Đề tài này nhằm thiết lập các điều kiện để K2Cr2O7 cho đáp ứng dương tính trong thử nghiệm sưng phù tai chuột nhắt (MEST) nhằm làm chất đối chứng dương cho các thử nghiệm đánh giá tính mẫn cảm sau này.
Trang 1THỬ NGHIỆM SƢNG PHÙ TAI CHUỘT NHẮT (MEST)
DO ĐÁP ỨNG QUÁ MẪN VỚI KALI DICROMAT BÔI NGOÀI DA
Phan Thị Xuân Lý * , Võ Lê Tường Vy * , Huỳnh Ngọc Trinh *
TÓM TẮT
Đặt vấn đề: Đánh giá khả năng g}y dị ứng của các sản phẩm dùng ngoài là một trong những yêu cầu quan
trọng trước khi đưa sản phẩm ra thị trường Đề tài này nhằm thiết lập c{c điều kiện để K 2 Cr 2 O 7 cho đ{p ứng dương tính trong thử nghiệm sưng phù tai chuột nhắt (MEST) nhằm làm chất đối chứng dương cho c{c thử nghiệm đ{nh gi{ tính mẫn cảm sau này
Đối tượng và phương pháp nghiên cứu: Tiến hành trên chuột nhắt Swiss albino MEST gồm 2 thử
nghiệm chính: khảo s{t sơ bộ tính kích ứng da tai chuột nhắt của K 2 Cr 2 O 7 và khảo sát tính mẫn cảm của K 2 Cr 2 O 7
sau giai đoạn cảm ứng và gợi mở
Kết quả: Nồng độ tối tối đa không g}y kích ứng và nồng độ tối thiểu gây kích ứng da của K 2 Cr 2 O 7 lần lượt là 6% và 8% Phản ứng quá mẫn xảy ra sau khi bôi dung dịch K 2 Cr 2 O 7 cho kết quả dương tính khi bôi 10 μL dung dịch K 2 Cr 2 O 7 6% ở pha cảm ứng cũng như pha gợi mở Trợ chất FCA cũng được tiêm trong da để tăng cường đ{p ứng quá mẫn
Kết luận: K 2 Cr 2 O 7 có thể sử dụng làm chất đối chứng dương trong thử nghiệm đ{nh gi{ tính mẫn cảm của các sản phẩm dùng ngoài dựa trên thử nghiệm MEST
Keywords: Trợ chất hoàn chỉnh Freund (FCA), phản ứng quá mẫn, MEST, kali dichromat
ABSTRACT
HYPERSENSITIVE RESPONSE TO DERMAL APPLICATION OF POTASSIUM DICHROMATE
ON MOUSE EAR SWELLING TESTING (MEST)
Phan Thi Xuan Ly, Vo Le Tuong Vy, Huynh Ngoc Trinh
* Y Hoc TP Ho Chi Minh * Supplement Vol 22 - No 1- 2018: 348 - 353
Background: The evaluation of the potential hypersensitive reaction meets the critical requirements for the
lauching of different dermal products in the market This work aimed to set up necessary conditions to obtain a positive hypersensitive response to potassium dichromate, a well known chemical sensitizer, in Mouse Ear Swelling Testing (MEST)
Materials and method: protocol of MEST included the preliminary testing of dermal irritation and the
hypersensitivity testing, including induction phase and challenge phase
Results: maximum non-irritating and minimum irritating concentrations of K 2 Cr 2 O 7 were 6% and 8%, respectively The hypersensitive response following to K 2 Cr 2 O 7 topical aplication was positive when using 10 µl of
K 2 Cr 2 O 7 6% solution in the induction phase as well as in the elicitation phase FCA was also intradermally injected to increase hypersensitive response
Conclusion: K 2 Cr 2 O 7 should be used as a positive control to test the hypersensitive potential of dermal products based on MEST in Swiss albino mice
