Nghiên cứu được tiến hành với mục tiêu nhằm xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cao chiết hoàng liên giải độc thang bằng phương pháp phân tích hóa học kết hợp kỹ thuật sắc ký lớp mỏng để định tính chế phẩm, đồng thời xác định hàm lượng berberin - hoạt chất alkaloid có tác dụng chính- trong bài thuốc.
Trang 1SƠ BỘ XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN CƠ SỞ CAO CHIẾT
TỪ HOÀNG LIÊN GIẢI ĐỘC THANG
Trần Thu Nga*, Nguyễn Phương Dung *
TÓM TẮT
Đặt vấn đề - Mục đích nghiên cứu: Hoàng liên giải độc thang (HLGĐ) là bài thuốc thanh nhiệt giải độc có
xuất xứ từ Trung Quốc, được ghi trong tác phẩm Ngoại đài bí yếu của tác giả Vương Đảo (Nhà Đường) Bài thuốc được sử dụng rộng rãi trong nhân dân để điều trị một số bệnh viêm nhiễm như viêm phổi, mụn nhọt, kiết lỵ… Nhiều công trình nghiên cứu đã chứng minh bài thuốc có hiệu quả trong điều trị đái tháo đường, viêm đường ruột, bệnh Alzheimer, xơ vữa động mạch, ung thư… trên thực nghiệm Để tiện lợi trong việc sử dụng bài thuốc trong nghiên cứu và điều trị, chúng tôi xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cao chiết HLGĐ bằng phương pháp phân tích hóa học kết hợp kỹ thuật sắc ký lớp mỏng để định tính chế phẩm, đồng thời xác định hàm lượng Berberin -hoạt chất alkaloid có tác dụng chính- trong bài thuốc
Đối tượng – phương pháp phương tiện nghiên cứu: Dược liệu được khoa Dược- Cơ sở 3 Bệnh viện Đại
học Y Dược TP HCM cung cấp Áp dụng các phương pháp phân tích thành phần hóa thực vật bằng các phản ứng hóa học và kỹ thuật sắc ký lớp mỏng, xác định hàm lượng alkaloid bằng kỹ thuật quang phổ
Kết quả: Cao HLGĐ có độ ẩm trung bình 31,91 % và độ tro toàn phần trung bình là 8,46% Xác định sự
hiện diện alkaloid và flavonoid trong cao HLGĐ Kỹ thuật sắc ký lớp mỏng xác định được cao HLGĐ có đủ 4 dược liệu cấu thành bài thuốc Hàm lượng Berberin trong cao là 0,852%
Kết luận: Việc dùng phương pháp hóa học và sắc ký lớp mỏng, đồng thời xác định hàm lượng Berberin đã
góp phần xây dụng tiêu chuẩn cơ sở cao HLGĐ
Từ khóa: Hoàng liên giải độc thang, tiêu chuẩn hoá, sắc ký lớp mỏng
ABSTRACT
PRELIMINARY CONSTRUCTION OF BASIC STANDARD FOR
“HUANG LIAN JIE DU TANG” EXTRACT
Tran Thu Nga, Nguyen Phuong Dung
* Y Hoc TP Ho Chi Minh * Vol 18 - Supplement of No 1 – 2014: 203 - 208
Background- Objectives: Huang lian jie du tang (HLJDT) is a traditional remedy originated from China,
that was commented in Ngoai dai bi yeu by Vuong Dao It is used widely to treat some infectious diseases such as pneumonia, furuncles, dysentery…Many studies have demonstrated that HLJDT is effective in treating diabetes, enteritis, Alzheimer, atherosclerosis, cancer on experimentation In order to make HLJDT more convenient in research and treatment, we establish the basic standards of HLJDT extract by applying the chemical reaction method associated with thin layer chromatography fingerprints method for qualitative determination As well, berberin - an alkaloid – main active compound of the remedy- was determined
Methods: Crude drugs of HLJDT remedy were supplied by Pharmaceutical Ward of University Medical
Center HoChiMinh City Chemical reactions and TLC- fingerprints were used as method for determining the chemical components Berberin was determined by means of the spectral methods
∗ Khoa YHCT, Đại học Y Dược, TP Hồ Chí Minh
Địa chỉ liên hệ: Bs Trần Thu Nga ĐT: 0989231241 Email: thunga149@yahoo.com
Trang 2Results: The average humidity of HLJDT is 31.91% and the average complete ash-content is 8.46% There
are alkaloid and flavonoid in the product TLC of HLJDT extract revealed all four crude drugs Berberin concentration in the product is 0.852%
Conclusion: It could be applied chemical reaction method, thin layer chromatography fingerprints method
and berberin determination to standardize the HLJDT extract
Keywords: Huang lian jie du tang, standardization, thin layer chromatography.
