Nghiên cứu hóa mô miễn dịch cho kết quả 13% không thể phát hiện sự biểu hiện của pRB, phần còn lại cho thấy có hiện tượng tăng phosphoryl hóa pRB trong nhân của tế bào ung thư gan. Các tế bào lọan sản, tế bào lành tính và tế bào mô đệm có mức độ biểu hiện pRB cao trong nhân, nhưng lại có mức độ biểu hiện thấp đối với dạng phosphoryl hóa của pRB. Sự biểu hiện quá mức (over-expression) và sự phosphoryl hóa của ERK1/2 cũng được phát hiện bởi phương pháp Western blot trong 91% và 69% các trường hợp ung thư tế bào gan được khảo sát.
Trang 112 ĐIỀU HÒA SỰ BIỂU HIỆN CỦA CYCLIN D1, CDK-2
VÀ SỰ PHOSPHORYL HÓA PROTEIN RETINOBLASTOMA
TẠI VỊ TRÍ Ser780 VÀ Ser795 CỦA MEK-ERK TRONG UNG THƯ TẾ BÀO GAN (HCC)
Đỗ Phúc Tiến, Trần Evelyne, Chow Pierce, Tan Puay Hoon, Soo Khee Chee,
Văn Tần and Huỳnh Hùng
TÓM TẮT
Ung thư tế bào gan (HCC) là một trong những lọai ung thư thường gặp ở vùng Đông Nam Á Mặc dù sự bất họat của protein Retinoblastoma p105 (pRB) thường đi kèm với sự tăng trưởng của tế bào, chức năng của nó trong ung thư tế bào gan vẫn chưa được thiết lập Trong nghiên cứu này, sự tăng phosphoryl hóa của pRB tại
vị trí Ser 780 và Ser 795 được phát hiện bởi phương pháp Western blot là 71% và 63% ở các trường hợp ung thư tế bào gan được khảo sát Nghiên cứu hóa mô miễn dịch cho kết quả 13% không thể phát hiện sự biểu hiện của pRB, phần còn lại cho thấy có hiện tượng tăng phosphoryl hóa pRB trong nhân của tế bào ung thư gan Các tế bào lọan sản, tế bào lành tính và tế bào mô đệm có mức độ biểu hiện pRB cao trong nhân, nhưng lại có mức độ biểu hiện thấp đối với dạng phosphoryl hóa của pRB Sự biểu hiện quá mức (over-expression) và sự phosphoryl hóa của ERK1/2 cũng được phát hiện bởi phương pháp Western blot trong 91% và 69% các trường hợp ung thư tế bào gan được khảo sát Một cách tương tự, sự biểu hiện quá mức của E2F-1, Cyclin D1, cdc-2, Cdk-2, Cdk-4 va Cyclin A tương ứng là 64%, 43%, 28%, 71% và 63% các trường hợp HCC được khảo sát Trên
in vitro, điều trị tế bào u gan HepG2 bằng chất ức chế đặc hiệu của MEK1/2 –U0126 dẫn đến làm ức chế sự biểu hiện của protein Cyclin D1, cdc -2 và Cdk-4, và gây ra hiện tượng giảm phosphoryl hóa của pRB tại vị trí Serine780 và 795 Sự biểu hiện quá mức của MEK1 đã được họat hóa trong tế bào HepG2 làm tăng biểu hiện của Cyclin D1 và phosphoryl hóa pRB tại vị trí Serine 780 và 795 Những kết quả này gợi ý rằng, cơ chế MEK-ERK đóng một vai trò rất quan trọng trong việc điều hòa sự biểu hiện của Cyclin D1, Cdc2 và Cdk-2, và sự ức chế gen kiềm hãm sinh ung Retinoblastoma trong ung thư tế bào gan
SUMMARY
REGULATION OF CYCLIN D1, CDK-2 EXPRESSION AND PHOSPHORYLATION RETINOBLASTOMA AT SER780 AND SER795 OF MEK-ERK IN HCC
Do Phuc Tien, Tran Evelyne, Chow Pierce, Tan Puay Hoon, Soo Khee Chee, Van Tan and Huynh Hung * Y Hoc TP Ho Chi Minh * Vol 8 * Supplement of No 1 * 2004: 89 – 96
