Mục tiêu: sàng lọc phát hiện kháng thể kháng HLA trong huyết thanh bệnh nhân nhận thận ghép bằng kỹ thuật hấp phụ miễn dịch vi hạt đánh dấu huỳnh quang và đánh giá hiệu quả định danh kháng thể kháng HLA trong huyết thanh bệnh nhân suy thận mạn dự kiến ghép thận bằng kỹ thuật hấp phụ miễn dịch vi hạt đánh dấu huỳnh quang.
Trang 1NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG KỸ THUẬT HẤP PHỤ MIỄN DỊCH
VI HẠT ĐÁNH DẤU HUỲNH QUANG PHÁT HIỆN KHÁNG THỂ
KHÁNG HLA TRONG HUYẾT THANH BỆNH NHÂN SUY THẬN
MẠN TÍNH DỰ KIẾN GHÉP THẬN
Đỗ Khắc Đại 1 ; Nguyễn Ngọc Tuấn 1
Hoàng Trung Kiên 1 ; Nguyễn Đặng Dũng 1
TÓM TẮT
Mục tiêu: sàng lọc phát hiện kháng thể kháng HLA trong huyết thanh bệnh nhân nhận thận
ghép bằng kỹ thuật hấp phụ miễn dịch vi hạt đánh dấu huỳnh quang và đánh giá hiệu quả định
danh kháng thể kháng HLA trong huyết thanh bệnh nhân suy thận mạn dự kiến ghép thận bằng
kỹ thuật hấp phụ miễn dịch vi hạt đánh dấu huỳnh quang Đối tượng và phương pháp: sử dụng
2 bộ kít sàng lọc và định danh kháng thể kháng HLA trên 55 mẫu huyết thanh được thu thập từ
55 bệnh nhân suy thận và phân tích bằng kỹ thuật hấp phụ miễn dịch vi hạt đánh dấu huỳnh
quang trên hệ thống Luminex 200 tại Bộ môn Miễn dịch, Học viện Quân y Kết quả: 27/55 mẫu
huyết thanh (49,09%) có kháng thể kháng HLA dương tính, trong đó dương tính với lớp I + lớp
II chiếm tỷ lệ cao nhất (44.44%) Định danh được 17 loại kháng thể kháng HLA-A; 31 loại kháng
thể kháng HLA-B và 22 loại kháng thể kháng HLA lớp II Kết luận: đã ứng dụng thành công kỹ
thuật hấp phụ miễn dịch vi hạt đánh dấu huỳnh quang trong xét nghiệm sàng lọc và định danh
kháng thể kháng HLA trong huyết thanh của bệnh nhân suy thận mạn tính dự kiến ghép thận
* Từ khoá: Suy thận mạn tính (dự kiến ghép thận); Phát hiện kháng thể kháng HLA; Kỹ thuật
hấp phụ miễn dịch vi hạt đánh dấu huỳnh quang
Application of Fluorescence Covalent Microbead Immunosorbent
Assay in Detection of Anti-HLA Antibodies in Recipient Candidates
for Kidney Transplant
Summary
Objectives: Anti-HLA antibodies in serum of kidney transplant recipients may significantly be
involved in antibody-mediated graft rejection Identification of the antibodies before kidney
transplant in these patients, therefore, helps clinicians to better manage the patients both pre-and post-transplant The aims of the present study are to screen and to identify anti-HLA
antibodies in serum of recipient candidates for kidney transplant at 103 Military Hospital
Subjects and methods: A fluorescence covalent microbead immunosorbent assay test kit, along
with Luminex 200 analyzer, were adopted in the study which allowed screening and identifying
anti-HLA antibodies present in 55 serum samples from 55 recipient candidates for kidney transplant
1 Học viện Quân y
Người phản hồi (Corresponding): Nguyễn Ngọc Tuấn (nguyenngoctuanmd@gmail.com)
Ngày nhận bài: 21/12/2018; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 25/01/2019
Ngày bài báo được đăng: 28/02/2019
Trang 2Results: 27 (out of 55) serum samples (49.09%) were reactive to anti-HLA antibodies; samples simultaneously reactive to anti-HLA class I and class II accounted for 44.4% of total number
