Đề tài này được thực hiện với mục tiêu khảo sát tác dụng của cao chiết cồn và cao chiết nước từ lá đại bi trên thực nghiệm gây tăng acid uric cấp và mạn. Mời các bạn cùng tham khảo bài viết để nắm rõ nội dung chi tiết.
Trang 1NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG HẠ ACID URIC MÁU CỦA CAO CHIẾT
TỪ LÁ ĐẠI BI (BLUMEA BALSAMIFERA L (DC), ASTERACEAE)
TRÊN THỰC NGHIỆM
Lê Thị Minh Dung*, Nguyễn Thị Thu Hương*
TÓM TẮT
Mục tiêu nghiên cứu: Nhiều công trình nghiên cứu đã chứng minh các cao chiết từ Đại bi (Blumea balsamifera) có hoạt tính ức chế xanthine oxidase (XO), ức chế sự phát triển của các tế bào ung thư, tác dụng kháng viêm, kháng khuẩn Đề tài này được thực hiện với mục tiêu khảo sát tác dụng của cao chiết cồn và cao chiết nước từ lá Đại bi trên thực nghiệm gây tăng acid uric cấp và mạn
Đối tượng-Phương pháp nghiên cứu: Cao cồn được chuẩn bị bằng cách chiết ngấm kiệt bột nguyên liệu
qua hai giai đoạn là cồn 48% và nước Cao nước được chuẩn bị bằng cách đun nguyên liệu 2 lần với nước nóng
ở 100°C Nghiên cứu in vitro: khảo sát hoạt tính ức chế XO Nghiên cứu in vivo: Các cao thử được cho
uống một liều duy nhất hay uống dự phòng 5 ngày trước khi gây mô hình gây tăng acid uric cấp trên chuột nhắt trắng bằng kali oxonat (tiêm phúc mô 300 mg/kg) Ở mô hình gây tăng acid uric mạn bằng cách tiêm cách nhật liều kali oxonat giảm dần (từ 300 mg/kg xuống 150 mg/kg), các cao thử được cho
uống liên tục trong 7-14 ngày Allopurinol được sử dụng làm đối chiếu dương.
Kết quả: Kết quả nghiên cứu in vitro cho thấy cao cồn và cao nước có hoạt tính ức chế XO với IC 50 lần lượt
là 170,7µg/ml và 170,5µg/ml Ở mô hình gây tăng acid uric cấp, cao cồn (liều 1,27g/kg và 2,55g/kg) và cao nước (liều 2,5g/kg và 1,25g/kg) uống một liều duy nhất hay uống dự phòng 5 ngày đều có tác dụng làm giảm hàm lượng acid uric trong huyết tương. Ở mô hình gây tăng acid uric mạn, các cao chiết cồn và nước
làm giảm hàm lượng acid uric trong huyết tương ở ngày 7 và 14 hiệu quả hơn so với kết quả trên mô hình gây tăng acid uric cấp
Kết luận: Cao chiết từ lá Đại bi có hoạt tính ức chế xanthine oxidase và có tác dụng hạ acid uric máu trên
thực nghiệm gây tăng acid uric cấp và mạn Kết quả này làm cơ sở cho các nghiên cứu ứng dụng Đại bi trong hỗ trợ điều trị bệnh gout
Từ khóa: Đại bi, ức chế xanthine oxidase, tác dụng hạ acid uric máu
ABSTRACT
EXPERIMENTAL STUDY ON HYPOURICEMIC EFFECT OF BLUMEA BALSAMIFERA EXTRACTS
Le Thi Minh Dung, Nguyễn Thị Thu Huong
* Y Hoc TP Ho Chi Minh * Vol 16 - Supplement of No 1 – 2012: 169 - 174
Objectives: The extracts of Blumea balsamifera have been reported that they have xanthine oxidase (XO)
inhibitory activity, cytotoxic activity, inflammatory and antimicrobial effects The aim of the study is to examine the effect of ethanol and aqueous extracts of Blumea balsamifera leaves on potassium oxonate-induced hyperuricemic model in mice