Hepatocellular carcinoma (HCC) is one of the most common malignancies in South East Asia Although inactivation of retinoblastoma p105 (pRB) is often associated with cellular growth, its function in HCC has not been established In this study we reported that hyperphosphorylation of pRB at Ser780 and Ser795 was detected by Western blot analysis in 71% (33 of 46) and 63% (29 of 46) of HCCs examined respectively Immunohistochemical study revealed that pRB expression was undetectable in 13% (6 of 46) of HCCs examined and hyperphosphorylated pRB was localized in the nuclei of hepatocarcinoma cells Dysplasia or
*1Laboratory of Molecular Endocrinology, Division of Cellular and Molecular Research, National Cancer Centre of Singapore, 2Department of General Surgery, 3Department of Pathology, Singapore General Hospital, Singapore 169610 and 4Department of Surgery, BinhDan Hospital, HoChiMinh City, VietNam
Trang 2benign hepatocytes or stromal cells were strongly positive nuclear staining for pRB but exhibited weak nuclear staining for phosphorylated pRB Over-expression and phosphorylation of ERK1/2 were also detected by Western blot analysis in 91% (42 of 46) and 69% (32 of 46) of HCCs examined, respectively Similarly, over-expression of E2F-1, cyclin D1, Cdk-2, Cdk-4, and cyclin A was found in 64% (30 of 46), 43% (26 of 46), 28% (11 of 46), 71% (33 of 46) and 63% (29 of 46) HCCs studied respectively In vitro treatment of HepG2 with MEK1/2 specific inhibitor U0126 resulted in cell cycle arrest, inhibited expression of cyclin D1, Cdc-2 and
Cdk-2 and caused hypophosphorylation of pRB at Ser780 and Ser795 Over-expression of activated MEK1 in HepG2 increased expression of cyclin D1 and phosphorylation of pRB at Ser780 and Ser795 The results suggest that MEK-ERK pathway plays an important role in regulation of cyclin D1, Cdc-2 and Cdk-2 expression and inactivation of retinoblastoma tumour suppressor gene in hepatocellular carcinoma
DẪN NHẬP
Ung thư tế bào gan (HCC) chiếm khoảng 40%
các trường hợp ung thư ở Đông Nam Á, Nhật Bản và
Châu Phi Tỷ lệ mới mắc hàng năm vào khoảng từ 0
25 đến 1 2 triệu trường hợp1, 2 Bệnh thường đi kèm
với sự tiếp xúc virus Viêm gan siêu vi B, C và
Aflatoxin B11, 2 Tần xuất biểu hiện ở nam gấp 2-5 lần
so với ở nữ Việc điều trị HCC vẫn cho kết quả hạn
chế Phần lớn bệnh nhân bị ung thư tế bào gan nhập
viện ở giai đọan muộn, với tiên lượng rất xấu3 Tỷ lệ
sống sau 5 năm vào khỏang 25-39% sau phẫu thuật 4
Khả năng sống kéo dài rất khó ở bệnh nhân HCC do
ung thư tái phát, di căn hoặc sự xuất hiện của khối u
mới5, 6 Hiện tại vẫn chưa có phương pháp điều trị hỗ
trợ nào có thể kéo dài khả năng sống của bệnh nhân
một cách rõ rệt7
Mặc dù cơ chế phân tử quá trình sinh ung của
HCC vẫn chưa rõ, một vài dấu hiệu cho thấy HCC có
thể là kết quả của quá trình bất họat những gen kiềm
hãm sinh ung (tumour suppressor gene), sự họat hoá
những gen sinh ung và các yếu tố tăng trưởng Người
ta đã xác định hơn 20 gen đã bị họat hóa, bất họat
hay bị đột biến trong HCC 8 Thay đổi của p53, pRB9,
10và những rối lọan chức năng của p16, p21 và p27
dẫn đến tăng phosphoryl hóa pRB đã được báo cáo
trên HCC 11 Gần đây chúng tôi khám phá rằng có sự
tăng biểu hiện IGF-II trên phần lớn mẫu HCC được
khảo sát 12 Phần lớn các gen được đề cập liên quan
