Nội dung bài viết với mục tiêu xác định hàm lượng polyphenol toàn phần có trong các loại rau củ quả: Cà chua, cà rốt, cần tây, khổ qua và ớt chuông có trong bài thuốc làm đẹp da phổ biến trong dân gian hiện nay.
Trang 1XÁC ĐỊNH HỢP CHẤT POLYPHENOL TOÀN PHẦN
CÓ TRONG MỘT SỐ LOẠI RAU QUẢ CÓ TÁC DỤNG LÀM MỊN DA BẰNG
PHƯƠNG PHÁP FOLIN-CIOCALTEU
Giang Thị Phương Anh*, Phan Thanh Dũng*, Võ Thị Bạch Huệ*
TÓM TẮT
Mục đích: Xác định hàm lượng polyphenol toàn phần có trong các loại rau củ quả: cà chua, cà rốt, cần tây,
khổ qua và ớt chuông có trong bài thuốc làm đẹp da phổ biến trong dân gian hiện nay
Đối tượng và phương pháp nghiên cứu: Các loại rau, củ, quả như cà chua, cà rốt, cần tây, khổ qua và ớt
chuông được khảo sát sơ bộ thành phần hóa thực vật; định lượng polyphenol toàn phần bằng phương pháp Folin-Ciocalteu
Kết quả và bàn luận: Kết quả khảo sát cho thấy: Có nhiều carotenoid trong cà chua và cà rốt Trong dịch
chiết nước và dịch chiết cồn có sự hiện diện của hợp chất polyphenol Trong dịch chiết cồn ngoài sự hiện diện của proanthocyanidin còn có flavonoid.Đã khảo sát được điều kiện tối ưu để chiết xuất và xây dựng được phương pháp xác định hàm lượng polyphenol toàn phần, trong cà chua, cà rốt, cần tây, khổ qua và ớt chuông Kết quả thẩm định qui trình cho thấy phương pháp định lượng có độ lặp lại và đô chính xác cao (RSD < 4%); tỉ lệ phục hồi nằm trong giới hạn cho phép (85% - 110%)
Kết luận: Đã xây dựng thành công qui trình định lượng polyphenol toàn phần có trong một số loại rau củ
quả bằng phương pháp Folin Ciocalteu Qui trình định lượng được thẩm định và áp dụng thành công trên một
số loại rau củ quả như cà chua, khổ qua, ớt chuông, cần tây
Từ khóa: Folin Ciocalteu, ớt chuông, cà rốt, cà chua, khổ qua, cần tây
ABSTRACT
DETERMINATION OF TOTAL POLYPHENOL IN SOME VEGETABLES, TUBERS AND FRUITS
FOLIN-CIOCALTEU METHOD
Giang Thị Phương Anh, Phan Thanh Dung, Vo Thi Bach Hue
* Y Hoc TP Ho Chi Minh * Vol 18 - Supplement of No 2 - 2014: 193 - 197
Objective: To determination of total polyphenol components of some vegetables, tubers and fruits: tomato,
carrot, celery, green pepper and bitter melon in a popular skin-care medication
Materials and methods: Some vegetables, tubers and fruits such as tomato, carrot, celery, bitter melon and
green pepper were characterized for chemical components and quantification of the total polyphenol compounds
by Folin-Ciocalteu method
Results and disscussion: Preliminary study of plant chemistry found the presence carotenoids in
tomato and carrot The aqueous and ethanol extracts contain polyphenol The ethanol extrac contains
proanthrocyanidine and also flavonoid The optimized conditions for extracting and quantity determination