Trang 2Keywords: Freunds Complete Adjuvant (FCA), hypersensitivity reaction, MEST, potassium dichromate
ĐẶT VẤN ĐỀ
Viêm da tiếp xúc dị ứng (VDTXDU) là một
trong những bệnh lý về da thường gặp, đặc biệt
liên quan đến việc sử dụng mỹ phẩm, nước hoa
và các thuốc dùng ngo|i da; thường thì các hoạt
chất trong những sản phẩm này không phải là
tác nhân gây dị ứng, mà những chất bảo quản,
hương liệu, phẩm màu hoặc chất dẫn mới là
nguyên nhân chủ yếu(6) Do đó, việc kiểm tra
công thức và các thành phần có khả năng g}y dị
ứng hay không là khâu quan trọng trong quá
trình kiểm so{t trước khi đưa sản phẩm dùng
ngoài da ra thị trường Nhiều phương ph{p
kiểm tra đã được phát triển, chủ yếu sử dụng
chuột lang để dự đo{n khả năng g}y dị ứng của
sản phẩm lên người như: thử nghiệm tối đa ho{
trên chuột lang (GPMT), thử nghiệm Buehler(9)
Từ những thập 90, c{c phương ph{p thử nghiệm
tiên đo{n sử dụng chuột nhắt đã được xây dựng
và ngày càng phổ biến như: khảo nghiệm hạch
bạch huyết (LLNA) và thử nghiệm sưng tai
chuột (MEST)(1,2) Thử nghiệm MEST có nhiều ưu
điểm như: dễ thực hiện, kết quả của thử nghiệm
thu được thông qua sự đo lường, ít bị lệch và dễ
ph}n tích hơn, chuột nhắt rẻ tiền, dễ nuôi và có
khả năng miễn dịch tốt hơn c{c lo|i kh{c<(5)
Kali dicromat (K2Cr2O7) là một hoá chất vô cơ
tinh khiết, l| t{c nh}n oxy ho{ thường dùng nhất
trong phòng thí nghiệm và trong các ngành công
nghiệp khác nhau K2Cr2O7 là một trong những
tác nhân phổ biến nhất gây viêm da nghề
nghiệp, thường gặp ở c{c đối tượng như công
nhân mạ crom, thợ in đá, công nhân sửa chữa
động cơ diesel, công nh}n thuộc da(4), Ngoài ra,
K2Cr2O7 còn hiện diện trong các sản phẩm gia
dụng gia đình như: thuốc tẩy trắng, mỹ phẩm, xi
đ{nh gi|y, Cho nên nó được xem là nguyên
nhân tiềm năng g}y VDTXDU do crom l| chất có
khả năng g}y mẫn cảm dẫn đến viêm da mạn
tính và rất khó điều trị, đặc biệt ở bàn tay
Do đó, chúng tôi đã tiến hành thử nghiệm
sưng phù tai chuột do đ{p ứng quá mẫn với
kali dicromat bôi ngoài da với mong muốn tìm
ra c{c điều kiện cụ thể để K2Cr2O7 cho đ{p ứng dương tính trên mô hình n|y; từ đó đưa
ra một mô hình đơn giản để có thể áp dụng thực tế khi cần khảo sát tiềm năng mẫn cảm của các chế phẩm dùng ngoài da so với chất đối chiếu dương tính l| K2Cr2O7
ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Vật liệu
Thú thử nghiệm
Chuột nhắt trắng chủng Swiss albino, giống
đực, 5-8 tuần tuổi, khoẻ mạnh, không dị tật, không có biểu hiện bất thường do Viện Vaccin
và Sinh phẩm y tế Nha Trang cung cấp Chuột được chia lô ngẫu nhiên thành từng nhóm 6 con/lồng (kích thước 15 x 26 x 36 cm - cao x rộng
x dài) Chuột mua về được để thích nghi với điều kiện môi trường thí nghiệm ít nhất 5 ngày Chuột được cung cấp đầy đủ thức ăn v| nước uống mỗi ngày