đến việc điều hòa con đường dẫn truyền tín hiệu nội
bào và chu trình tế bào
Gen Retinoblastoma (pRB) là một gen kiềm hãm
sinh ung (tumour suppressor gene) mã hóa cho một protein có chức năng quan trọng trong chu trình tế bào13 Protein pRB là một phosphoprotein trong nhân tế bào, có 928 aa và trọng lượng phân tử là 105kDalton, với chức năng bình thường là kiềm hãm sự tăng sinh tế bào nhờ làm giảm khả năng sao chép DNA và ngăn ngừa phân chia tế bào 13-15 Sự gia tăng biểu hiện của protein pRB làm ngưng tăng trưởng
của các tế bào ung thư trên in vitro và in vivo14-16 Sự tái biểu hiện (re-expression) protein pRB ở tế bào ung thư làm ngưng chu trình sao chép tế bào ở pha G0-G117 Tác dụng kiềm hãm tăng trưởng của pRB một phần là nhờ khả năng kết hợp với E2F và histone deacetylase làm giảm họat tính của gen E2F trong chu trình tế bào18, 19 Tăng phosphoryl hóa của pRB bởi những phức hợp Cyclin/cdks làm chu trình tế bào tiếp tục diễn tiến Một vài phức hợp ảnh hưởng đến
sự phosphoryl hóa của pRB trên in vivo, đó là cyclin
D1/cdk-4, Cyclin E/cdk-2 và Cyclin A /cdk-2 Cyclin D1 /cdk-4 thường phosphoryl hóa ở vị trí Serine 78020 và Serine 79521, 22 Trên in vivo, pRB được phosphoryl
hóa ở vị trí Serine 780 không gắn kết với E2F Những đột biến của pRB làm mất khả năng phosphoryl hóa thường có tác dụng ức chế tăng trưởng mạnh hơn
23-25 Một số lớn các gen liên quan đến việc điều hòa chu trình tế bào được điều hòa bởi họat tính của E2F bao gồm Cyclin E, P107 Cyclin A, cdc226
Sự gia tăng hằng dịnh của MEK1 đã được họat hóa (activated MEK1) thường gặp ở các dòng tế bào ung thư27, 28 Sự họat hóa hằng định MEK1 góp phần đến sự sống còn29, dịch chuyển30và sự chuyển dạng tế bào31, 32 Sự họat hóa của ERK điều hòa họat tính
Trang 3của một số các chất, bao gồm yếu tố sao mã p62
(Elk-1), c-myc, ATF2, phức hợp AP-1, c-jun và c-fos
Trong nghiên cứu này, chúng tôi trình bày các
protein được họat hóa ở vị trí Serine780, Serine795
Sự tăng biểu hiện của protein ERK, E2F-1, Cyclin D1,
cdk-2, Cyclin A cũng được khảo sát Việc điều trị dòng
tế bào u gan Hep G2 với chất ức chế MEK1/2- U0126
làm ức chế họat tính MEK-ERK, dẫn đến giảm họat
tính phosphoryl hóa pRB và ức chế sự biểu hiện
Cyclin D1và cdk-2 Sự tăng biểu hiện của MEK1 đã
được họat hóa ở HepG2 cell làm tăng biểu hiện cyclin
D1 và làm phosphoryl hóa pRB ở vị trí Ser 780 và
795 Điều này cho thấy con đường họat hóa
MEK-ERK đóng một vai trò quan trọng trong sự biểu hiện
của protein Cyclin D1, cdk-2, và phosphoryl hóa pRB
trong tế bào ung thư gan
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN
CỨU
Hóa Chất
U0126 và LY294002 được mua từ New England
Biolabs Những thuốc này được hòa tan trong DMSO
với nồng độ cuối cùng không vượt quá 0 1% Chúng
được bảo quản trong điều kiện ít ánh sáng ở -20°C
Các kháng thể dùng trong Hóa mô miễn dịch và
Western blot được mua từ công ty Santa Cruz
Biotechnology và Cell Signalling Technology
Bệnh nhân và bệnh phẩm
Các mẫu bệnh phẩm bao gồm mô bướu và mô
lành kế cận khối u của 46 bệnh nhân điều trị tại Bệnh
Viện Đa Khoa Singapore Bệnh phẩm thu được trong
lúc mổ, đông lạnh trong liquid nitrogen và dự trữ ở