Methods: Blumea balsamifera leaves was extracted firstly by 48% ethanol and next by water to yield ethanol
Trung Tâm Sâm và Dược liệu Tp Hồ Chí Minh-Viện Dược liệu
Tác giả liên lạc: PGS.TS Nguyễn Thị Thu Hương ĐT:38298530 Email: huongsam@hotmail.com
Trang 2extract Aqueous extract was prepared by boiling material twice in water for 1 hour For in vitro study, XO inhibitory activity of test extracts were examined For in vivo study, the test extracts were orally pretreated in a single dose or in repeated doses for 5 days before potassium oxonate (300 mg/kg)-induced acute hyperuricemic model In potassium oxonate-induced chronic hyperuricemic model, potassium oxonate was injected once per two-day in gradually decreased doses (total 7 doses from 300 mg/kg to 150 mg/kg) and the test extracts were orally treated for 7 to 14 days Allopurinol was used as positive control
Results: In vitro study showed that test extracts exhibited strong XO inhibitory activity with IC 50 values of 170.7 µg/ml for ethanol extract and 170.5 µg/ml for aqueous extract In potassium oxonate-induced acute hyperuricemic model, ethanol extract (1.27 g/kg and 2.55g/kg) and aqueous extract (1.25g/kg and 2.5g/kg) significantly decreased plasma uric acid level as compared to hyperuricemic control In potassium oxonate-induced chronic hyperuricemic model, hypouricemic effects of ethanol extract and aqueous extract after treatment
for 7 to 14 days were more effective than those in acute hyperuricemic model
Conclusion: The extracts of Blumea balsamifera leaves exhibited XO inhibitory activity and hypouricemic
effects on potassium oxonate-induced hyperuricemic models The findings will be useful for advanced clinical
study on treatment of gout and related symptoms
Keywords: Blumea balsamifera leaves, xanthine oxidase inhibitory activity, hypouricemic effect
ĐẶT VẤN ĐỀ
Chứng tăng acid uric máu và một trong
những hậu quả của nó là bệnh gout (thống
phong) ngày càng trở nên phổ biến trong xã hội
hiện nay Việc nghiên cứu điều trị gout bằng
dược liệu thiên nhiên thay thế cho các dạng
thuốc tổng hợp ngày càng được quan tâm bởi có
ưu thế là ít tác dụng phụ Ở Việt Nam theo kinh
nghiệm dân gian, cây Đại bi chữa trị rất nhiều
bệnh: cảm cúm, ho, long đàm, sổ mũi, đau răng,
đau ngực, đau dạ dày, đau lưng, đau bụng sau
khi sinh, đau bụng kinh, dùng ngoài chữa vết
thương, viêm mủ da, điều trị bệnh trĩ, chữa đau
cơ, đau khớp…(6) Lá cây Đại bi có tính kháng
khuẩn, kháng nấm, giải nhiệt, hạ sốt và làm
giảm đau…Những nghiên cứu thực nghiệm in
vitro chứng minh Đại bi có hoạt tính chống oxy
hóa, hoạt tính ức chế xanthine oxidase, hoạt tính
kháng khuẩn, kháng nấm, hoạt tính độc tế bào
trên các tế bào ung thư máu, tế bào ung thư biểu
mô gan và có tác dụng kháng viêm, kháng
khuẩn in vivo (3, 4) Kế thừa và phát triển từ các kết
quả nghiên cứu thực nghiệm này, đề tài được
thực hiện với mục tiêu khảo sát tác dụng của
cao chiết cồn và cao chiết nước từ lá Đại bi trên
thực nghiệm gây tăng acid uric cấp và mạn