of reactive samples HLA class I antibodies identified include 17 anti-HLA-A and 31 anti-HLA-B; for HLA class II antibodies, 22 anti-HLA-DR antibodies were identified Conclusions: Fluorescence covalent microbead immunosorbent assay with Luminex 200 analyzer were effective in screening and identification of anti-HLA antibodies in kidney transplant recipients
* Keywords: Kidney transplant; Recipient candidates for kidney transplant; Anti-HLA antibody; Fluorescence covalent microbead immunosorbent assay
ĐẶT VẤN ĐỀ
Kể từ khi ca ghép thận đầu tiên trên
thế giới thành công năm 1954, ghép thận
đã trở thành phương pháp điều trị tối ưu
nhất đối với bệnh nhân (BN) suy thận
mạn (STM) giai đoạn cuối Tại Việt Nam,
ca ghép thận đầu tiên được thực hiện
thành công tại Bệnh viện Quân y 103 vào
tháng 6 - 1992 Từ đó đến nay, đã có
hàng ngàn BN được ghép thận thành
công tại các trung tâm y tế lớn trên toàn
quốc Một trong những vấn đề quan trọng
nhất trong ghép thận đó là tình trạng đào
thải thận ghép, nguyên nhân do đáp ứng
miễn dịch của cơ thể túc chủ chống lại
mô ghép khác gen Trong đó, phản ứng
đào thải thận ghép tối cấp, cấp tính và
mạn tính qua trung gian kháng thể được
nhiều tác giả công bố [1]
Nhiều phương pháp xét nghiệm phát
hiện kháng thể kháng - kháng nguyên HLA
trước ghép (xét nghiệm tiền mẫn cảm)
được ứng dụng trên lâm sàng nhằm hạn
chế phản ứng đào thải thận ghép tối cấp
và cấp tính qua trung gian kháng thể như
kỹ thuật gây độc tế bào phụ thuộc bổ
thể (CDC); kỹ thuật ELISA và kỹ thuật
hấp phụ miễn dịch vi hạt đánh dấu huỳnh
quang (FCMIA) Trong đó, kỹ thuật FCMIA
là kỹ thuật mới với nhiều ưu điểm nổi bật như có độ nhạy và độ chính xác cao trong việc phát hiện kháng thể kháng lại kháng nguyên HLA so với kỹ thuật CDC và ELISA Tại Học viện Quân y, việc triển khai thành công kỹ thuật này có ý nghĩa thực tiễn rất quan trọng, góp phần hạn chế tối
đa phản ứng đào thải mô ghép trong ghép thận, cũng như theo dõi xuất hiện của kháng thể kháng HLA sau ghép nhằm nâng cao hiệu quả trong chẩn đoán và điều trị cho BN nhận thận ghép Xuất phát từ những phân tích trên, nhóm nghiên cứu tiến hành đề tài này nhằm
mục tiêu: Sàng lọc phát hiện kháng thể
kháng HLA trong huyết thanh bằng kỹ thuật FCMIA và hiệu quả định danh kháng thể kháng HLA ở BN STM tính dự kiến ghép thận
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU
1 Đối tượng và vật liệu nghiên cứu
thanh được thu thập từ 55 BN STM tính
dự kiến ghép thận và có chỉ định ghép
thận tại Bệnh viện Quân y 103
Trang 3* Vật liệu nghiên cứu:
- 2 kít xét nghiệm:
+ Kít xét nghiệm sàng lọc phát hiện
kháng thể kháng HLA (LMX) (Hãng
Immucor, Mỹ)
+ Kít xét nghiệm định danh kháng thể
kháng HLA (ID1 và ID2) (Hãng Immucor, Mỹ)
- Hoá chất và sinh phẩm xét nghiệm:
+ Hỗn hợp với số lượng bằng nhau
các loại hạt từ khác nhau, mỗi loại hạt từ
huỳnh quang được gắn lên bề mặt một
hoặc một số loại kháng nguyên HLA
+ Hỗn hợp kháng thể phát hiện đã gắn
phức hợp huỳnh quang PE
+ Dung dịch pha mẫu, dung dịch pha
sinh phẩm, dung dịch rửa (Hãng Immucor,
Mỹ sản xuất và cung cấp)
+ Hệ thống Luminex 200 và phần mềm
điều khiển đi kèm (Hãng Luminex, Mỹ chế
tạo và cài đặt)
- Vật liệu và thiết bị labô phụ trợ khác
như máy lắc, máy hút chân không, các loại
pipét, đầu pipét, giấy bạc, giấy thấm, nước
cất, ống nghiệm đạt tiêu chuẩn quốc tế
được chính hãng sản xuất cung cấp