-80°C cho đến khi sử dụng Một phần bệnh phẩm
tương tự được cố định trong formalin 10% và đóng
khối trong paraffin Tất cả các trường hợp ung thư tế
bào gan kể trên đều được xác nhận bởi chẩn đóan giải
phẫu bệnh Dữ kiện lâm sàng của các bệnh nhân
được thu thập từ Bệnh Viện Đa Khoa Singapore và
Trung tâm Ung Thư Quốc Gia Singapore
Hóa mô miễn dịch
Những lát cắt của mô (dày khoảng 5
micromet)trên các tiêu bản (slides) được khử paraffine trong xylene và được tái hấp thu nước trong dung dịch Ethanol12 Sau đó các slides được đun trong dung dịch Sodium citrate 10Mm PH 6 0 trong
20 phút nhằm khôi phục lại hoạt tính của các kháng nguyên Slides được ngâm trong dung dịch methanol có chứa hydrogen peroxide 3% với mục đích làm giảm hoạt tính của các men peroxidase nội sinh Để làm giảm những dấu hiệu không đặc hiệu, slides sẽ được ngâm trong skim milk 5% trong 15 phút Slides sau đó được ủ với kháng thể kháng protein pRB đã phosphoryl hóa tại vị trí Ser 780 và Ser 795 ở nhiệt độ 4°C Bước tiếp theo là dùng phức hợp Streptavidin-Biotin, được thực hiện theo những chỉ dẫn sẵn có của sản phẩm, thuộc công ty Lab Vision, Fremont, CA Kết quả sau đó được đánh giá bởi chuyên gia giải phẫu bệnh học
Phương pháp Western blot
Các mẫu bệnh phẫm, bao gồm mô bướu và mô lành kề cận bướu, được làm đồng nhất (homogenize) trong dung dịch ly giải Các bước tiếp theo tuân theo các công thức sẵn có12
Nuôi cấy tế bào Tế bào u gan ở người HepG2 có được từ
American Type Culture Collection Các tế bào được nuôi cấy trong môi trường có 10% fetal bovine serum (FBS) Chúng được điều trị với 10 μM U0126 hoặc 10
μM LY294002 trong vòng 24 giờ Các tế bào đối chứng được điều trị với dimethylsulfoxide (DMSO) Các tế bào sau đó được thu họach và phân tích Western blot
Các dòng tế bào có MEK1 họat hóa:
Tế bào u gan HepG2 được tải nạp (transfect) với 5μg pUSE-MEK1 hoặc plasmic pUSE control và 28μl Lipofectamine reagent theo các bước có sẵn Sau 48 giờ, các tế bào được nuôi cấy trong môi trường có 800μ /ml G418 Bốn tuần sau khi transfect, các dòng tế bào khác nhau được phân lập và phân tích Western blot
Phân tích thống kê
Trong việc đánh giá kết quả Western blot, đậm
Trang 4độ của các băng protein được tính tóan và chuẩn hóa
với băng protein α-tubulin Sự khác nhau về mức độ
biểu hiện protein được phân tích bằng ANOVA test
KẾT QUẢ
Những dữ kiện về giải phẫu bệnh được tóm tắt
như sau: 33% (15/46)số bệnh nhân được khảo sát có
kèm xơ gan, trong số này 26% (12/46) được chẩn
đóan lọan sản tế bào gan 70% bệnh nhân có khối u
đa ổ 56% (26/46) số bệnh nhân có sự hình thành
khối u vệ tinh Tỷ lệ sống sót sau 1 năm của các bệnh
nhân vào khỏang 74% (34/46) Trong nghiên cứu
này, chúng tôi không khảo sát tỷ lệ sống bình quân
cũng như tỷ lệ sống sau 5 năm của các bệnh nhân
pRB đóng một vai trò quan trọng trong sự điều
hòa chu trình tế bào13, sự kiềm hãm phát triển tế
bào13-15và sự tăng trưởng khối u15, 33 Mức độ của pRB
không tăng rõ rệt giữa các mẫu mô bướu với mô lành
kế cận Tuy nhiên có sự tăng phosphoryl hóa trong
các mô ung thư, biểu hiện bằng sự dịch chuyển lên
