Trong công trình nghiên cứu của bài viết này, VK L. monocytogenes sau khi được ly giải bằng phương pháp hóa học trên màng nitrocellulose, đã phát hiện bằng phức hợp kháng thể đơn dòng với hạt nano vàng (biodesign) hoặc phức hợp kháng thể đơn dòng với các chấm lượng tử (tự gắn). Đây là một phương pháp sử dụng vật liệu mới để phát hiện vi khuẩn.
Trang 1ỨNG DỤNG PHỨC HỢP HẠT NANO-KHÁNG THỂ ĐƠN DÒNG PHÁT HIỆN VI KHUẨN LISTERIA MONOCYTOGENES
Lê Thị Hiên*; Vũ Xuân Nghĩa**
Phạm Đức Minh**; Nguyễn Năng Định*
TÓM TẮT
Phức hợp của chấm lượng tử CdSe/ZnS với kháng thể đơn dòng (KTĐD) được tạo ra để ứng dụng phát hiện vi khuẩn (VK) L monocytogenes, sau khi các tế bào này được ly giải bằng phương pháp hóa học trên màng nitrocellulose Bên cạnh đó, sản phẩm thương mại phức hợp hạt nano vàng với kháng thể đơn dòng được sử dụng để so sánh khả năng phát hiện L monno Kết quả cho thấy, phức hợp KTĐD-chấn lượng tử được tạo ra có kích thước tương ứng 10 nm có khả năng phát hiện
L mono ở nồng độ VK ly giải trên màng cellulose từ 105
- 106 cfu/ml
* Từ khóa: L monocytogenes; Kháng thể đơn dòng; Phức hợp hạt nano
Application of monoclonal antibody-conjugated nanoparticles for detection of bacteria
Listeria monocytogenes
summary
The monoclonal antibody-conjugated CdSe/ZnS quantum dots were synthesized for detection of
L monocytogenes after the cell lysis on nitrocellulose membrane In addition, a commercial product - monoclonal antibody-conjugated gold nanoparticles - was used for comparison of these two materials The study broadened the applications of nanomaterials in bioimaging and pathogene detection
* Key words: L monocytogenes; Monoclonal antibody; Nanoparticles
ĐẶT VẤN ĐỀ
Ngộ độc thực phẩm đã và đang là vấn
đề được cộng đồng trên toàn thế giới quan
tâm Nguyên nhân chính gây ra các ca ngộ
độc thực phẩm là do VK như Salmonella,
Escherichia coli, L monocytogenes Trong
đó, số ca tử vong do VK, L monocytogenes
gây ra đứng thứ hai (chỉ sau VK Salmonella)
trong tổng số các ca tử vong do nhiễm
khuẩn từ thực phẩm Khác với các loài gây ngộ độc thực phẩm khác, L monocytogenes
có thể phát triển ngay cả ở 4ºC (khi thực phẩm được giữ trong tủ lạnh) Do đó,
cho con người từ những thực phẩm đông lạnh Mặc dù hiện diện với số lượng nhỏ trong thực phẩm, nhưng khi đi vào cơ thể, chúng không bị đào thải mà tích lũy chờ cơ hội gây bệnh
* Đại học Công nghệ - Đại học Quốc gia Hà Nội
** Học viện Quân y
Chịu trách nhiệm nội dung khoa học: PGS TS Nguyễn TháI Sơn
Trang 2Hiện nay đã có nhiều phương pháp phát
hiện VK L monocytogenes như: nuôi cấy
[1], PCR [2], Western blot [3], ELISA [4],
ELFA [5] Nuôi cấy là phương pháp truyền
thống, mất khá nhiều thời gian và cần có
môi trường tăng sinh và phân lập chọn lọc
cho từng loại VK, nên không phù hợp với
nhu cầu phát hiện nhanh VK trong các mẫu
thực phẩm hoặc chẩn đoán nhanh nguyên
nhân gây ngộ độc thực phẩm cho người
bệnh để có phương pháp điều trị kịp thời
Các phương pháp chẩn đoán phân tử dựa
trên kỹ thuật miễn dịch và kỹ thuật PCR cho
kết quả nhanh hơn và nhạy hơn
Gần đây, công nghệ nano phát triển rất
nhanh tạo ra những vật liệu nano tiên tiến
(vật liệu có kích thước nanomet) mang lại
nhiều ứng dụng to lớn trong lĩnh vực dược
phẩm và y sinh Trong các loại vật liệu nano,
hạt nano vàng và chấm lượng tử (quantum
dots) là hai loại vật liệu nano được nghiên
cứu và ứng dụng rộng rãi nhất Hạt nano
