Mục tiêu nghiên cứu của bài viết nhằm xác định đặc điểm cấu trúc phân tử gen LMP-1 của một số chủng EBV phân lập từ bệnh nhân ung thư vòm họng ở Việt Nam. Phân tích liên quan bệnh lý của gen mã hóa LMP-1 protein với quá trình methyl hóa gen RASSF1A trên BN ung thư vòm mũi họng.
Trang 1KHẢO SÁT ĐẶC ĐIỂM PHÂN TỬ GEN LMP-1 CỦA
VIRUT EPSTEIN-BARR VÀ METHYL HÓA PROMOTER CỦA GEN
Lê Thanh Hà*; Nguyễn Lĩnh Toàn**; Võ Thị Thương Lan***
Nguyễn Đình Phúc**** * ; Lê Thanh Hòa*****
TÓM TẮT
Từ mô sinh thiết của 15 bệnh nhân (BN) được chẩn đoán ung thư vòm họng (UTVH), tách chiết
ADN hệ gen EBV Bằng phản ứng PCR, dòng hóa và giải trình tự, đã thu nhận được toàn bộ 5 chuỗi
ARN thông tin của gen LMP-1 (1083 - 1182 bp) Kết quả phân tích gen cho thấy vùng exon 1 ổn định
cao và biến đổi tập trung vào các vùng exon 2 và 3 Đồng thời, nghiên cứu đã sử dụng kỹ thuật
Methylation-specific PCR (MSP) để khảo sát mức độ methyl hóa trên 15 mẫu mô bệnh này
trong 15 mẫu bệnh phẩm UTVH, 12 mẫu (80%) có methyl hóa tại các đảo CpG thuộc vùng promoter
của gen RASSF1A Khi so sánh tỷ lệ này với một số công trình nghiên cứu khác trên thế giới, chúng
tôi nhận thấy methyl hóa trong nghiên cứu này chiếm tỷ lệ cao Nghiên cứu đang được tiếp tục triển
khai trên số lượng bệnh phẩm lớn hơn nhằm góp phần giải thích cơ chế bệnh sinh của UTVH do EBV
* Từ khóa: LMP-1; Kỹ thuật MSP; Methyl hóa ADN; Ung thư vòm họng
BARR VIRUS AND METHYLATION AT PROMOTERS OF
RASSF1A FROM samples of NASOPHARYNGEAL
CARCINOMA IN VIETNAM
SUMMARY
Genomic DNA of Epstein-Barr virus was extracted from biopsy tissue of 15 patients with
nasopharyngeal carcinoma (NPC) Using PCR, cloning and sequencing, the entire mRNA of the
LMP-1 gene (1083 - 1182 bp) was obtained The results showed that the genetic analysis of exon 1
has high stability and mutations focused on the exons 2 and 3 We used Methylation-Specific PCR
(MSP) to analyze the methylation in tissues from these patients RASSF1A (tumor suppressor gene)
was selected for examining the methylation Hypermethylation in RASSF1A was found in 12 samples
(80%) Generally, the hypermethylation of this gene in this study were rather high compared with other
equivalent studies Our research is being carried out with larger samples in order to evaluate the use
of DNA methylation status of these candidate genes as a potential biomarker for Vietnamese NPC
* Key words: LMP-1; MSP technique; DNA methylation; Nasopharyngeal carcinoma
* Bệnh viện 103
** Học viện Quân y
**** Viện Tai Mũi Họng Trung ương
***** Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam
Chịu trách nhiệm nội dung khoa học: PGS TS Trần Văn Khoa
TS Nguyễn Đặng Dũng
Trang 2ĐẶT VẤN ĐỀ
Ung thư vòm họng là một khối u ác tính
xuất phát từ lớp biểu mô phủ của vùng vòm
mũi họng Nó là một trong những dạng ung
thư hàng đầu ở các vùng địa lý như Nam
Trung Quốc, Đông Nam Á, Bắc Cực, Trung
Đông, Bắc Phi và Việt Nam UTVH có