Hoá chất –dụng cụ
Kali dicromat (K2Cr2O7) (hóa chất tinh khiết, Trung Quốc)
Trợ chất hoàn chỉnh Freund (FCA) (Sigma-Aldrich, Đức)
Dung dịch NaCl 0,9% dược dụng
Thước kẹp Digitronic calliper, độ chính xác 0,01 mm
Phương pháp thử nghiệm
Các thử nghiệm được thiết kế (có thay đổi)
từ c{c hướng dẫn của OECD v| Dược điển Mỹ (USP 32)(7,10)] Thử nghiệm MEST gồm 2 giai đoạn chính: khảo s{t sơ bộ tính kích ứng và khảo sát tính mẫn cảm của chế phẩm/hóa chất
Thử nghiệm đánh giá sơ bộ tính kích ứng
Chuột được chia thành 4 nhóm, mỗi nhóm 3 chuột Đo độ dày cả hai tai của mỗi chuột lúc ban đầu Mỗi nhóm được thử tính kích ứng của
K2Cr2O7 tương ứng với các nồng độ của dung
Trang 3dịch K2Cr2O7 như sau 4%, 6%, 8% v| 10% (w/v)
K2Cr2O7 được pha trong dung dịch NaCl 0,9%
Bôi dung dịch K2Cr2O7 vào tai phải của chuột,
tai trái bôi dung dịch NaCl 0,9% (tai chứng) Đo
bề dày tai chuột 2, 6, 24 giờ sau khi bôi
So sánh bề dày tai chuột của tai thử nghiệm
so với tai chứng theo công thức sau:
Chênh lệch (%) 100
A
A B
%
Trong đó, B: bề dày tai phải bôi K 2 Cr 2 O 7; A: bề dày tai
trái bôi NaCl 0,9%
Dung dịch K2Cr2O7 gây kích ứng da khi ở
nồng độ đó l|m tăng bề dày tai chuột trung bình
lên trên 10%(3)
Thử nghiệm đánh giá tính mẫn cảm của
K 2 Cr 2 O 7
Chuẩn bị thử nghiệm
Cạo sạch lông vùng da bụng của chuột (2cm
x 2cm) trước khi tiến hành thử nghiệm 1 ngày
Không dùng những chuột có da bị viêm hoặc bị
trầy xước do cạo lông Chuột được sử dụng vào
thử nghiệm là những chuột có vùng da đã cạo
lông nhẵn mịn v| chưa mọc lông trở lại Đo bề
dày hai tai chuột lúc ban đầu Không dùng vào
thử nghiệm những chuột có bề dày 2 tai chênh
lệch quá 10%
Tiến trình thử nghiệm
Giai đoạn cảm ứng: Tiêm trong da trợ chất
hoàn chỉnh FCA với các thể tích khác nhau (0, 50,
100l) vào hai bên vùng bụng đã cạo lông Sau
đó bôi 10l dung dịch K2Cr2O7 (với các nồng độ
khác nhau, pha trong dung dịch sinh lý) vào
giữa hai vùng đã tiêm FCA Khi vết bôi đã khô
cho chuột trở lại lồng Tiếp tục bôi K2Cr2O7 trong
vòng 5 ngày liên tiếp (Ng|y 1 đến ngày 5)
Giai đoạn gợi mở: Năm ng|y sau ng|y bôi
K2Cr2O7 cuối cùng ở giai đoạn cảm ứng (Ngày
10), bôi 10l dung dịch K2Cr2O7 lên tai phải của
chuột, tai trái bôi 10l dung dịch NaCl 0,9%
Đo bề dày hai tai chuột trước khi bôi và ở các
thời điểm 24, 48 giờ sau khi bôi dung dịch
KCrO/dung dịch NaCl 0,9% bằng thước kẹp
Các thử nghiệm
Thử nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của nồng
độ dung dịch K2Cr2O7 ở giai đoạn cảm ứng Chuột được chia thành 3 lô, 6 chuột/lô Tiến hành tiêm trong da 50l FCA vào ngày 1 và bôi
10l dung dịch Kali dicromat ở các nồng độ khác nhau liên tục trong 5 ngày lên vùng bụng chuột ở giai đoạn cảm ứng:
Lô 1: Dung dịch K2Cr2O7 4%
Lô 2: Dung dịch K2Cr2O7 6%
Lô 3: Dung dịch K2Cr2O7 8%
Ở giai đoạn gợi mở, chuột được bôi 10l dung dịch K2Cr2O7 2% lên tai phải, tai trái bôi