of total polyphenol compound have been investigated Validation results showed that the quantification method has good repeatability and accuracy with (RSD < 4%); recovery range from (85-110%) which is within acceptable limit
Conclusion: The quantification procedure for determination of total polyphenol in some vegetables, tubers
* Khoa Dược, Đại học Y Dược TP Hồ Chí Minh
Tác giả liên lạc: TS Phan Thanh Dũng ĐT: 0983 957158 Email: dungpharm@yahoo.com
Trang 2and fruits by Folin Ciocalteu method has been established The procedure has been validated and succesfully applied for tomato, bitter melon, green pepper and celery
Key word: Folin Ciocalteu, green peppers, carrot, tomato, bitter melon, celery
ĐẶT VẤN ĐỀ
Để giữ gìn tuổi trẻ và sắc đẹp thì ngoài việc
ăn uống đầy đủ dinh dưỡng, xu hướng hiện nay
của đa số chị em là sử dụng các sản phẩm dưỡng
da, chống lão hóa Trên thị trường hiện nay các
sản phẩm làm đẹp rất đa dạng chủ yếu là các sản
phẩm ngoại nhập Rất khó phân biệt các sản
phẩm thật, sản phẩm giả và cũng rất khó biết rõ
tác dụng phụ của chúng đến đâu Chính vì vậy,
xu hướng làm đẹp da bằng các sản phẩm từ
thiên nhiên đang được thịnh hành Có rất nhiều
bài thuốc dân gian làm đẹp da từ một số rau, củ,
quả phổ biến dễ tìm, dễ chế biến như: dưa leo, cà
chua, cà rốt, sữa chua, mật ong, trà
xanh.v.v…Bài thuốc làm đẹp da phổ biến hiện
nay gồm hỗn hợp các loại rau, củ, quả: cà chua,
cà rốt, cần tây, khổ qua và ớt chuông Đề tài này
góp phần làm sáng tỏ thành phần hóa học của
các loại rau củ quả có trong bài thuốc
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Đối tượng
Dịch chiết cồn từ 5 loại rau, củ, quả: cà chua,
cà rốt, cần tây, ớt chuông và khổ qua thu mua tại
Đà Lạt
Chất đối chiếu: Pyrogallol 98,00%, Fluka,
lot 1273740, Vitamin C 99,56%,
Sanofi-Synthelabo VN (chuẩn làm việc, số kiểm soát:
100256-WS), Acid gallic 99,00%, Trung Quốc
Trang thiết bị
Máy quang phổ UV-Vis Shimadzu 2550 với phần mềm UVProbe V 1,11 (Japan)
Phương pháp nghiên cứu
Khảo sát sơ bộ thành phần hóa thực vật(3,9): Chiết các chất có trong nguyên liệu thực vật thành 3 phân đoạn có độ phân cực tăng dần lần lượt với các dung môi: ether ethylic, ethanol (hay methanol) và nước Xác định các nhóm hợp chất trong từng dịch chiết bằng các phản ứng đặc trưng
Định lượng hợp chất phenol toàn phần bằng phương pháp Folin-Ciocalteu(1,5,6,7,10): dựa trên
sự khử của tungstat/molybdat trong thuốc thử Folin-Ciocalteu bởi hợp chất phenol/môi trường kiềm tạo ra sản phẩm có màu, đo độ hấp thu ở bước sóng cực đại của sản phẩm thu được (phương pháp quang phổ)
