiệu quả liền xương tối ưu Chúng tôi thấy thông thường một người trưởng thành, khỏe mạnh có thể cho một đơn vị máu (250 ml) trong khoảng thời gian
10 - 15 phút vẫn bình thường, không ảnh hưởng đến lao động, sinh hoạt Tương tự, nếu một BN không có bệnh mạn tính hoặc không bị thương tổn nặng kèm theo, khi mất khoảng 200 - 250 ml máu cơ thể vẫn thích nghi được và có thể bù trừ bằng dung dịch cao phân tử mà không ảnh hưởng đến huyết động Hơn nữa, với một thể tích dịch tủy xương đủ lớn, hy vọng sẽ có đủ số lượng TBG cần thiết Vì vậy, chúng tôi lấy một thể tích dịch tủy xương chung cho tất
cả 101 BN là 250 ml Mọi BN đều được truyền dịch trong quá trình lấy tủy xương như huyết thanh mặn 0,9% hoặc Hes 6% Qua theo dõi trong và sau khi lấy tủy
Trang 4xương, không gặp trường hợp nào bị tai
biến như sốc hay tụt huyết áp
Ở 126 BN trong nghiên cứu này cho
thấy số lượng tế bào có nhân trong dịch tủy
xương trước tách là 18,53 5,65 G/L, MNC chiếm 39,88 5,94%, số lượng hồng cầu
và lượng huyết sắc tố lần lượt là 3,86
0,48 triệu/l, 117,76 13,87 g/l
Bảng 3: Tỷ lệ và số lượng tuyệt đối tế bào CD34+ trong dịch tủy trước tách ở BN nghiên
cứu (n = 126)
vÞ
Gi¸ trÞ thÊp nhÊt
Gi¸ trÞ cao nhÊt
Gi¸ trÞ
Tỷ lệ tế bào CD34 +
Bảng 4: Các chỉ số tế bào của khối TBG tách ở BN nghiên cứu (n = 126)
thÊp nhÊt
Gi¸ trÞ cao nhÊt
Gi¸ trÞ
Dịch tủy xương được tách thành phần
tế bào đơn nhân bằng cách ly tâm theo
gradient tỷ trọng sử dụng dung dịch ficoll
Trong 32,19 ± 5,62 ml khối TBG tủy xương
sau khi tách bằng phương pháp ly tâm theo
tỷ trọng tế bào và cô đặc, số lượng tế bào
có nhân là 49,08 30,79 g/l, tế bào đơn
nhân chiếm đa số (57,38 13,86%) Kết
quả của chúng tôi tương tự nghiên cứu của
Nguyễn Mạnh Khánh [2] ở 65 BN CLX,
KG thân xương chày, sau khi tách và cô đặc
khối TBG tủy xương, số lượng tế bào có nhân trung bình 44,5 ± 26,0 g/l, số lượng tế bào đơn nhân trong khối trung bình 25,0 ± 14,6 g/l Nhiều tác giả khác cho rằng nên tách và cô đặc tủy xương trước khi ghép để loại bỏ những tế bào không cần thiết cho quá trình liền xương cũng như làm tăng mật
độ TBG tạo xương trong dịch ghép Kết quả này cho thấy hiệu quả của việc tách khối khối TBG tủy xương, đã loại được những tế bào không cần thiết do các TBG nằm trong khối tế bào đơn nhân này
Bảng 5: Tỷ lệ và số lượng tuyệt đối tế
bào CD34+ trong khối TBG ở BN nghiên
cứu (n = 126)
ChØ sè Ьn
vÞ
Gi¸ trÞ thÊp nhÊt
Gi¸ trÞ cao nhÊt
Gi¸ trÞ trung b×nh
SD
Trang 5Số lượng tế
6
Số lượng tế
trong khối TBG
Tỷ lệ tế bào CD 34+ trong khối TBG tách
bằng phương pháp ly tâm theo tỷ trọng tế
bào là 1,22 0,65% Nghiên cứu 65 BN CLX,
KG thân xương chày, một số tác giả thấy
tỷ lệ tế bào CD34+
trung bình 1,3 ± 0,5%
(0,3 - 3,1%) Nồng độ tế bào CD34+/ml khối
TBG tủy xương là 0,5 ± 0,2 g/l Tổng số
lượng tế bào CD34+ khối TBG trung bình
13,8 ± 5,3 x 106
Bảng 6: Tỷ lệ loại bỏ các tế bào bạch
cầu hạt (GRAN), hồng cầu, huyết sắc tố và
tiểu cầu ở BN nghiên cứu (n = 126)
ChØ sè Ьn
vÞ
Gi¸ trÞ thÊp nhÊt
Gi¸ trÞ cao nhÊt
Gi¸ trÞ trung b×nh
SD
Tỷ lệ loại
Tỷ lệ loại hồng
Tỷ lệ loại huyết
Tỷ lệ loại tiểu
Khi tách bằng phương pháp ly tâm theo
tỷ trọng tế bào, tỷ lệ loại bỏ bạch cầu hạt
(GRAN) là 80,83 13,49% Đây là những
thành phần không cần thiết trong khối TBG
Như vậy, tỷ lệ loại bỏ các thành phần trên
tương đối cao
Bảng 7: Tỷ lệ giữ lại tế bào CD 34+ ở BN