10l dung dịch NaCl 0,9%
Thử nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của nồng
độ dung dịch K2Cr2O7 ở giai đoạn gợi mở
Chuột được chia thành 4 lô, 6 chuột/lô Giai đoạn cảm ứng của 4 lô được tiến hành trong cùng điều kiện như sau: Tiêm trong da
50l FCA vào ngày 1 và bôi 10l dung dịch
K2Cr2O7 6% lên vùng bụng chuột liên tục trong
5 ngày
Giai đoạn gợi mở được tiến hành bằng cách bôi 10l dung dịch K2Cr2O7 ở các nồng độ khác nhau lên tai phải chuột Cụ thể như sau:
Lô 1: Bôi 10l dung dịch K2Cr2O7 3%
Lô 2: Bôi 10l dung dịch K2Cr2O7 4%
Lô 3: Bôi 10l dung dịch K2Cr2O7 6%
Trong khi đó: tai tr{i được bôi 10l (dung dịch NaCl 0,9%)
Thử nghiệm 3: Khảo s{t lượng tiêm FCA
Chuột được chia thành 3 lô, 6 chuột/lô Tiến hành tiêm trong da FCA với các thể tích khác nhau vào ngày 1 và bôi liên tục 10l dung dịch
K2Cr2O7 6% trong 5 ngày ở giai đoạn cảm ứng
Lô 1: 0l FCA
Lô 2: 50l FCA
Lô 3: 100l FCA
Trang 4Giai đoạn gợi mở được tiến hành bằng
cách bôi 10l dung dịch K2Cr2O7 4% lên tai
phải chuột, tai tr{i được bôi 10l dung dịch
NaCl 0,9%
Đ{nh gi{ kết quả
Tính mẫn cảm da được đ{nh gi{ dựa vào
phần trăm tăng bề dày của tai bôi chất thử
nghiệm so với tai bôi chất dẫn Cụ thể theo công
thức sau(10):
Chênh lệch (%) 100
A
A B
% Trong đó, A: bề dày tai trung bình sau giai
đoạn gợi mở (24 hoặc 48 giờ) của tai chứng; B: bề
d|y tai trung bình sau giai đoạn gợi mở (24 hoặc
48 giờ) của tai thử nghiệm;
Phản ứng dương tính khi có bề d|y tai tăng trung bình từ 20%
Xử lý số liệu, thống kê phân tích
Các số liệu thu được từ các thử nghiệm được
xử lý theo phương ph{p thống kê mô tả Số liệu được trình b|y dưới dạng số trung bình ± SEM cho mỗi lô thử nghiệm
KẾT QUẢ
Thử nghiệm đánh giá sơ bộ tính kích ứng
Kết quả thử nghiệm đ{nh gi{ sơ bộ tính kích ứng da của K2Cr2O7 trên tai chuột được trình bày trong bảng 1
Bảng 1: Khảo sát tính kích ứng tai chuột của K 2 Cr 2 O 7 ở các nồng độ khác nhau
Nồng độ (%) Trước bôi Sau bôi 2 giờ Sau bôi 6 giờ Sau bôi 24 giờ
Chệnh lệch ± SEM (%)
6 0 8,4±1,7 8,4±1,7 8,4±1,7
8 0 9,7±0,3 9,7±0,3 9,7±0,3
10 0 11,3±1,4 11,3±1,4 14,1±0,2
Kết quả cho thấy nồng độ K2Cr2O7 4 % không
gây kích ứng trên da tai chuột, nồng độ 6% gây
kích ứng nhẹ; trong khi đó, nồng độ 8-10% thể
hiện rõ tính kích ứng da, đặc biệt ở thời điểm 24
giờ sau khi bôi dung dịch K2Cr2O7
Thử nghiệm đánh giá tính mẫn cảm của
K2Cr2O7
Khảo sát vai trò FCA trong đáp ứng mẫn cảm
Bảng 2: Vai trò FCA trong đ{p ứng mẫn cảm
FCA
(µl)
Trước gợi
mở
24 giờ sau gợi mở
48 giờ sau gợi mở
Chệnh lệch ±
SEM (%)
0 0 2,4±1,7 5,3±3,1
50 0 11,9±1,1 16,7±2,5
100 0 15,2±1,2 15,2±1,2
Kết quả ở Bảng 2 cho thấy nếu không dùng
FCA mức độ mẫn cảm rất thấp ở cả hai thời
điểm 24 giờ và 48 giờ sau gợi mở Phản ứng
quá mẫn tăng cao khi tiêm 50 µl FCA ngay khi
bắt đầu thử nghiệm Có 2 trong 6 chuột có