Thăm dò các điều kiện tối ưu để định lượng: tiến hành xác định độ ổn định của thuốc thử Folin Ciocalteu 1/10 và dung dịch natri carbonat 7,5% Xác định bước sóng hấp thu cực đại của các dung dịch thử nghiệm Xác định độ ổn định hấp thu quang của các dung dịch thử nghiệm Khảo sát chiết xuất ở nhiệt độ phòng và ở 40 oC Xác định thời gian siêu âm để chiết hoàn toàn hợp chất polyphenol trong mẫu thử
Xây dựng qui trình, thẩm định quy trình phân tích(2,4)
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
Khảo sát sơ bộ thành phần hóa thực vật (3,9)
Bảng 1: Khảo sát sơ bộ thành phần hóa thực vật
Dược liệu
Dịch chiết ether
Dịch chiết cồn
Flavonoid γ-pyron
Anthocyanosid
Proanthocyanidin
+++
- ++
+++
- +++
-
- +
-
- +
-
- +
Trang 3Dược liệu
Dịch chiết nước
Ghi chú: (+): phản ứng có màu nhạt; (++): phản ứng có màu rõ; (+++): phản ứng có màu rất rõ; (-): phản ứng âm tính
Kết quả khảo sát cho thấy trong dịch chiết
ether có nhiều carotenoid trong cà chua và cà
rốt Trong dịch chiết nước và dịch chiết cồn có
sự hiện diện của hợp chất flavonoid và hợp
chất polyphenol Trong dịch chiết cồn ngoài sự
hiện diện của proanthocyanidin như dịch chiết
nước còn có flavonoid cấu trúc pyron
Định lượng hợp chất phenol toàn phần-
phương pháp Folin-Ciocalteu
Xác định dung môi chiết
Qua khảo sát sơ bộ thành phần hóa thực vật
dung môi để chiết hợp chất phenol trong các
nguyên liệu sẽ là cồn vì chiết được nhiều hợp
chất hơn so với nước
Khảo sát nhiệt độ và thời gian siêu âm
Tiến hành khảo sát thời gian siêu âm từ 5- 60
phút và nhiệt độ từ 30 đến 45 0C Kết quả cho
thấy nhiệt độ chiết xuất tối ưu là 400 C và thời
gian siêu âm tối ưu là 5 phút
Khảo sát thời gian ổn định phản ứng màu
Tiến hành khảo sát thời gian ổn định phản ứng màu từ 0-120 phút Kết quả cho thấy, thời gian tối ưu từ 30-40 phút
Khảo sát bước sóng hấp thu cực đại Bảng 2: Kết quả khảo sát bước sóng hấp thu cực đại
Acid gallic Pyrogallol Cà chua Cà rốt
(λmax /nm) 758 752 760 768
Cần tây Khổ qua Ớt chuông (λmax /nm) 746 748 753
Điều kiện tối ưu để định lượng
Tiến hành khảo sát phương pháp chiết xuất, thời gian chiết, nhiệt độ chiết xuất, thời gian ổn định màu của phản ứng và bước sóng hấp thu cực đại của các nguyên liệu kết quả cho thấy
điều kiện định lượng tối ưu như sau:
- Mẫu được chiết với dung môi là cồn 50% bằng phương pháp siêu âm trong 5 phút Nhiệt
độ chiết xuất: 40 oC Thời gian ổn định phản ứng màu: 30 - 40 phút Đo quang ở bước sóng hấp thu cực đại: 750 nm
Kết quả thẩm định quy trình
Bảng 3: Tương quan tuyến tính giữa nồng độ và độ hấp thu
Chuẩn gallic 0,01 - 0,1 0,9998 Ŷ = 10,3955 X + 0,0108 Chuẩn pyrogallol 0,01 - 0,1 0,9990 Ŷ = 13,721 X
Cà chua 60 - 600 0,9963 Ŷ = 1,5083X + 0,066
Cà rốt 60 - 600 0,9930 Ŷ = 0,5049 X + 0,0285 Cần tây 120 - 1200 0,9937 Ŷ = 0,5936 X + 0,0296 Khổ qua 60 - 600 0,9919 Ŷ = 1,379 X + 0,1545
Ớt chuông 20 - 200 0,9974 Ŷ = 0,8697 X + 0,0622