2 Phương pháp nghiên cứu
* Phương pháp tách huyết thanh từ
máu toàn phần:
Lấy máu toàn phần số lượng 2 ml cho
vào ống không có chất chống đông, đặt
trong tủ ấm 30 phút ở nhiệt độ 370C để co
cục máu tự nhiên Ly tâm với tốc độ
2.500 rpm trong 20 phút, hút 0,5 ml dịch
nổi màu vàng cho vào ống eppendorf loại
1,5 ml và tiến hành xét nghiệm ngay
* Phương pháp xét nghiệm sàng lọc phát hiện kháng thể kháng HLA bằng kỹ thuật FCMIA:
- Bước 1: tra 12,5 µl mẫu huyết thanh
+ 5 µl hỗn hợp hạt từ mang kháng nguyên HLA (LMX bead) được lấy từ kít LMX vào các giếng xét nghiệm tương ứng
- Bước 2: ủ ở nhiệt độ phòng trên máy
lắc 30 phút (trong buồng tối) Sau thời gian ủ tiến hành rửa plate 3 lần bằng cách cho thêm 100 µl dung dịch rửa vào mỗi giếng Hút cạn dịch trong giếng xét nghiệm bằng hệ thống bơm hút chuyên dụng
- Bước 3: tra vào mỗi giếng xét nghiệm
50 µl kháng thể phát hiện đã gắn chất huỳnh quang PE
- Bước 4: ủ và rửa plate theo chi tiết
mô tả tại bước 2
- Bước 5: tra vào mỗi giếng xét nghiệm
150 µl dung dịch rửa, trộn đều trên máy lắc 30 giây
- Bước 6: đọc và phân tích kết quả trên
hệ thống Luminex 200
* Phương pháp xét nghiệm định danh kháng thể kháng HLA bằng kỹ thuật FCMIA:
- Bước 1: tra 12,5 µl mẫu huyết thanh
+ 5 µl hỗn hợp hạt từ mang kháng nguyên HLA (ID1 và ID2 bead) được lấy
từ kít ID1 và ID2 vào các giếng xét nghiệm tương ứng
- Bước 2: ủ ở nhiệt độ phòng trên máy
lắc 30 phút (trong buồng tối) Sau thời gian ủ, tiến hành rửa plate 3 lần bằng cách cho thêm 100 µl dung dịch rửa vào mỗi giếng Hút cạn dịch trong giếng xét nghiệm bằng hệ thống bơm hút chuyên dụng
Trang 4- Bước 3: tra vào mỗi giếng xét nghiệm
50 µl kháng thể phát hiện đã gắn chất
huỳnh quang PE
- Bước 4: ủ và rửa plate theo chi tiết
mô tả tại bước 2
- Bước 5: tra vào mỗi giếng xét nghiệm
150 µl dung dịch rửa, trộn đều trên máy
lắc 30 giây
- Bước 6: đọc và phân tích kết quả trên
hệ thống Luminex 200
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ
BÀN LUẬN
* Kết quả sàng lọc phát hiện kháng thể
kháng HLA (n = 55):
Dương tính: 27 BN (49,09%); âm tính:
28 BN (50,91%) Theo Bùi Văn Mạnh và
CS (2009), tỷ lệ này là 69,2% [2], của
Yamamoto và CS (2014) là 39,4% [3]
Kết quả thu được khác nhau phụ thuộc
vào đối tượng nghiên cứu, cỡ mẫu
nghiên cứu Đặc biệt là phương pháp xét
nghiệm phát hiện kháng thể kháng HLA
Bùi Văn Mạnh và CS nghiên cứu trên cỡ
mẫu nhỏ hơn (n = 39) so với nghiên cứu
của chúng tôi và Yamamoto Chúng tôi
nghiên cứu trên cỡ mẫu lớn hơn (n = 55);
đối tượng nghiên cứu là BN suy thận có
chỉ định ghép thận và sử dụng kỹ thuật
FCMIA để phát hiện kháng thể kháng HLA
* Kết quả sàng lọc phát hiện kháng thể
kháng HLA theo lớp kháng nguyên HLA:
Dương tính với lớp I: 8 BN (29,63%);
dương tính với lớp II: 7 BN (25,93%);
dương tính với lớp I + lớp II: 12 BN
(44,44%)
Trên các mẫu có kháng thể kháng HLA
dương tính, nhóm có kháng thể kháng HLA
dương tính với cả 2 lớp (lớp I + lớp II) chiếm tỷ lệ cao nhất (44.44%), cao hơn trường hợp chỉ dương tính với 1 lớp Kết quả này có thể giúp các nhà lâm sàng theo dõi điều trị BN sau ghép thận tốt hơn Trường hợp kháng thể kháng HLA dương tính với cả 2 lớp, tiên lượng xấu hơn dương tính với 1 lớp
kháng HLA-A
Số thứ
tự
Kháng thể kháng HLA-A
Tần suất xuất hiện
Tỷ lệ (%)