ĐẶT VẤN ĐỀ
Hoàng liên giải độc thang (gồm 4 vị thuốc:
Hoàng liên (Rhizoma Coptidis), Hoàng cầm (Radix
Scutellariae ), Hoàng bá (Cortex Phellodendri) và
Chi tử (Fructus Gardeniae)) là bài thuốc cổ
phương có tác dụng thanh nhiệt giải độc Bài
thuốc có xuất xứ từ Trung Quốc, được ghi trong
tác phẩm Ngoại đài bí yếu của tác giả Vương
Đảo (Nhà Đường)(1) Công dụng bài thuốc được
ghi trên một số tài liệu ứng dụng điều trị một số
bệnh viêm nhiễm như viêm phổi, mụn nhọt, kiết
lỵ…(1, 7) Nhiều công trình nghiên cứu đã chứng
minh bài thuốc có hiệu quả trong điều trị đái
tháo đường, viêm đường ruột, bệnh Alzheimer,
xơ vữa động mạch…trên thực nghiệm (3,5,8,9) Một
nghiên cứu gần đây kết luận tác dụng bài thuốc
gây ra sự chết theo chương trình và sự ngừng
chu kỳ tế bào ở dòng tế bào ung thư gan in vitro
và in vivo (4).. Ngoài ra, trên mô hình gây độc
bằng cyclophosphamid, cao chiết Hoàng liên giải
độc thang đã cho thấy có tác dụng bảo vệ gan,
chống oxy hóa, giải độc (6) Để thuận lợi cho việc
nghiên cứu và sử dụng bài thuốc trong điều trị,
chúng tôi áp dụng phương pháp phân tích hóa
học kết hợp với kỹ thuật sắc ký lớp mỏng và
định lượng hoạt chất berberin chính trong cao
HLGĐ để xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cao chiết
bài thuốc
ĐỐI TƯỢNG – PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Nguyên liệu
Các dược liệu Hoàng liên (Rhizoma
Coptidis) , Hoàng cầm (Radix Scutellariae),
Hoàng bá (Cortex Phellodendri) và Chi tử
(Fructus Gardeniae) được cung cấp bởi khoa
Dược- Cơ sở 3- Bệnh viện Đại học Y Dược TP
HCM Mỗi dược liệu được chuẩn hoá theo quy
định về kiểm tra chất lượng thuốc của Dược điển Việt Nam 4
Phương pháp
Điều chế cao chiết bài thuốc
Chiết xuất dược liệu bằng phương pháp sắc trong dung môi nước Sau khi thu được dịch chiết, tiến hành lọc và cô cách thủy để thu được cao HLGĐ
Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cao chiết bài thuốc (2)
Độ ẩm
Cân chính xác khoảng 0,5 g cao vào một chén cân, đem sấy ở 1050C trong tủ sấy dưới
áp suất thường đến khối lượng không đổi Tính độ ẩm:
100
a
b a H a: khối lượng bột dược liệu trước khi sấy (g); b: khối lượng bột dược liệu sau khi sấy (g); H%: độ ẩm (kl/kl)
Độ tro toàn phần
Cân chính xác khoảng 0,5 g cao cho vào chén nung Trải đều dược liệu ở đáy chén và đốt cẩn thận trên bếp điện cho đến khi dược liệu cháy hoàn toàn và chén không còn bốc khói
Dùng kẹp sắt dài đưa chén vào lò nung ở 500- 600 0C cho đến khi vô cơ hóa hoàn toàn (tro không còn màu đen) Dùng kẹp sắt lấy chén nung ra, để nguội khoảng 30 phút trong bình hút
ẩm Cân và ghi lại lượng cân
Đặt chén đựng tro vào lò nung và lại tiếp tục nung ở nhiệt độ trên trong 1 giờ nữa Lấy chén ra, để nguội khoảng 30 phút trong bình hút ẩm Cân