⇒ Có sự tương quan chặt chẽ giữa nồng độ và độ hấp thu
Bảng 4: Kết quả khảo sát độ đúng
Khoảng tin cậy 95% (n=5)
Cà chua 89,72 94,53 99,66 103,71 102,24 93,78
Cà rốt 94,00 91,26 98,63 86,04 89,28 91,91 Cần tây 89,74 89,12 92,74 92,83 92,79 91,37
Trang 4Khoảng tin cậy 95% (n=5)
Khổ qua 108,51 108,50 108,99 103,72 106,45 102,14
Ớt chuông 101,10 98,11 95,84 94,74 89,27 90,33
Tỉ lệ phục hồi nằm trong giới hạn cho phép 85% - 110%
Bảng 5: Kết quả khảo sát độ lặp lại
RSD% (n=5)
Ớt chuông 2,4 3,1 3,9 2,9 3,2 2,9
Độ lặp lại nằm trong giới hạn cho phép ≤ 4%
Bảng 6: Kết quả độ lặp lại cùng ngày và khác ngày
Hợp chất phenol toàn phần /100 g nguyên liệu tươi tính theo mg chuẩn gallic và pyrogallon (khoảng tin cậy 95%)
Cà chua 27,99 (1,0%) 25,15 (2,4%) 17,61 (1,0%) 15,87 (2,4%)
Cà rốt 21,07 (2,8%) 22,58 (3,1%) 13,26 (2,8%) 14,25 (3,1%) Cần tây 9,41 (2,1%) 9,27 (2,0%) 6,00 (2,1%) 5,87 (2,0%) Khổ qua 22,58 (2,5%) 23,71 (1,1%) 14,21(2,5%) 14,96 (1,1%)
Ớt chuông 56,51 (1,6%) 51,99 (2,7%) 35,56 (1,6%) 32,81 (2,7%)
Phương pháp có độ lặp lại trên nguyên liệu
tốt % RSD ≤ 4%
Quy trình định lượng
- Dung dịch chuẩn: Cân chính xác khoảng 25
mg acid gallic hoặc 25 mg pyrogallol vào bình
định mức 50 ml Thêm 30 ml dung dịch cồn 50%,
siêu âm để tan hoàn toàn Để nguội, thêm dung
dịch cồn 50% đến vạch Đảo đều, được dung
dịch có nồng độ 0,5 mg/ml (dung dịch S), bảo
quản tránh ánh sáng
- Dung dịch thử: Cân 15 g (cà chua, cà rốt, khổ qua); 30 g cần tây vào cốc thủy tinh 100 ml, thêm cồn 50% (lần 1-10 ml, lần 2-5 ml) và 5 g ớt chuông vào cốc thủy tinh 100 ml, thêm cồn 50% (lần 1-10 ml, lần 2-10 ml) Siêu âm trong 5 phút ở
40 oC với cường độ 100% Gạn dịch chiết Gộp tất
cả dịch chiết, để nguội, lọc qua giấy lọc, loại bỏ 2
ml dịch lọc đầu, được các dung dịch thử (dung dịch T), bảo quản tránh ánh sáng
Bảng 7: Bảng thực hiện phản ứng xác định hợp chất phenol toàn phần
Lắc rung để đồng nhất hỗn hợp Để yên 5 phút trong tối ở nhiệt độ phòng
Dung dịch Na2CO3 7,5 % Điền đầy đến vạch 10 ml Đảo đều
Lắc rung để đồng nhất hỗn hợp Để yên trong tối 30 phút ở nhiệt độ phòng
Đo hấp thu quang ở 750 nm
Công thức tính lượng hợp chất phenol toàn phần/ 100 g nguyên liệu tươi theo chuẩn gallic
Trang 5hay pyrogallol (mg):
t
t
m A
f C m A X
S
S S
×
×
×
×
×
At, AS: độ hấp thu quang của thử và chuẩn,
mS:khối lượng chuẩn (mg), CS: hàm lượng
chuẩn tinh khiết (số mg chuẩn tinh khiết có trong 100 mg nguyên liệu) mt: khối lượng thử (g), f: hệ số pha loãng (f = 0,03 đối với cà chua, khổ qua và cần tây; f = 0,04 đối với nguyên liệu
cà rốt và ớt chuông)
Kết quả xác định hợp chất phenol toàn phần trong nguyên liệu
Bảng 8: Kết quả xác định hợp chất phenol toàn phần (n = 6)
Hợp chất phenol toàn phần/100 g nguyên liệu tươi được tính theo mg chuẩn