nguyên nhân phức tạp và đang được các
nhà khoa học tiếp tục nghiên cứu Hiện nay,
nguyên nhân của bệnh được tập trung
thành ba nhóm chủ yếu là virut Epstein-Barr
(EBV), di truyền và các yếu tố môi trường,
Nhiễm tiềm tàng EBV là hiện tượng khởi
đầu cho quá trình tiến triển ung thư Đặc
trưng của truyền nhiễm EBV chủ yếu là
biểu hiện của gen tiềm tàng, bao gồm
EBNA-1, LMP-1, LMP-2 và EBER [6] Trong
các gen và protein ảnh hưởng đến sự tiến
triển thành ung thư, LMP-1 có vai trò đặc
biệt quan trọng và đã được chứng minh là
có khả năng đơn phương gây ung thư trên
chuột thực nghiệm [6] LMP-1 chính là gen
tiềm ẩn đầu tiên của EBV được phát hiện
có chức năng chuyển đổi dòng và thay đổi
kiểu hình của tế bào [7]
RASSF1A (Ras association domain family
1 isoform A) là một gen ACUT nằm trong
vùng 3p21.3 trên nhiễm sắc thể số 3 của bộ
gen người [4] RASSF1A ức chế sự tăng
trưởng khối u trong cả in vitro, in vivo và
được xem là một gen ACUT điển hình Gen
này được xác định vào năm 2000, nhưng
đến nay đã có hơn 150 nghiên cứu chứng
minh quá trình methyl hóa bất thường xảy
ra tại các đảo CpG thuộc vùng promoter
của RASSF1A diễn ra trong rất nhiều loại
ung thư, như UTVH, phổi, vú, thận, dạ dày,
bàng quang, tế bào thần kinh đệm [1]
Tần số methyl hóa của một số gen có thể phát hiện bằng phương pháp MSP (Methylation-Specific PCR) [5] Phương pháp này dựa trên sự khác biệt giữa các trình tự ADN bị methyl hóa và không methyl sau khi xử lý ADN bằng dung dịch muối natribisulfit Quá trình xử lý ADN bằng natribisulfite làm thay đổi trình tự ADN bằng cách chuyển đổi tất cả cytosin không bị methyl hóa thành uracil, trong khi cytosin
đã bị methyl hóa sẽ không thay đổi Hai cặp mồi đặc hiệu được sử dụng để khuếch đại những vùng gen quan tâm bằng phản ứng PCR
Mục tiêu của đề tài:
- Xác định đặc điểm cấu trúc phân tử gen LMP-1 của một số chủng EBV phân lập
từ BN UTVH ở Việt Nam
- Phân tích liên quan bệnh lý của gen mã hóa LMP-1 protein với quá trình methyl hóa gen RASSF1A trên BN ung thư vòm mũi họng
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU
1 Đối tượng nghiên cứu
Tách chiết 15 mẫu ADN từ mô sinh thiết khối u của BN UTVH ký hiệu: H2, S9, S18, H9, S1, B1, B2, B7, B9, B10, B12, E61,
dựa vào các triệu chứng lâm sàng và kết quả giải phẫu bệnh lý tại Bệnh viện Tai Mũi Họng Trung ương
2 Phương pháp nghiên cứu
* Biến đổi bisulfite:
ADN tổng số sau khi được từ tách chiết
từ 15 mẫu bệnh phẩm chia làm 2 phần: một phần dùng làm khuôn để chạy phản ứng
Trang 3được xử lý với bisulfite và tinh sạch bằng
Epitect Kit (Qiagen, Cat No 59104)
* Thực hiện phản ứng PCR đối với gen
LMP-1 và MSP để khảo sát quá trình
methyl hóa các đảo CpG thuộc vùng
promoter của gen RASSF1A:
Tiến hành phản ứng PCR 15 mẫu cho
cặp mồi LMP1-F và LMP1-R Sản phẩm thu được của 5 mẫu S1, S9, S18, H2, H9 sẽ sử
dụng cho giải trình tự 15 mẫu ADN sau khi
xử lý bằng bisulfite, tiến hành phản ứng MSP với các mồi và điều kiện sau:
Bảng 1: Trình tự nucleotid các cặp mồi cho phản ứng PCR và MSP
94oC 5 phút, 35 chu kỳ gồm các bước: 94 o C 1 phút,
55oC 1 phút, 72 o C 1 phút, 72 o C 10 phút
57oC 30 giây, 72 o C 30 giây, 72 o C 5 phút
63oC 30 giây, 72 o C 30 giây, 72 o C 5 phút
630C 20 phút, 72 0 C 30 phút, 72 0 C 5 phút
60oC 30 giây, 72 o C 30 giây, 72 o C 5 phút
(* Dòng hoá sản phẩm, tách dòng và giải trình trình tự):
Sản phẩm PCR đoạn gen LMP-1 của 5
mẫu S1, S9, S18, H2, H9 sau khi tinh sạch,
được dòng hoá vào plasmid vector pCR2.1
(Invitrogen Inc.) Chọn lọc và tách chiết
ADN plasmid tái tổ hợp theo quy trình
của hãng Bioneer (Hàn Quốc) Trình tự
nucleotid của ADN của plasmid tái tổ hợp
mang khung gen LMP-1 được giải trình trên
máy tự động ABI-3100 Genetic Analyzer
Xử lý chuỗi nucleotid bằng các chương trình
SeqEd1.03, AssemblyLIGN1.9, MacVector
8.2 (Accelrys Inc.) và so sánh đối chiếu
bằng chương trình GENEDOC 2.6.002
(http://www.nrbsc.org/gfx/genedoc/)
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ
BÀN LUẬN
1 Kết quả phân tích đặt điểm gen LMP-1
Để phát hiện gen LMP-1 trong 15 mẫu bệnh phẩm, sử dụng cặp mồi đặc hiệu LMP1-F/LMP1-R Kết quả điện di cho 12
mẫu dương tính (H2, S9, S18, H9, S1, B1,
B2, B7, E61, H14, M12, M14) và 3 mẫu âm tính (B9, B10, B12) với tỷ lệ dương tính là 80% (12/15 BN)
Trang 4Hình 1: Hình ảnh điện di sản phẩm PCR gen LMP-1 với cặp mồi LMP1-F/LMP1-R của 15 mẫu
M: chỉ thị phân tử ADN (ở đây sử dụng hệ gen Lamda cắt bằng enzym giới hạn HindIII); (-):
Đối chứng âm; (+): Đối chứng dương: H2, S9, S18, H9,S1, B1, B2, B7, B9, B10, B12, E61,
H14, M12, M14: sản phẩm chạy PCR của 15 mẫu BN tương ứng
Toàn bộ chuỗi nucleotid của đoạn ADN thu nhận từ 5 mẫu H2, S9, S18, H9,S1 được
giải trình trên máy tự động ABI-3100 Genetic Analyzer
Hình 2, 3 so sánh trình tự nucleotid và axít amin ARN thông tin gen LMP-1 của 5 chuỗi
điểm (point-mutation), hai vùng có sai khác thêm vào - bớt đi giữa các chuỗi: vùng thứ
nhất (nt.861-959) mất 33 nucleotid (nt.861-893) của chuỗi S1 mã hoá cho 11 axít amin
(QDPDNTDDNGP), đồng thời thêm vào 66 nucleotid (nt.894-959) của chuỗi H2 mã hoá cho
23 axít amin (QDPDNTDDNGPQDPDNTDDNGPH); vùng thứ hai (nt.1087-1116) thêm vào
30 nucleotid (nt.1087-1116) của chuỗi S18 mã hoá cho 10 axít amin (HSHDSGNGGG)
Hình 2: So sánh trình tự nucleotid một đoạn gen LMP-1 (800-1302)
của 5 chuỗi H2, S9, S18, H9 và S1
1100 bp
Trang 5Hình 3: So sánh trình tự các axít amin được mã hóa bởi gen LMP-1
của 5 chuỗi H2, S9, S18, H9 và S1
Như vậy, những đột biến mất đoạn của chuỗi S1 (nt.861-893), thêm đoạn của chuỗi H2
(nt 894-959) và S18 (nt.1087-1116) dẫn đến thay đổi lớn về cấu trúc đầu C tận của protein
LMP-1 sản phẩm do gen này mã hóa Vùng này có vai trò rất quan trọng trong cơ chế gây
UTVH của EBV nói chung và của gen LMP-1 nói riêng [6] Một số nghiên cứu đã chứng
minh vai trò của LMP1 trong việc ức chế biểu hiện gen RASSF1A là một gen ức chế ung