Tiếp tục làm như vậy đến khi kết quả 2 lần cân liên tiếp, khối lượng chén có tro (a) chênh
Trang 3lệch không quá 0,5 mg Tro toàn phần tính trên
dược liệu khô kiệt theo công thức:
100
h c c
b a
A
×
−
×
−
=
A%: tro toàn phần (%) của dược liệu; a: khối lượng chén có
tro; b: khối lượng chén không; c: khối lượng dược liệu dùng;
h: độ ẩm (%) của dược liệu
Định tính
Phương pháp hóa học:
Hợp chất alkaloid:
Lấy 0,5 g cao, chiết siêu âm 15 phút với
H2SO4 5% (3lần x 5ml), lọc qua giấy lọc, dịch lọc
H2SO4 5% chia vào 3 ống nghiệm để làm phản
ứng với TT Mayer, Dragendroff, Bouchardat và
quan sát màu của ống nghiệm sau phản ứng
Hợp chất flavonoid:
Lấy 1 g cao, chiết siêu âm 15 phút với 20 ml
MeOH, lọc Dịch lọc được cô đến cắn Hoà cắn
với 15ml ethanol, siêu âm cho tan hết cắn, lọc
Dịch lọc chia vào 3 ống nghiệm làm phản ứng
với NaOH 10%, FeCl3 3% trong cồn và thuốc thử
chì acetat Quan sát màu của ống nghiệm sau
phản ứng chứng minh flavonoid (+): phản ứng
với NaOH 10% cho dung dịch màu cam, phản
ứng với FeCl3 3% cho dung dịch màu xanh đậm
và với thuốc thử chì acetat cho dung dịch, màu
trắng đục
Phương pháp sắc kí lớp mỏng:
Sắc ký lớp mỏng được thực hiện trên bản
mỏng tráng sẵn Silicagel 60F254 (Merck) Lấy
khoảng 0,1 g mỗi dược liệu, cho vào cốc có mỏ
50 ml, thêm vào 10ml MeOH, siêu âm 15 phút,
lọc Tập trung lọc cô còn 1ml làm dung dịch
chấm sắc ký, so sánh với dịch chiết dược liệu
làm đối chiếu trên sắc ký lớp mỏng với các hệ
dung môi tương thích được tham khảo trong
các dược điển
Định lượng
Hàm lượng berberin trong cao HLGĐ được
xác định dựa vào đường cong chuẩn độ của
berberin chuẩn trong methanol trên máy quang
phổ tử ngoại khả kiến Thermo Spectromic HEλIOS
Xác định đỉnh hấp thu cực đại:
Đỉnh hấp thu cực đại của berberin chuẩn
trong methanol là λmax = 266 nm
Xây đựng đường chuẩn berberin
Thiết lập giai mẫu Cân chính xác 2 mg berberin chuẩn, hòa tan
trong 10 ml methanol và cho vào bình định mức
10 ml (dung dịch chuẩn A) Dùng micro pipette lấy chính xác dung dịch chuẩn A có thể tích lần lượt là: 150 µl, 200 µl, 250 µl, 300 µl, 350 µl, 400
µl cho vào bình định mức 10 ml, thêm methanol tới vạch, lắc đều, tiến hành đo quang trên máy quang phổ tử ngoại khả kiến Thermo Spectromic HEλIOS tại đỉnh hấp thu cực đại λmax = 266 nm
Mẫu thử
Cân chính xác khoảng 100 mg cao, cho vào bình nón có dung tích 100 ml, chiết siêu âm nhiều lần bằng methanol cho đến khi dịch chiết
methanol không còn phản ứng của chất berberin
Dịch chiết cô còn khoảng 10 ml và cho vào bình định mức 10 ml, lắc đều Dùng micro pipet hút chính xác 500 µl dịch chiết cho vào bình định mức 10 ml và thêm methanol tới vạch, lắc đều, tiến hành đo quang trên máy quang phổ tử ngoại khả kiến Thermo Spectromic HEλIOS tại đỉnh hấp thu cực đại λmax = 266 nm