mức độ tăng bề dày tai rất cao so với tai chứng
(23,81% và 25%) Khi tiêm 100 µl FCA, bề dày
tai chuột tăng cao v| tương đối đồng đều ở
thời điểm 24 giờ sau gợi mở nhưng lại không tăng ở thời điểm 48 giờ
Như vậy, việc tiêm trong da trợ chất FCA giúp gia tăng phản ứng dị ứng Điều n|y cũng phù hợp với các nghiên cứu trên thế giới về việc
sử dụng thêm FCA để l|m tăng độ nhạy của phương ph{p v| giúp ph{t hiện các chất có tiềm năng mẫn cảm yếu(1,9) Tuy nhiên, kết quả của thử nghiệm cũng chứng tỏ lượng tiêm 50 µl FCA l| đủ để tăng cường đ{p ứng quá mẫn mà không cần phải tiêm đến 100 µl
Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ dung dịch
K 2 Cr 2 O 7 ở giai đoạn cảm ứng
Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nồng độ dung dịch K2Cr2O7 (4%, 6%, 8%) trong giai đoạn cảm ứng được trình bày ở Bảng 3 Kết quả cho thấy đ{p ứng mẫn cảm của tai chuột tăng khi tăng nồng độ dung dịch K2Cr2O7 trong giai đoạn cảm ứng Đồng thời nồng độ cảm ứng 8% đã g}y hiện tượng phù tai chuột rõ rệt ở thời điểm 48 giờ sau gợi mở nhưng vẫn chưa cho đ{p ứng mẫn cảm dương tính ở thời điểm này
Trang 5Bảng 3: Ảnh hưởng của nồng độ của dung dịch
K 2 Cr 2 O 7 ở giai đoạn cảm ứng
Nồng độ cảm
ứng (%)
Trước gợi mở
24 giờ sau gợi mở
48 giờ sau gợi mở
Chệnh lệch
± SEM (%)
4 0,9±0,8 7,1±1,0 7,1±1,0
6 0 7,9±1,2 9,9±0,1
8 0 10,4±1,7 17,0±2,5
Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ dung dịch
K 2 Cr 2 O 7 ở giai đoạn gợi mở
Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nồng độ
dung dịch K2Cr2O7 (2%, 3%, 4% và 6%) ở giai
đoạn gợi mở được trình bày ở Bảng 4 Khi nồng
độ dung dịch K2Cr2O7 trong pha gợi mở tăng thì
phản ứng mẫn cảm cũng tăng lên Với nồng độ
gợi mở 3%, mức độ gia tăng bề dày tai chuột
không đ{ng kể, lần lượt là 8,1 và 13,2% sau 24 và
48 giờ gợi mở Khi tăng nồng độ dung dịch
K2Cr2O7 lên 4%, đ{p ứng mẫn cảm tuy có tăng
nhưng vẫn chưa đạt mức dương tính Với nồng
độ dung dịch K2Cr2O7 gợi mở l| 6%, đ{p ứng
mẫn cảm tăng cao v| đạt kết quả dương tính ở
thời điểm 48 giờ sau gợi mở với mức chênh lệch
21,9% so với tai chứng
Bảng 4: Nồng độ gợi mở của dung dịch K 2 Cr 2 O 7 và
tính mẫn cảm da
Nồng độ
gợi mở
(%)
Trước gợi mở
24 giờ sau gợi mở
48 giờ sau gợi mở
Chệnh lệch ±
SEM
(%)
3 0 8,1±1,2 13,2±2,1
4 0 11,9±1,1 16,7±2,5
6 0 17,1±1,2 21,9±1,2
BÀN LUẬN CHUNG
Bên cạnh thử nghiệm đ{nh gi{ tính kích ứng,
thử nghiệm đ{nh gi{ tính mẫn cảm da cũng l|
một trong những yêu cầu được đặt ra đối với các
chế phẩm dùng ngoài phẩm dùng ngoài Thử
nghiệm tiên đo{n tiềm năng mẫn cảm của các
chất khác nhau trên da chuột nhắt bằng thử
nghiệm MEST đã được sử dụng từ lâu trên thế
giới nhưng hiện tại vẫn chưa được phát triển tại
Việt Nam Bên cạnh đó, để đ{nh gi{ tiềm năng
gây mẫn cảm của một chế phẩm, cần phải so
sánh với một chất đối chiếu dương tính Đa số