thư có vai trò quan trọng trong việc phát triển tế bào ung thư [9]
2 Kết quả khảo sát quá trình methyl hóa các đảo CpG thuộc vùng promoter của gen
Hình 4: Sản phẩm PCR với cặp mồi GL-F/GL-R nhân bản gen β-globin từ khuôn ADN
trước (T) và sau khi xử lý với bisulfite (B) của 5 mẫu H2, S9, S18, H9, S1 Sản phẩm PCR
được điện di trên gel agarose 1,5% L1: Thang chuẩn ADN 100 bp; (-): Đối chứng âm
(không có ADN khuôn); (+): Đối chứng dương (có ADN của gen β-globin)
(+) T B T B T B T B T B (-)
H2 S9 S18 H9 S1
Trang 6Hình 5: Sản phẩm PCR với cặp mồi GL-F/GL-R nhân bản gen β-globin từ khuôn ADN
trước (A) và sau khi xử lý với bisulfite (B) của 10 mẫu: B1, B2, B7, B9, B10, B12, E61, H14, M12, M14 Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose 1.5% (A) hoặc điện di trên gel acrylamide 8% (B); M: Thang chuẩn ADN SY-60 bp; (-): Đối chứng âm (không có ADN khuôn); (+): Đối chứng dương (có khuôn là plasmid mang đoạn gen β-globin)
Kết quả này cho thấy ADN trước xử lý đều cho phép nhân bản một băng ADN đặc hiệu cho gen đơn bản β-globin Các mẫu sau xử lý hầu như không phát hiện được băng nào cho thấy hầu hết ADN tổng số đã được xử lý hoàn toàn với bisulfite
Hình 6: Sản phẩm MSP nhân bản promoter gen RASF1A từ khuôn ADN bị xử lý với
bisulfite của 15 mẫu UTVH với cặp mồi methyl RASSF1A-M210-F/RASSF1A-M211-R Sản phẩm PCR được điện di trên gel acrylamide 12% M: Thang chuẩn ADN SY-100 bp; (-): Đối chứng âm (không có ADN khuôn)
Kết quả cho thấy: 3 mẫu S9, B2 và M14
không bị methyl hóa, 12 mẫu còn lại đều có
methyl ở promoter gen RASSF1A Như vậy,
tỷ lệ methyl hóa tại các đảo CpG thuộc
vùng promoter của gen RASSF1A trong 15
với một số công trình nghiên cứu khác trên
thế giới (từ 50 - 70%) [3]
Mặc dù chưa có sự tương thích tuyệt đối
giữa kết quả chạy PCR gen LMP-1 và
methyl hóa tại các đảo CpG thuộc vùng
promoter của gen RASSF1A trong số 15 mẫu bệnh phẩm UTVH (3 mẫu LMP-1 âm tính B9, B10, B12 vẫn cho kết quả methyl hóa dương tính và ngược lại, 3 mẫu LMP-1 dương tính S9, B2 và M14 vẫn cho kết quả
methyl hóa âm tính), nhưng tỷ lệ dương tính
với LMP-1 và tỷ lệ methyl hóa tại các đảo CpG thuộc vùng promoter của gen RASSF1A trong 15 mẫu nghiên cứu cao (80%), cho thấy sự liên quan giữa 2 quá trình này trong
cơ chế bệnh sinh của UTVH do EBV gây
169 bp
169 bp
- H2 S9 S18 H9 S1 M * M _ B1 B2 _ B7 B9 B10 B12 E61 H14 M12 M14 M
Trang 7nên như một số nghiên cứu đã công bố [9]
Mặt khác, vai trò của LMP-1 gây methyl hóa
các đảo CpG thuộc vùng promoter của gen
RASSF1A còn phụ thuộc vào cấu trúc của
protein LMP-1 liên quan đến đột biến của
gen này [6]
Hình 7: Sản phẩm nested-MSP nhân bản
promoter gen RASF1A từ khuôn ADN bị xử
lý với bisulfite của các mẫu UTVH với cặp
mồi unmethyl Sản phẩm PCR với cặp mồi
dùng làm khuôn với cặp mồi
RASSF1A-Un-F2/RASSF1A-Un-R2 và được điện di trên gel
acrylamide 12% M: Thang chuẩn ADN 100 bp;
(-): Đối chứng âm (không có ADN khuôn)