vàng gắn với các phân tử sinh học là một
sản phẩm với rất nhiều ứng dụng trong lĩnh
vực y sinh học, trong chẩn đoán và điều trị
tế bào ung thư, đặc biệt trong công nghệ
chế tạo kit chẩn đoán nhanh các loại bệnh
truyền nhiễm [6] Chấm lượng tử với khả
năng phát huỳnh quang và độ bền màu với
ánh sáng đã vượt qua các chất màu hữu cơ
và trở thành một trong số những vật liệu
sáng giá của công nghệ nano Chấm lượng
tử được sử dụng trong đánh dấu tế bào và
phần tử sinh học, dẫn truyền và phân phối
thuốc, trong các công cụ chẩn đoán mới [7]
Trong công trình nghiên cứu này, VK L
phương pháp hóa học trên màng nitrocellulose,
đã phát hiện bằng phức hợp kháng thể đơn
dòng với hạt nano vàng (biodesign) hoặc phức hợp kháng thể đơn dòng với các chấm lượng tử (tự gắn) Đây là một phương pháp
sử dụng vật liệu mới để phát hiện vi khuẩn
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU
1 Vi khuẩn
Vi khuẩn Listeria monocytogenes ATCC
35152, chủng chuẩn quốc tế, được tăng sinh và bảo quản theo tiêu chuẩn quốc gia tại Bộ môn Vi sinh Y học, Học viện Quân y
VK E coli BL21 (Viện Công nghệ Sinh học,
Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam)
2 Vật liêu
Kháng thể đơn dòng C86030M kháng L mono (Biodesign), kháng thể đơn dòng C86920M kháng L mono gắn hạt nano vàng (Biodesign), albumin huyết thanh bò (BSA) (Biobasic) Chấm lượng tử CdSe/ZnS (Viện Khoa học Vật liêu - Viện Khoa học
và Công nghệ Việt Nam cung cấp) Màng nitrocellulose (0,45 micromet, Whatman) Đệm Blotting 10x (250 mM, 1,92 M Glycine) Đệm Blotting 1x (pha loãng đệm Blotting 10x với methanol và nước theo tỷ lệ thể tích 1:2:7) Đệm TBS 1x (Tris HCl 50 mM; NaCl
100 mM; pH 7,5) Đệm TTBS 1x (0,05% Tween 20 trong đệm TBS 1x) Đệm PBS 1x (100 mM NaH2PO4, 100mM Na2HPO4, 150
mM NaCl pH 7,5)
3 Phương pháp nghiên cứu
* Tạo phức hợp kháng thể đơn dòng với chấm lượng tử:
Gắn chấm lượng tử có nhóm chức amino với kháng thể đơn dòng kháng L mono bằng chất nối bis (3-sulfo-N-hydroxysuccinimide ester) (BS3) (Sigma) Ủ chấm lượng tử 10 mg/ml
Trang 3trong đệm PBS 1x với chất nối BS3 trên
máy lắc trong 30 phút ở nhiệt độ phòng
Ly tâm 5.000 vòng/phút trong 5 phút,
thu tủa, bỏ dịch tan có chứa chất BS3 dư
Thêm 20 µl PBS 1x vào tủa lắc cho tủa
phân tán đều trong đệm Thêm 2 µl kháng
thể (2,8 mg/ml), trộn nhẹ, để một giờ ở
nhiệt độ phòng Ly tâm 5.000 vòng/phút
trong 5 phút Thu dịch nổi để phân tích
lượng kháng thể dư bằng phương pháp
điện di trên gel polyacrylamide (gel tách
12%, gel cô 5%) Thu tủa (phức hợp hạt
nano-kháng thể), phân tán lại trong PBS 1x
và ủ với 3 µg BSA trong 30 phút ở nhiệt độ
phòng Ly tâm thu tủa phân tán lại trong 20
µl PBS và giữ ở 4ºC để sử dụng
* Ly giải VK trên màng nitrocellulose:
Chuẩn bị dung dịch sử dụng để ly giải tế
bào và rót sẵn vào 5 đĩa Petri khác nhau
- Đĩa 1: dung dịch SDS 10%; đĩa 2: dung
dịch biến tính (0,5M NaOH; 1,5M NaCl); đĩa
3:dung dịch trung hòa (1,5M NaCl; 0,5M
Tris HCl pH 7,5); đĩa 4: dung dịch trung hòa
(như đĩa 3); đĩa 5: dung dịch đệm SSC
(0,15 M NaCl, citrate natri 15 mM pH 7,0)
- Thấm dung dịch bằng giấy thấm và để
sẵn trên các đĩa
- Ngâm màng nitrocellulose bằng đệm
blotting 1x ba lần, mỗi lần 5 phút Nhỏ
1 - 5 µl tế bào L monocytogenes lên màng
nitrocellulose Đặt màng lên giấy đã thấm
ướt các dung dịch trong đĩa Petri theo thứ
tự và thời gian Đĩa 1: 10 phút; đĩa 2: 5 phút;
đĩa 3: 5 phút; đĩa 4: 5 phút; đĩa 5: 15 phút