Bảng 1 Mật độ quang của giai mẫu berberin chuẩn
Bình định mức berberinHàm lượng
(µg/ml)
Mật độ quang (OD)
1
2
3
4
5
6
3 µg
4 µg
5 µg
6 µg
7 µg
8 µg
0,262 0,340 0,421 0,491 0,566 0,636
Công thức tính hàm lượng berberin trong
mẫu thử: dựa vào đường chuẩn y= 0,0748x + 0,0413
6
10 5
, 0
100 0748
, 0
0413 , 0
p
b A
Trang 4A t : Độ hấp thu của mẫu thử b: Khối lượng 100 g
cao HLGĐT khô kiệt (g) p: Khối lượng cao
HLGĐT đem thử đã trừ ẩm (g)
Biểu đồ 1 Đường chuẩn của dung dịch chuẩn berberin
KẾT QUẢ
Bào chế cao HLGĐ
Sơ đồ 1 Qui trình bào chế cao HLGĐ
Hiệu suất chiết cao: 18,13%
Bã dược liệu
80 0C -1000C
10 lít nước
60 phút
Dịch chiết 2
1200 ml
Dịch chiết 1
5000 ml nước
30 phút
Dịch chiết 1+2
Lọc
Cô cách thủy
R 2 = 0,9994
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
HÀM LƯỢNG (µg/ ml)
Cao HLGĐ (650g) Dược liệu
2440 g
Trang 5Độ ẩm cao HLGĐ
Bảng 2 Độ ẩm của cao HLGĐ
Khối lượng Cao HLGĐT(g) 0,5183 0,4998 0,5078
Độ ẩm (%) 32,22 31,63 31,88
Trung bình (%) 31,91
Tro toàn phần cao HLGĐ
Bảng 3 Độ tro toàn phần của cao HLGĐ
Cao Lần 1 Lần 2 Lần 3
Khối lượng Cao HLGĐT (g) 0,5254 0,5512 0,5390 Tro toàn phần (%) 8,36 8,31 8,72 Trung bình (%) 8,46
Định tính
- Phương pháp hóa học: Hợp chất flavonoid
và alkaloid: dương tính
- Phương pháp sắc kí lớp mỏng:
Bảng 4 Sắc ký đồ của cao HLGĐ so với nguyên liệu đối chiếu
Nguyên liệu Hệ dung môi khai triển Phát hiện Số vết của nguyên
liệu đối chiếu
Số vết của cao
Số vết trùng giữa nguyên liệu với cao
Hoàng liên
n-butanol:acid acetic:nước (7 : 1 : 2)
Phun TT Dragendorff và quan sát dưới ánh sáng thường và đèn UV λ= 366 nm
Hoàng bá
n-butanol:acid acetic:nước (7 : 1 : 2)
Phun TT Dragendorff và quan sát dưới ánh sáng thường và đèn UV λ= 366 nm
Hoàng cầm
Toluen : ethyl acetat : acid formic (2 : 3 : 2.2)
Phun FeCl 3 và quan sát dưới ánh sáng thường và đèn UV λ= 366 nm
Chi tử
Ethyl acetat : aceton : acid formic : nước (5 : 5 : 1 : 1)
Phun H 2 SO 4 quan sát dưới ánh sang thường và đèn UV
λ=366nm
Kết quả phân tích bằng sắc ký lớp mỏng đã
chứng minh Cao Hoàng Liên giải độc thang có
sự hiện diện của các dược liệu: Hoàng liên,
Hoàng bá, Hoàng cầm, Chi tử Chứng tỏ phương
pháp chiết xuất giữ được các thành phần chủ
yếu của công thức cổ truyền
Định lượng
Hàm lượng berberin trong cao HLGĐ
Bảng 5 Hàm lượng berberin trong cao HLGĐ
STT
Khối lượng
Mẫu chưa
trừ ẩm (g)
Khối lượng Mẫu thử đã trừ ẩm (g)
Mật độ quang
Hàm lượng berberin trong cao HLGĐT khô kiệt (%)
1 0,1178 0,0802 0,282 0,802
2 0,1073 0.0730 0,276 0,858
3 0,1187 0.0808 0,312 0,895
Trung bình 0,852
BÀN LUẬN
Kết quả định tính bằng phương pháp hóa
học cho thấy cao HLGĐ có hiện diện hợp chất
flavonoid, alkaloid và kết quả sắc ký lớp mỏng
(Bảng 4) có sự hiện diện của cả 4 dược liệu cấu