Đã định danh được 17 loại kháng thể kháng HLA-A Trong đó, chiếm tỷ lệ cao nhất là kháng thể kháng HLA-A*68 (12,20%) và thấp nhất là kháng thể kháng HLA-A*2534 (1,23%)
Trang 5Bảng 2: Kết quả định danh kháng thể kháng HLA-B
Đã định danh được 31 loại kháng thể kháng HLA-B Trong đó chiếm tỷ lệ cao nhất
là kháng thể kháng HLA-B*14 (8,96%) và B*08 (7,46%)
Trang 6Nghiên cứu đã phát hiện một số kháng thể kháng lại các kháng nguyên HLA như A*23, A*25, B*08, B*14… Theo nghiên cứu của Nguyễn Đặng Dũng và CS, những kháng nguyên trên mẫu tế bào thu nhận từ máu cuống rốn chưa thấy xuất hiện [3], chứng tỏ trong cộng đồng người Việt vẫn có người mang kháng nguyên này, nhưng để phát hiện được kháng nguyên hiếm gặp đòi hỏi phải có nghiên cứu với cỡ mẫu lớn hơn và thực hiện trên nhiều khu vực khác nhau mới có thể đưa ra kết luận chính xác
Đã định danh được 22 loại kháng thể kháng HLA lớp II, trong đó chiếm tỷ lệ lớn nhất là HLA-DRB1*10 (14,29%)
12
DRB1
15
DRB3
22
DQB1
Trang 7Bảng 4: Kết quả định danh kháng thể
kháng HLA lớp II theo các nhóm
Số
thứ tự
Kháng thể
kháng HLA lớp II
Số
Đã định danh được 5 nhóm kháng thể
kháng HLA lớp II (HLA-DRB1; HLA-DRB3;
HLA-DRB4; HLA-DRB5 và HLA-DQB1)
Trong đó, chiếm tỷ lệ cao nhất là kháng
thể kháng HLA-DRB1 (48,28%), tiếp theo
là DQB1 (20,68%) và thấp nhất là kháng
thể kháng DRB3 (6,90%)
kháng HLA theo loại kháng thể/mẩu
huyết thanh
Loại kháng thể kháng
HLA/mẫu huyết thanh
Số lượng
Tỷ lệ (%)
Số mẫu huyết thanh có > 6 loại kháng
thể kháng HLA chiếm tỷ lệ cao nhất
(40,76%) Kết quả này có thể do kỹ thuật
FCMIA có độ nhạy cao, có thể định danh
được nhiều loại kháng thể khác nhau
tương ứng với các allen kháng nguyên đã
biết gắn trên hạt từ huỳnh quang Do vậy,
xét nghiệm tiền mẫn cảm trước ghép
bằng kỹ thuật FCMIA giúp sàng lọc và lựa
chọn người cho thận phù hợp nhất, góp phần làm giảm tỷ lệ đào thải thận ghép trên lâm sàng
KẾT LUẬN
Nghiên cứu đã ứng dụng thành công
kỹ thuật FCMIA trong xét nghiệm sàng lọc
và định danh kháng thể kháng HLA trong huyết thanh của BN nhận thận ghép như sau:
- 27/55 BN (49,09%) dương tính với kháng thể kháng HLA, trong đó dương tính với HLA lớp I: 29,63%; lớp II: 25,93%; lớp I và lớp II: 44,44%
- Đã định danh được 17 loại kháng thể kháng HLA-A; 31 loại kháng thể kháng HLA-B và 22 loại kháng thể kháng HLA-DR
và DQ với tần suất xuất hiện cao nhất là kháng thể kháng HLA-A*68; HLA-B*14 và HLA-DRB1*10
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1 Hoàng Mạnh An Những tiến bộ trong
ghép tạng ở Việt Nam Tạp chí Khoa học Công nghệ Việt Nam 2014, số 8, tr.41-43
2 Bùi Văn Mạnh và CS Nghiên cứu lâm
sàng, cận lâm sàng và một số chỉ số miễn dịch
ở BN sau ghép thận Luận án Tiến sỹ Y học Học viện Quân y 2009
3 Nguyễn Đặng Dũng và CS Xây dựng
cơ sở dữ liệu và phần mềm tra cứu HLA của các mẫu tế bào gốc dây rốn được hiến tặng cho Ngân hàng Tế bào gốc Mekostem Tạp chí
Y - Dược học Quân sự 2007, số 7, tr.21-28
4 Yamamoto H, Uchida N, Matsuno N,
Ota H, Kageyama K, Wada et al. Anti-HLA antibodies other than against HLA-A, -B, -DRB1 adversely affect engraftment and nonrelapse mortality in HLA-mismatched single cord blood transplantation: Possible implications of unrecognized donor-specific anti-bodies Biol Blood Marrow Transplant 2014, 20 (10), pp.1634-1640 doi:10.1016/j bbmt 2014.06.024.