trên của băng protein ở vị trí 120 Kdalton, khi so sánh
với băng protein của mô lành kế cận Đối với dạng
phosphoryl hóa ở vị trí Serine 780 và 795, những mẫu
khối u có sự gia tăng biểu hiện tương ứng là 71%
(33/46) và 63% (29/46) so với mô lành Dạng
phosphoryl hóa của pRB ở vị trí serine 807/811 biểu
hiện rất thấp trong HCC và hầu như không thể phát
hiện ở mô lành kế cận
Yếu tố họat hóa sao mã E2F-1 đóng một vai trò
quan trọng đối với việc điều hòa biểu hiện gen trong
quá trình tăng trưởng của tế bào Dạng giảm
phosphoryl hóa của protein pRB kết hợp với E2F-1, từ
đó ngăn ngừa sự họat hóa của các gen cần thiết cho
pha G2 của chu trình tế bào, làm cho chu trình tế bào
ngừng ở pha G134, 35
Hình 1 cho thấy protein E2F-1 tăng rõ rệt trong
64% (30/46) các trường hợp HCC được khảo sát Và
có sự tăng tỷ lệ thuận giữa tăng phosphoryl hóa của
pRB và sự gia tăng biểu hiện của E2F-1 Kết quả này
chứng tỏ có hiện tượng tăng phosphoryl hóa pRB ở vị
trí Serine 780 và 795 trong HCC nhưng không có ở
mô lành kế cận
Những khối u HCC thì không đồng nhất về mặt phân lọai tế bào, vì vậy cần đánh gía về mặt tế bào học sự tăng phosphoryl hóa của protein pRB Tất cả
46 mẩu bệnh phẫm đều được làm hóa mô miễn dịch với kháng thể kháng protein pRB dạng được phosphoryl hóa ở các vị trí Serine 780 và 795
Hình 2 cho thấy có 90-100% các tế bào ung thư
tăng biểu hiện protein pRB trong nhân tế bào Trong khi đó ở mô lành kế cận hoặc mô gan xơ không biểu hiện hoặc biểu hiện rất mờ nhạt dấu hiệu của protein pRB Các tế bào biểu mô ống mật và tế bào mô đệm không biểu hiện Khi dùng các tiêu bản kể trên nhuộm với kháng thể kháng protein pRB ở dạng được phosphoryl lẫn không được phosphoryl hóa, thì có sự biểu hiện đồng nhất trong nhân của các tế bào lành
tính và mô gan xơ ở tất cả 46 mẫu bệnh phẩm Slides A&B: nhuộm với kháng thể kháng pRB phosphoryl hóa tại vị trí Ser 780 Slides C&D: nhuộm với kháng thể kháng pRB phosphoryl hóa tại vị trí Ser 795 Hình 3 cho thấy có hiện tượng gia tăng biểu hiện
Trang 5của protein Cyclin D1, Cyclin A, Cdk-2 và Cdk-4
trong 43% (26/46), 63% (29/46), 28% (11/46) và 71%
(33/46) trong các khối u so với mô lành kế cận
Hình 2
Hình 4 cho thấy có rằng sự biểu hiện của protein
ERK tăng trong 91% các trường hợp HCC được khảo
sát Về mặt định lượng, mức độ biểu hiện của ERK
tăng 1 6 lần ở mô ung thư so với mô bình thường
Khi thực hiện phương pháp Western blot với kháng
thể kháng protein ERK ở dạng họat hóa, 69% (32/46)
trường hợp HCC có sự tăng biểu hiện ERK
Để chứng tỏ protein MEK-ERK cần thiết cho sự tạo thành Cyclin D1, E2F-1, Cdk-2, sự phosphoryl hóa pRB và chu trình tế bào;chúng tôi điều trị dòng tế bào u gan của người Hep G2 với chất ức chế MEK1/2-U0126 Tếbào HepG2 được điều trị với 10 microgram U0126 hoặc 10 microgram chất ức chế PI-3 kinase LY294002 trong 24giờ Tế bào đối chứng được điều trị với DMSO Bằng phương pháp Western blot cho thấy chất U0126 có tác dụng làm giảm rõ rệt sự biểu hiện Cyclin D1 và cdk-2 nhưng không làm giảm E2F-1 và cyclin E, đồng thời làm giảm sự phosphoryl hóa của pRB ở vị trí Ser 785 và 790 khi so sánh với nhóm chứng Những kết qủa này cho thấy sự họat hóa con đường dẫn truyền MEK-ERK là cần thiết cho sự phosphoryl hóa pRB tại vị trí Ser 780,