các thử nghiệm MEST đều sử dụng các chất mẫn
cảm mạnh làm chất đối chiếu như
dinitrofluorobenzen, 2,4,6-trinitrochlorobenzen, benzocain, mercaptobenzothiazol(7,8) Trong khi
đó, mặc dù K2Cr2O7 là hóa chất dễ tìm nhưng lại được biết đến như một chất có tiềm năng g}y mẫn cảm da trung bình(5,10)
Do đó đề t|i đã khảo s{t c{c điều kiện cụ thể
để K2Cr2O7 cho đ{p ứng mẫn cảm dương tính trên thử nghiệm MEST và có thể sử dụng để làm chất đối chiếu trong thử nghiệm đ{nh gi{ tiềm năng mẫn cảm của các chế phẩm dùng ngoài Các kết quả thu được cho thấy nồng độ của dung dịch K2Cr2O7 trong pha cảm ứng và pha gợi mở đóng vai trò lớn để cho ra một đ{p ứng dương tính (bề dày tai chuột bôi K2Cr2O7 tăng trên 20% so với tai bôi dung dịch NaCl 0,9%) Ngoài ra, việc sử dụng trợ chất FCA cũng giúp tăng đ{p ứng miễn dịch trên thú thử nghiệm FCA được dùng trong phương ph{p GPMT để l|m tăng độ nhạy của phương ph{p v| giúp ph{t hiện các chất có tiềm năng mẫn cảm yếu(1,9)
Mô hình này có thể được áp dụng để đ{nh gi{ sơ
bộ tính mẫn cảm trên da chuột nhắt của các chế phẩm dùng ngoài, nhằm đơn giản hoá việc thực hiện và giảm chi phí thực nghiệm
KẾT LUẬN
Đề t|i đã x{c định c{c điều kiện cụ thể để
có thể sử dụng kali dicromat để làm chất đối chiếu dương tính v| {p dụng qui trình thử nghiệm MEST để đ{nh gi{ tiềm năng mẫn cảm của các chế phẩm dùng ngoài so với K2Cr2O7
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1 Dunn BJ, Rusch G.M, Siglin JC et al (1990) "Variability of a
mouse ear swelling test (MEST) in predicting weak and
moderate contact sensitization", Fundam Appl Toxicol, 15(2),
242-248
2 Gad SC (1994) "The mouse ear swelling test (MEST) in the
1990s", Toxicology, 93(1), 33-46
3 Gad SC (2006) Animal models in toxicology, 57-58
4 Handley J, Burrows D (1994) "Dermatitis from hexavalent chromate in the accelerator of an epoxy sealant (PR1422) used
in the aircraft industry", Contact dermatitis, 30(4), 193-195
5 Mandervelt C, Clottens FL, Demedts M et al (1997)
“Assessment of the sensitization potential of five metal salts in
the murine local lymph node assay”, Toxicology, 120(1), 65–73
6 Menné T, Christopherson J (1985) “Epidermiology of allergic
contact sensitization”, Current problems in Dermatology, 14, 1-30
Trang 67 OECD (1992) “OECD Guideline for Testing of Chemicals: Skin
Sensitization” Test Guideline 406
8 USP32-NF27 “Sensitization testing”, pp.699
9 Vogel HG, Hock FJ, Maas J et al (2006) Drug Discovery and
Evaluation: Safety and Pharmacokinetic Assays, 367-373
10 Wahlkvist H (1999) "Predictive testing for contact allergy:
Comparison of some guinea pig and mouse protocols
including dose-response designs", Arbete och Hälsa, 21, 1-55
Ngày nhận bài báo: 18/10/2017 Ngày phản biện nhận xét bài báo: 01/11/2017 Ng|y b|i b{o được đăng: 15/03/2018