Cà chua 28,29 ± 0,30 (1,0%) 17,70 ± 0,19 (1,0%)
Cà rốt 21,29 ± 0,62 (2,8%) 13,32 ± 0,39 (2,8%)
Cần tây 9,41 ± 0,21 (2,1%) 6,00 ± 0,14 (2,1%)
Khổ qua 22,83 ± 0,60 (2,5%) 14,28 ± 0,38 (2,5%)
Ớt chuông 57,12 ± 0,93 (1,6%) 35,73 ± 0,68 (1,6%)
KẾT LUẬN
Đề tài đã khảo sát được sơ bộ thành phần
hóa học trong các dược liệu cà chua, cà rốt, cần
tây, khổ qua và ớt chuông Kết quả khảo sát cho
thấy Có nhiều carotenoid trong cà chua và cà
rốt Trong dịch chiết nước và dịch chiết cồn có sự
hiện diện của hợp chất flavonoid và hợp chất
polyphenol Trong dịch chiết cồn ngoài sự hiện
diện của proanthocyanidin còn có flavonoid
- Đã khảo sát được điều kiện tối ưu để
chiết xuất và xây dựng được phương pháp xác
định hàm lượng hợp chất phenol toàn phần,
trong cà chua, cà rốt, cần tây, khổ qua và ớt
chuông Kết quả thẩm định qui trình cho thấy
phương pháp định lượng có độ lặp lại và đô
chính xác cao; tỉ lệ phục hồi nằm trong giới
hạn cho phép 85% - 110%
Áp dụng qui trình đã thẩm định xác định
hàm lượng hợp chất polyphenol toàn phần,
trong cà chua, cà rốt, cần tây, khổ qua và ớt
chuông
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1 Doss A, Pugalenthi M, Rajendrakumaran D and Vadivel V
(2010), Phenols, flavonoids and antioxidant activity of
under-utilized legume seeds, Asian J.Exp SCI 1(3): 700-705
2 AOAC Guidelines for Single Laboratory (2002), Validation of Chemical Methods for Dietary Supplements and Botanicals,
pp 13-22
3 Bộ môn Dược Liệu (2008), Phương pháp nghiên cứu dược liệu, Đại học Y Dược TP HCM, 26-42
4 Ermer J, McB Miller JH (2004), Method Validation in Pharmaceutical Analysis, A Guide to best Practice, Wiley-VCH p 418
5 Antolovich M et al (2002), “Methods for testing antioxidant activity”, Analyst 127 (1): 183-198
6 Turkmen T et al (2007),“Effect of extraction conditions on measured Total Polyphenol contents and Antioxidant and antibacterial activities of Black tea”, Molecules 12: 484-496
7 Pham Thanh Quan, Tong Van Hang, Nguyen Hai Ha, Nguyen Xuan De, Truong Ngoc Tuyen (2006), “Microwave-assisted extraction of polyphenols from fresh tea shoot”, tạp chí phát triển KH&CN 9:70
8 Burda S and Oleszek W (2001), “Antioxidant and antiradical activities of flavonoids”, J Agric Food Chem 49 (6):2774-2779
9 Trương Văn Thiện (2008), Tổng hợp và khảo sát tác dụng chống oxy hoá in vitro của các dẫn chất Chrysin, luận văn Dược sỹ đại học, Khoa Dược - Đại học Y Dược Tp HCM
10 Zhang Z, Jin J, Shi L (2008), Antioxidant activities of the derivaties of polysaccharide extracted from a Chinese medical herb (Ramulus mori), Food Sci.Technol 14: 160-168
Ngày nhận bài báo: 10.12.2012 Ngày phản biện nhận xét bài báo: 24.12.2013 Ngày bài báo được đăng: 10.03.2014