795 và sự biểu hiện của Cyclin D1, Cdk-2
Hình 4
BÀN LUẬN
Sự rối lọan chức năng của những protein liên quan đến chu trình tế bào là một trong những yếu tố
Trang 6chính làm phát triển HCC36-38 Sản phẩm của gen
pRB đóng vai trò điều hòa âm tính đối với sự tăng
sinh, biệt hóa tế bào và sự sinh ung thư14-16
Hình 5
Sự ức chế tăng trưởng tế bào của protein pRB
phụ thuộc vào sự kết hợp với yếu tố E2F Dạng không
phosphoryl của pRB cần thiết cho sự tương tác với
E2F Trong G0 và giai đọan sớm của G1 của chu trình
tế bào, dạng không phosphoryl của pRB kiềm hãm
họat tính gây sao mã của các yếu tố E2Fs Khi chu
trình tế bào tiếp tục tiến triển, pRB trở nên tăng
phosphoryl hóa, do đó làm tách rời phức hợp
pRB-E2Fs; và vì vậy cho phép biểu hiện của những gen
cần thiết cho sự tiến triển của chu trình tế bào
Những nghiên cứu trước đây11 cho thấy pRB dạng gia
tăng phosphoryl hóa rất thường gặp ở những trường
hợp khối u HCC có kích thước lớn hơn 5 cm Trong
nghiên cứu này, chúng tôi cho thấy có Hình 5sự tăng
đáng kể các protein Cyclin D1, E2F-1, Cyclin A,
Cdk-2 và Cdk-4 ở những mẫu mô HCC so với mô lành kế cận Những quan sát này phù hợp với các kết quả báo cáo trước đây38 Sự phosphoryl hóa pRB ở vị trí Ser
780 và 795 thấy trong 71% và 63% các trường hợp HCC ở cả giai đọan sớm và giai đọan muộn của ung thư gan
Sự tích lũy Cyclin D1, Cdk-2, Cdk-4, Cyclin E cho phép hình thành những phức hợp Cyclin E/cdk-2 và Cyclin D1/cdk-4 Sự phosphoryl hóa pRB ở vị trí Ser bởi Cyclin D1/cdk-4 làm ức chế sự tương tác với yếu tố sao mã, cho phép biểu hiện các gen cần thiết cho pha S của chu trình tế bào Nghiên cứu của chúng tôi cho thấy biểu hiện của pRB không có trong 13% các trường hợp HCC được khảo sát, tương tự với các công trình nghiên cứu trước cho kết quả từ 20-28%11, 39 Cơ chế phân tử của sự mất khả năng biểu hiện protein pRB vẫn chưa rõ, có thể do mất hoặc đột biến ở vị trí pRB Mặc dù cả hai sự mất biểu hiện và sự biểu hiện quá mức của pRB được quan sát với tần xuất cao trong HCC kém biệt hóa so với HCC biệt hóa vừa và biệt hóa cao, trong nghiên cứu của chúng tôi không
Trang 7có trường hợp HCC nào biểu hiện quá mức protein
pRB Sự khác nhau này vẫn chưa rõ
Sự biểu hiện quá mức và sự phosphoryl hóa ERK
cũng được phát hiện trong 91% và 69% trường hợp
Phân tích in vivo đối với pRB cũng cho kết quả tương
tự Việc điều trị tế bào ung thư gan bằng chất ức chế
MEK1/2 dẫn đến ức chế sự phosphoryl hóa pRB và làm
giảm biểu hiện protein Cdk-2 và Cyclin D1 Hơn nữa
sự biểu hiện quá mức MEK1 đã hoạt hóa làm tăng biểu
hiện của Cyclin D1, Cdk-2 Santoni-Rugiu và cộng sự36
đã báo cáo hiện tượng tăng biểu hiện của Cyclin D1 và
tăng phosphoryl hóa pRB trên ung thư tế bào gan gây
ra trên chuột transgenic c-myc/TGF-α
Sự biểu hiện quá mức của Cyclin D1 trên HCC
cũng đã được báo cáo40-42 Cyclin D1 làm tăng diễn
tiến chu trình tế bào43 và kích họat quá trình sinh
ung ở ung thư tế bào gan37 Và mức độ tăng protein
Cyclin D1 đi kèm với những thể tiến triển nhanh của