Ly giải xong, để bề mặt màng khô, ngâm
màng bằng sữa tách béo 5% trong TTBS 1x
trên máy lắc trong 2 giờ ở nhiệt độ phòng
Rửa màng bằng TTBS 1x ba lần, mỗi lần
5 phút và TBS 1x ba lần, mỗi lần 5 phút
Hình 1: Hình minh họa phương pháp ly giải
tế bào trên màng nitrocellulose
* Phát hiện VK sau ly giải trên màng nitrocellulose bằng phức hợp kháng thể đơn dòng với hạt nano vàng hoặc với chấm lượng tử:
Nhỏ 1 - 2 µl dung dịch phức hợp hạt nano vàng-kháng thể đơn dòng hoặc phức hợp chấm lượng tử-kháng thể đơn dòng lên
vị trí có tế bào VK L monocytogenes đã ly giải trên màng nitrocellulose Ủ 30 giây ở nhiệt độ phòng Rửa màng bằng TTBS 5 phút
Quan sát và chụp ảnh
Đối với phức hợp chấm lượng tử kháng thể, ánh sáng huỳnh quang đỏ của mẫu được quan sát dưới đèn tử ngoại (UV transluminator 2.000) với bước sóng kích thích 300 nm
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ
BÀN LUẬN
1 Tạo phức hợp kháng thể đơn dòng với chấm lƣợng tử
Theo phân tích hình ảnh bằng kính hiển
vi điện tử quét phân giải cao (FESEM) ban đầu, các chấm lượng tử cụm lại thành hạt
có kích thước khá lớn khoảng 300 nm Sau khi gắn kháng thể, chấm lượng tử tách thành các hạt có kích thước nhỏ hơn rất nhiều, chỉ khoảng 10 nm (hình 2)
Vi khuÈn
Hãa chÊt
Mµng NC GiÊy thÊm
§Üa
Trang 4
Hình 2: Ảnh hiển vi điện tử quét phân giải
cao (FESEM) của chấm lượng tử trước (A)
và sau khi gắn kháng thể (B)
Để đánh giá khả năng gắn kết của kháng
thể với chấm lượng tử, sau phản ứng, ly tâm
thu dịch nổi, phân tích bằng phương pháp điện
di biến tính trên gel polyacrylamide (hình 3)
Hình 3: Hình ảnh gel điện di dịch nổi của
phản ứng gắn kháng thể lên chấm lượng tử
1: Kháng thể đơn dòng C86030M (kháng
thể khi chưa phản ứng với chấm lượng tử
3 vạch với khối lượng phân tử 30 kDa,
50 kDa và 160 kDa, tương ứng với chuỗi nhẹ, chuỗi nặng của kháng thể và kháng thể hoàn chỉnh) 2: Thang protein 3: Dịch nổi của phản ứng gắn kháng thể lên chấm lượng tử
Kết quả cho thấy, trong dịch nổi không còn kháng thể nữa (đường số 3), chứng tỏ kháng thể đã gắn kết hết với chấm lượng tử
và tủa xuống sau ly tâm
2 Phát hiện VK sau ly giải trên màng nitrocellulose bằng phức hợp hạt nano vàng-kháng thể đơn dòng hoặc phức hợp chấm lƣợng tử-kháng thể đơn dòng
Các tế bào VK L monocytogenes được
ly giải bởi hóa chất thấm qua giấy thấm và màng nitrocellulose Sau ly giải, các protein của VK bám vào màng nitrocellulose Phức hợp hạt nano-kháng thể được sử dụng phát hiện các kháng nguyên VK trên màng nitrocellulose Sử dụng đối chứng âm là dịch ly giải của VK E coli (hình 4)
Hình 4: Phát hiện VK L monocytogenes
sau khi ly giải trên màng nitrocellulose dùng phức hợp chấm lượng tử-kháng thể (A) hoặc phức hợp hạt vàng-kháng thể (B) Đối chứng âm là dịch ly giải của VK E.coli
A
B
A
B
10 6 10 6 (cfu/ml)
E coli L.monocytogennes
E coli L.monocytogennes
(kDa) 1 2 3
160
50
30
97
66
43
30
Trang 5Sau khi nhỏ phức hợp chấm lượng
tử-kháng thể đơn dòng tử-kháng L monocytogenes
lên vị trí tế bào L monocytogenes đã bị ly
giải và rửa bằng TTBS, quan sát dưới đèn
tử ngoại thấy các chấm phát huỳnh quang
đỏ Trong khi đó, tại vị trí dịch ly giải VK
lượng tử đã gắn được với kháng thể đơn
dòng kháng L monocytogenes và phức hợp
tạo thành có thể sử dụng để phát hiện đặc
hiệu VK L monocytogenes Nồng độ VK đưa
lên màng là 106 cfu/ml
Tương tự phần trên, phức hợp hạt vàng-