nghiên cứu (n = 126)
ChØ sè Ьn
vÞ
Gi¸ trÞ thÊp nhÊt
Gi¸ trÞ cao nhÊt
Gi¸ trÞ trung b×nh SD
12,05
3,15
Tỷ lệ giữ lại tế bào MNC khi tách TBG từ dịch tủy xương bằng phương pháp ly tâm theo tỷ trọng tế bào là 34,89 12,05%
Kết quả này phù hợp với nghiên cứu của Nguyễn Mạnh Khánh [2]: tỷ lệ % tế bào CD34+ trong khối TBG tủy xương sau khi tách tăng gấp hơn 2 lần so với trước
khi tách (trước tách 0,6 ± 0,2%, sau tách 1,3 ± 0,5%)
Connolly (1989) [4] đánh giá hiệu quả tạo xương khi ghép tủy xương đơn thuần
và tủy xương cô đặc đã qua ly tâm vào khoang phúc mạc và ổ chậm liền xương
Với cùng một thể tích ghép, kết quả cho thấy quá trình tạo xương được thúc đẩy khi ghép tủy xương đã qua ly tâm, nhưng không xảy ra khi ghép tủy xương chưa qua
xử lý Tại các khoang được ghép tủy xương, sau ly tâm, mức độ canxi lắng đọng nhiều hơn so với ghép tủy toàn bộ (193%
so với 101%) Tại ổ gãy chậm liền xương, tạo xương tốt hơn cả về mặt hoá sinh và cơ học Trên phim X quang 5 tuần sau ghép, quá trình liền xương cải thiện rõ rệt ở nhóm được ghép tủy xương đã qua ly tâm Theo tác giả, sự khác biệt này do sau khi ly tâm mật độ TBG trong tủy xương ghép tăng lên khiến quá trình tạo xương mới được cải thiện hơn
KẾT LUẬN
Qua nghiên cứu quy trình thu gom, chiết tách khối TBG từ dịch tủy xương bằng phương pháp ly tâm theo tỷ trọng tế bào ở
126 BN tổn thương xương, khớp khó hồi phục, chúng tôi rút ra một số kết luận sau:
Trang 6- Thể tích khối TBG tủy xương thu được
32,19 ± 5,62 ml, số lượng tế bào có nhân
49,08 ± 30,79 g/l, trong đó tế bào đơn nhân
chiếm đa số (57,38 ± 13,86%)
- Tỷ lệ tế bào CD 34+ của khối TBG tủy
xương là 1,22 ± 0,65%, số lượng tế bào
gốc CD 34+
là 16,98 ± 9,89 g/l
- Tỷ lệ giữ tế bào đơn nhân và tế bào
CD 34+ tương ứng là 34,89 ± 12,05% và
55,96 ± 30,46%; sau chiết tách, đậm độ tế
bào CD 34+ tăng 5,67 ± 3,15 lần
- Tỷ lệ loại bỏ bạch cầu hạt, hồng cầu,
huyết sắc tố và tiểu cầu lần lượt là 80,83
13,49%, 99,60 ± 0,48%, 99,32 ± 0,41% và
52,79 40,68%
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1 Nguyễn Thị Thu Hà TBG và khả năng sử
dụng TBG trong điều trị Y học Việt Nam số đặc
biệt, 2004, 302 (9), tr.3-20
2 Nguyễn Mạnh Khánh Nghiên cứu ứng
dụng ghép TBG tủy xương tự thân điều trị CLX,
KG thân xương chày Luận án Tiến sỹ Y học
2010
3 Brazelton T, Rossi FM, Keshet GI, Blau
HM From marrow to brain: expression of
neuronal phenotypes in adult mice Science
2000, 290, pp.1775-1779
4 Connolly JF, Guse R, Lippiello L, Dehne
R Development of an osteogenic bone marrow
preparation J Bone Joint Surg 1989, 71A,
pp.684-691
5 Edelberg JM, Tang L, Hattori K, Lyden D,
Rafii S Young adult bone marrowderived
endothelial precursor cells restore
aging-impaired cardiac angiogenic function Circ Res
2002, 90, E89-E93
6 Grant MB, May WS, Caballero S et al
Adult hematopoietic stem cells provide functional
hemangioblast activity during retinal neovascularization
Nat Med 2002, 8, pp.607-612
7 Healey JH, Zimmerman PA, McDonnell
JM, Lane JM Percutaneous bone marrow
grafting of delayed union and nonunion in cancer patients Clin Orthop 1990, 256, pp.280-285
8 Hernigou P, Mathieu G., Poignard A, Manicom O, Beaujean F, Rourd H Percutaneous
autologous bone-marrow grafting for nonunions Surgical technique J Bone Joint Surg 2006, 88A, Suppl 1, pp.322-327