HCC38, 42, 44, 45 Trong nghiên cứu của chúng tôi, sự
biểu hiện của Cyclin D1 được điều hòa bởi con đường
dẫn truyền MEK-ERK, do đó những đột biến làm
họat hóa MEK-ERK sẽ làm tăng biểu hiện của protein
Cyclin D1 trong HCC Điều này cũng phù hợp với
những nghiên cứu trước đây đã chứng tỏ rằng họat
tính gây sao mã của gen Cyclin D1 xảy ra nhờ con
đường dẫn truyền tín hiệu Ras qua yếu tố ERK1/246-49
Mặc dù cơ chế bệnh sinh của HCC vẫn chưa
được biết, nghiên cứu của chúng tôi đề nghị vai trò
của ERK trong sự điều hòa họat tính của pRB/E2F
trong HCC Giả thuyết này cũng phù hợp với kết quả
khi tải nạp (transfect) dòng tế bào HepG2 với MEK1
dẫn đến tăng phosphoryl hóa pRB và làm tăng biểu
hiện Cyclin D1 Hơn nữa, khi điều trị với chất ức chế
MEK1/2 –U0126 làm giảm sự phosphoryl hóa của
pRB tại vị trí Ser 780 và Serine 795, đồng thời làm
giảm sự biểu hiện của Cyclin D1 và Cdk-2 Do đó
chúng tôi nghĩ rằng sự họat hóa yếu tố MEK-ERK,
nhưng không họat hóa các yếu tố PKC, Raf, Abl,
MEKK, ERK, JNK MKK3, MKK-4/SEK, MKK-6, Cdk-2
hay Cdk-450, là cần thiết cho sự biểu hiện của Cyclin
D1 và Cdk-2 cũng như làm tăng phosphoryl hóa pRB
tại vị trí Serine780 và 795 Tuy nhiên vẫn cần phải
xác định vai trò của pRB có phải là một yếu tố then chốt rong cơ chế sinh bệnh của ung thư tế bào gan hay không
Sự hiện diện của pRB tăng họat tính phosphoryl
ở những trường hợp HCC biệt hóa cao, đề nghị rằng khi có sự bất họat con đường dẫn truyền này sẽ làm tăng quá trình sinh ung Sự biểu hiện cao của pRB dạng tăng phosphoryl hóa ở các tế bào ung thư chứng tỏ các tế bào này đã trải qua giai đọan G1 và S của chu trình tế bào51-54 Trong khi đó sự biểu hiện cao của pRB dạng ít phosphoryl hóa ở các tế bào mô lành kế cận khối u, chứng tỏ các tế bào này đã ra khỏi chu trình tế bào và vào giai đọan yên lặng hoặc ở mức độ biệt hóa cuối cùng Sự biểu hiện dạng nốt của pRB quan sát ở các khối u có thể gợi ý vai trò của việc dẫn truyền tín hiệu nội tiết hoặc cận tiết Sự bất họat lan rộng của pRB ở các trường hợp HCC biệt hóa cao có thể do tăng tiết các yếu tố IGF-II12, TGF-α55, HGF và
c-met56, ErbB-257 và giảm tiết IGFBP-3 12 Tóm lại nghiên cứu của chúng tôi cho thấy sự gia tăng biểu hiện của các yếu tố E2F-1, Cyclin D1, Cyclin A, Cdk-2 và Cdk-4 và dạng phosphoryl của pRB trong khối u ung thư tế bào gan Việc điều trị tế bào ung thư gan với chất ức chế MEK1/2 làm sự ức chế biểu hiện của Cyclin D1 và Cdk-2 và làm giảm phosphoryl hóa pRB Những kết quả trên cho thấy có thể có mối liên hệ giữa sự họat hóa MEK-ERK, sự tăng biểu hiện Cyclin D1 và tăng phosphoryl hóa pRB trong ung thư tế bào gan Do đó, việc ức chế con đường dẫn truyền tín hiệu Ras/Raf-ERK có thể là một cách để kiềm hãm sự phát triển ung thư tế bào gan
CÁC TỪ VIẾT TẮT:
HCC: Hepatocellular carcinoma, pRB: Retinoblastoma p105, ERK: Extracellular signal-regulated kinase, MAPK: Mitogen-activated protein kinase, MEK:MAPK/Erk kinase, TGF-α:Transforming growth factor-α, IGF-II: Insulin-like growth Factor II, IGFBP-3: Insulin-like growth factor binding protein 3