Kết quả cho thấy tất cả 15 mẫu đều có
băng đặc hiệu cho ADN không bị methyl
hóa Đây là sản phẩm đặc trưng cho tế bào
lành lẫn trong mẫu ung thư Chứng tỏ ADN
được xử lý bisulfite tốt và các cặp mồi được
thiết kế đặc hiệu chính xác đối với vùng
promoter RASSF1A
KẾT LUẬN
Gen LMP-1 của 5 chuỗi H2, S9, S18,
H9, S1 được dòng hóa và giải trình tự gen,
qua phân tích kết quả cho thấy trên gen
LMP-1 tồn tại ngoài những đột biến điểm
thường gặp, còn có những đột biến mất
đoạn nucleotid (nt.861-893) chuỗi S1 dẫn
đến mất 11 axít amin (QDPDNTDDNGP)
và thêm đoạn chuỗi H2 (nt 894-959), S18 (nt.1087-1116) dẫn đến thêm các đoạn axít amin tương ứng là 23 axít amin
10 axít amin (HSHDSGNGGG)
Kết quả nghiên cứu methyl hóa tại các đảo CpG thuộc vùng promoter của gen
RASSF1A cho thấy: trong số 15 mẫu bệnh phẩm UTVH, 12 mẫu dương tính (80%),
tỷ lệ này cũng cao tương đương với tỷ lệ dương tính gen LMP-1 trong các mẫu sinh thiết UTVH là 80% (12/15 BN) Khi so sánh
tỷ lệ này với một số công trình nghiên cứu khác trên thế giới, chúng tôi nhận thấy tỷ lệ
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Role of the Ras-association domain family 1
Cancer Res 2005, 65, pp.3497-3508
2 Brooks J, Cairns C, Zeleniuch J Promoter
methylation, the detection of breast cancer Cancer Causes Control 2009, 20 (9), pp.1539-1550
3 Challouf S, Ziadi S, Zaghdoudi R, Ksiaa F, Ben Gacem R, Trimeche M Patterns of aberrant
DNA hypermethylation in nasopharyngeal carcinoma
in Tunisian patients Clin Chim Acta 2012, Apr,
413 (7-8), pp.795-802
4 Donninger H, Vor MD, Clark GJ The
RASSF1A tumor suppressor Journal of Cell Science 2007, 120, pp.3163-3172
5 Herman JG, Graff JR, Myöhänen S, Nelkin
BD, Baylin SB Methylation-specific PCR: a
novel PCR assay for methylation status of CpG islands Proc Natl Acad Sci U S A 1996, Sep,
93 (18), pp.9821-9826
Trang 86 Kaye KM, Izumi KM, Kieff E Epstein-Barr
virus latent membrane protein 1 is essential for
B lymphocyte growth transformation Proc Natl
Acad Sci USA 1993, 90, pp.9150-9154
7 . Kilger E, Kieser A, Baumann M,
Hammerschmidt W Epstein-Barr virus-mediated
B-cell proliferation is dependent upon latent
membrane protein 1, which stimulates an
activated CD40 receptor EMBO J 1998, 17,
pp.1700-1709
8 Lo KW, Chung GT, To KF Deciphering
the molecular genetic basis of NPC through
molecular, cytogenetic and epigenetic approaches
Semin Cancer Biol 2012, Apr, 22 (2), pp.79-86
9 Man C, Rosa J, Lee LT, Lee VH, Chow BK,
Lo KW, Doxsey S, Wu ZG, Kwong YL, Jin DY, Cheung AL, Tsao SW Latent membrane protein
1 suppresses RASSF1A expression, disrupts microtubule structures and induces chromosomal aberrations in human epithelial cells Oncogene
2007, May, 26 (21), pp.3069-3080
10 Nephew KP, Huang TM Epigenetic gene
silencing in cancer initiation, progression Cancer Letters 2002, 190, pp.125-133
Ngày nhận bài: 26/10/2012 Ngày giao phản biện: 5/1/2013 Ngày giao bản thảo in: 6/2/2013