kháng thể đơn dòng kháng L monocytogenes
(biodesign) nhỏ lên màng nitrocellulose
và rửa bằng TTBS Tại vị trí ly giải VK
màu hồng (màu của phức hợp hạt nano
vàng-kháng thể), còn tại vị trí ly giải VK
được nhìn thấy rõ ở nồng độ 106 cfu/ml và
mờ hơn khi ở nồng độ 105 cfu/ml
Như vậy, phức hợp chấm lượng
tử-kháng thể (tự gắn) và sản phẩm thương
mại hạt nano vàng-kháng thể có thể phát
hiện được VK L monocytogenes ở nồng độ
105 - 106 cfu/ml chỉ vài phút sau khi nhỏ
phức hợp hạt nano-kháng thể đơn dòng
kháng L monocytogenes
Các phương pháp Western blot (phát
hiện L monocytogenes ở nồng độ 105
cfu/ml [3]) và phương pháp ELFA (khoảng
phát hiện 104
- 105 cfu/ml [5]) đều sử dụng phản ứng miễn dịch của kháng thể với
kháng nguyên protein màng được phân
tách (Western blot) và tinh sạch (ELFA)
Trong nghiên cứu này, phức hợp hạt nano-kháng thể cho phản ứng miễn dịch với dịch
ly giải tế bào (kháng nguyên chưa được phân
tách) và phát hiện được L monocytogenes
ở nồng độ gần tương đương Điều này cho phép dự đoán, nếu sử dụng kháng nguyên tinh sạch, tín hiệu màu cho bởi hạt nano vàng và chấm lượng tử có thể sẽ tốt hơn nhiều
Như vậy, phương pháp ly giải tế bào trên màng bằng hóa chất khá đơn giản, không cần công đoạn phá tế bào bằng siêu
âm và tinh sạch kháng nguyên protein màng tế bào Nghiên cứu góp phần mở rộng ứng dụng các vật liệu nano trong lĩnh vực đánh dấu sinh học và phát hiện các tác nhân gây bệnh Trong tương lai, phức hợp hạt nano-kháng thể, tương tự như chất màu huỳnh quang hữu cơ sử dụng trong EFLA
để làm tăng độ nhạy, có thể ứng dụng trong phương pháp chẩn đoán phân tử miễn dịch
để thay thế các chất màu hữu cơ
KẾT LUẬN
Vi khuẩn L monocytogenes sau khi được ly giải bằng phương pháp hóa học trên màng nitrocellulose được phát hiện bằng phức hợp kháng thể đơn dòng với hạt nano vàng hoặc phức hợp kháng thể đơn dòng với các chấm lượng tử
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1 Phạm Đức Minh, Vũ Xuân Nghĩa, Lê Thị Hiên, Nguyễn Năng Định Nghiên cứu ứng dụng kháng thể đơn dòng phát hiện VK Listeria monocytogenes Tạp chí Y học Việt Nam 2012, tháng 8, số 1, tr.22-24
Trang 62 Erdogan H.M, Cripps P.J, Morgan K.L
Optimization of a culture technique for the
isolation of Listeria monocytogenes from faecal
samples J Vet Med Infect Dis Vet Public Health
2002, 49 (10), pp.502-506
3 Levin R.E Application of the polymerase
chain reaction for detection of Listeria monocytogenes
in foods: a review of methodology Food Biotechnol
2003, 17, pp.99-116
4 Karamonova L, Blazkova M, Fukal L,
Rauch P, Greifov M, Horakova K, Tomaska M,
Roubal P, Brett G M, Wyatt G M.Development
of an ELISA specific for Listeria monocytogenes
using a polyclonal antibody raised against a cell
extract containing Internalin B Food and
Agricultural mmunology 2003, 15, pp.167-182
5 Sewell A.M, Warburton D.W, Boville A, Daley E.F, Mullen K The development of an
efficient and rapid enzyme linked fluorescent
assay method for the detection of Listeria spp
from foods Int J Food Microbiol 2003, 81, pp.123-129
6 Cai W Chen X Nanoplatforms for targeted
molecular imaging in living subjects Small
2007, 3 pp.1840-1854
7 Zrazhevskiy P, Sena M, Gao X Designing
multifunctional quantum dots for bioimaging, detection and drug delivery Chem Soc Rev
2010, 39 pp.4326-4354
Ngµy nhËn bµi: 18/10/2012 Ngµy giao ph¶n biÖn: 5/1/2013 Ngµy giao b¶n th¶o in: 6/2/2013