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1 Schafer, D F et al Lancet, 353: 1253-1257, 1999
2 Ince, N et al N Engl J Med, 340: 798-799, 1999
Trang 83 Okuda, K et al Cancer, 56: 918-928, 1985 29 Ballif, B A et al Cell Growth Differ., 12: 397-408,
2001
4 Colombo, M et al J Hepatol., 15: 225-236, 1992
30 Krueger, J S et al Oncogene, 20: 4209-4218, 2001
5 Huguet, C S F et al Surgery of the Liver and Billary
Tract., pp 1365-1369 London: Churchill Livingstone,
2000
31 Mansour, S J et al Science, 265: 966-970, 1994
32 Montesano, R et al Cell Growth Differ., 10: 317-332,
1999
6 Lai, E et al Surgery of the Liver and the biliary
tract, pp 1349-1363 London: Churchill Livingstone,
1994
33 Vaux, D L et al Nature, 335: 440-442, 1988
34 Dyson, N et al Genes Dev., 12: 2245-2262, 1998
7 Chan, E S et al Cochrane Database Syst Rev.,
CD001199, 2000
35 Nevins, J R et al Cell Growth Differ., 9: 585-593,
1998
8 Zeng, J Z et al Oncogene, 21: 4932-4943, 2002 36 Santoni-Rugiu, E et al Cancer Res., 58: 123-134,
1998
9 Murakami, Y et al Cancer Res., 51: 5520-5525, 1991
10 Lee, A V et al Biomed Pharmacother., 49: 415-421,
1995
37 Deane, N G et al Cancer Res., 61: 5389-5395, 2001
38 Masaki, T et al Hepatology, 37: 534-543, 2003
11 Hui, A M et al Int J Cancer, 84: 604-608, 1999 39 Azechi, H et al Oncol., 60: 346-354, 2001
12 Huynh, H et al Cell Growth Differ., 13: 115-122,
2002
40 Peng, S Y et al J Hepatol., 29: 281-289, 1998
41 Roncalli, M et al Hepatology, 36: 427-432, 2002
13 Herwig, S et al 246: 581-601, 1997 42 Ito, Y et al Hepatology, 30: 90-99, 1999
14 Xu, H J et al Proc Natl Acad Sci U S A, 91:
9837-9841, 1994
43 Albrecht, J H et al Cell Growth Differ., 10: 397-404,
1999
15 Yen, A et al Exp Cell Res, 241: 324-331, 1998 44 Nishida, N et al Cancer Res, 54: 3107-3110, 1994
16 Xu, H J et al Cancer Res, 56: 2245-2249, 1996 45 Nishida, N et al Histol Histopathol., 12: 1019-1025,
1997
17 Xu, H J et al Oncogene, 15: 2589-2596, 1997
18 Taya, Y Trends Biochem Sci., 22: 14-17, 1997 46 Tetsu, O et al Nature, 398: 422-426, 1999
19 Keck, P J et al Science, 246: 1309-1312, 1989 47 Morin, P J et al Bioessays, 21: 1021-1030, 1999
20 Kitagawa, M et al EMBO J, 15: 7060-7069, 1996 48 Ito, Y et al Hepatology, 27: 951-958, 1998
21 Grafstrom, R H et al Carcinogenesis, 20: 193-198,
1999
49 Lavoie, J N et al J Biol Chem., 271: 20608-20616,
1996
22 Pan, W et al Carcinogenesis, 19: 765-769, 1998 50 Favata, M F et al J Biol Chem., 273: 18623-18632,
1998
23 Xiao, Z X et al Nature, 375: 694-698, 1995
24 Lukas, J et al Genes Dev., 11: 1479-1492, 1997 51 Chen, P L et al Cell, 58: 1193-1198, 1989
25 Knudsen, E S et al Mol Cell Biol., 17: 5771-5783,
1997
52 DeCaprio, J A et al Cell, 58: 1085-1095, 1989
53 Buchkovich, K et al Cell, 58: 1097-1105, 1989
26 Adams, P D et al Biophys Acta, 1471: M123-M133,
2001
54 Mihara, K et al Science, 246: 1300-1303, 1989
55 Chung, Y H et al Cancer, 89: 977-982, 2000
27 Hoshino, R et al Oncogene, 18: 813-822, 1999 56 Ueki, T et al Hepatology, 25: 862-866, 1997
28 Amundadottir, L T et al Oncogene, 16: 737-746,
1998
57 Endo, K et al Liver, 20: 209-215, 2000