thành bài thuốc giúp khẳng định phương pháp
chiết xuất có hiệu quả
Kết quả nghiên cứu hàm lượng berberin trong cao HLGĐ thu được là 0,852 % chiếm tỷ lệ 62,29 % - 84,35 % so với hàm lượng berberin dự đoán Như vậy, kết quả định lượng cao HLGĐ cho thấy phương pháp chiết xuất thu được gần hết thành phần alkaloid có trong dược liệu Cao HLGĐ đã được xây dựng tiêu chuẩn chất lượng về độ ẩm (Bảng 2), độ tro toàn phần (Bảng 3), hàm lượng berberin (Bảng 5) cho phép đánh giá tính ổn định của chế phẩm, bảo đảm tính chính xác của các kết quả mà nghiên cứu thu được Qui trình bào chế cao HLGĐ (Sơ đồ 1) đơn giản, có hiệu quả, dễ thực hiện và dễ ứng dụng trong sản xuất sau này
KẾT LUẬN
Cao HLGĐ có độ ẩm trung bình 31,91 % và
độ tro toàn phần trung bình là 8,46%
Định tính bằng phương pháp hóa học cho thấy cao HLGĐ có sự hiện diện của hợp chất flavonoid và alkaloid Trên sắc kí đồ của cao HLGĐ xác định sự hiện diện của 4 dược liệu: Hoàng liên, Hoàng bá, Hoàng cầm, Chi tử
Trang 6Hàm lượng Berberin trong cao HLGĐ trung
bình là 0,852%
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1 Bộ Y Tế (2008) Y lý y học cổ truyền Nhà xuất bản Y Học, tr 91,
148, 149
2 Bộ Y Tế (2009) Dược điển Việt Nam IV Nhà xuất bản Y Học, tr
733, 778, 779, 783
3 Fang Q, Zhan XP, Mo JL, Sun M (2004) “The effect of Huanglian
jiedu tang on Alzheimer's disease and its influence on
cytokines” Zhongguo Zhong Yao Za Zhi, vol 29(6), pp 575-578
4 Hsu YL, Kuo PL, Tzeng TF, Sung SC, Yen MH, Lin LT, Lin CC
(2008) “Huang-lian-jie-du-tang, a traditional Chinese medicine
prescription, induces cell-cycle arrest and apoptosis in human
liver cancer cells in vitro and in vivo” J Gastroenterol Hepatol, vol
23, pp 290-299
5 Mizukawa H, Yoshida K, Honmura A, Uchiyama Y, Kaku H,
Nakajima S, Haruki E (1993) “The effect of orengedokuto on
experimentally-inflamed rats” Am J Chin Med, vol 21(1), pp 71-78
6 Trần Thu Nga, Nguyễn Phương Dung (2012) Nghiên cứu tác
dụng chống oxy hóa của cao chiết Hoàng liên giải độc trên
chuột nhắt tổn thương gan bởi cyclophosphamid Y học TP Hồ
Chí Minh, tập 16, phụ bản của số 1, tr 157-161
7 Trần Văn Kỳ (2008) 250 bài thuốc đông y cổ truyền chọn lọc Nhà
xuất bản Thanh Niên, tr 49
8 Watanabe-Fukuda Y, Yamamoto M, Miura N, Fukutake M,
Ishige A, Yamaguchi R, Nagasaki M, Saito A, Imoto S, Miyano S, Takeda J, Watanabe K (2009) “Orengedokuto and berberine improve indomethacin-induced small intestinal injury via
adenosine” J Gastroenterol, vol 44(5), pp 380-389
9 Yu YL, Lu SS, Yu S, Liu YC, Wang P, Xie L, Wang GJ, Liu XD (2009) “Huang-lian-jie-du-decoction modulates glucagon-like
peptide-1 secretion in diabetic rats, Ethnopharmacol, vol 124(3),
pp 444- 449
Ngày phản biện nhận xét bài báo: 15/10/2013,
17/10/2013