nhằm góp phần làm cơ sở cho các nghiên cứu ứng dụng Đại bi trong hỗ trợ điều trị bệnh gout
ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tượng nghiên cứu
Lá Đại bi (Blumea balsamifera (L.) DC), họ Cúc
(Asteraceae), nguồn gốc Lâm Đồng, mua tại nhà thuốc Kim Anh, Hải Thượng Lãn Ông, Quận 5, Tp.HCM Dược liệu được xay nhỏ, bảo quản nơi khô mát
Động vật nghiên cứu
Chuột nhắt trắng đực, chủng Swiss albino, 5-6
tuần tuổi, trọng lượng trung bình
20 ± 2 g, được cung cấp bởi Viện Vắc xin và Sinh phẩm Y tế – TP Nha Trang và được để ổn định
ít nhất một tuần trước khi thử nghiệm Chuột được nuôi đầy đủ bằng thực phẩm viên và nước uống đầy đủ Thể tích cho uống các cao thử nghiệm hay tiêm phúc mô là 10 ml/kg thể trọng chuột
Thuốc thử nghiệm
Cao cồn được chuẩn bị bằng cách chiết ngấm kiệt bột nguyên liệu qua hai giai đoạn là cồn 48% và nước theo tỷ lệ 1:10 (dược liệu:dung môi), dịch chiết được cô giảm áp thu được cao cồn với hiệu suất chiết là 28% Cao nước được chuẩn bị bằng cách đun nguyên liệu 2 lần với
Trang 3nước nóng, mỗi lần trong 1 giờ ở 100°C theo tỷ
lệ 1:15 (dược liệu:dung môi), dịch chiết được cô
cách thủy thu được cao nước với hiệu suất chiết
là 17,8% Các cao chiết được hòa tan trong nước
cất và cho chuột nhắt trắng uống với thể tích là
10 ml/kg thể trọng chuột
Thuốc đối chiếu Allopurinol (Công ty
Domesco, Việt Nam, số lô 010111, hạn sử dụng:
17/01/14) Xanthine (Sigma, USA); Kali oxonat
(Sigma-Aldrich, USA); Kit định lượng acid uric
(URIC ACID liquicolor, Human ltd.Co., Đức)
Phương pháp nghiên cứu
Phương pháp nghiên cứu in vitro
Phương pháp xác định hoạt tính ức chế
Tiến hành
Chuẩn bị dịch enzym: Nghiền đồng thể gan
trong đệm phosphat-EDTA pH 7,4 Ly tâm dịch
đồng thể với tốc độ 15000 vòng/phút trong 15
phút x 3 lần ở 4oC, hút lấy dịch trong làm dịch
enzym cho các phản ứng xúc tác
Quy trình thử hoạt tính ức chế xanthine
oxidase theo bảng:
Bảng 1: Quy trình thực hiện phản ứng xúc tác in
vitro
ủ 15 phút
Tổng thể tích phản ứng: 3000 µl
Mẫu trắng được tiến hành tương tự nhưng
thay enzym và mẫu thử bằng đệm Mẫu chứng
có dịch enzym nhưng không có mẫu thử mà
thay bằng đệm Để có cơ sở đánh giá hoạt tính
ức chế của mẫu thử khảo sát đối với enzyme
xanthine oxidase, sử dụng allopurinol với 4
nồng độ 0,625; 1,25; 2,5; 5 μg/ml làm chất đối
chứng dương Đo mật độ quang ở bước sóng
290 nm liên tục mỗi 3 phút trong 30 phút tính từ
lúc cho xanthine vào cuvet
Tính toán kết quả
Các số liệu kết quả thử nghiệm được biểu thị bằng trị số trung bình của 3 lần đo khác nhau Các nồng độ mẫu trong phản ứng được tính theo công thức sau:
C pư = C gốc × 600 ÷ 3000
Trong đó
C pư :Nồng độ mẫu trong phản ứng (μg/ml)
Cgốc :Nồng độ mẫu pha loãng ban đầu (μg/ml)
600: Thể tích mẫu cho vào cuvet (μl) 3000: Tổng thể tích phản ứng (μl)
Sự thay đổi nồng độ acid uric được tính theo công thức sau:
∆C uric = ∆OD 290 nm ÷ 12,2 × 1000
Trong đó
∆C uric : Giá trị thay đổi nồng độ acid uric
(μM)
∆OD 290nm : Giá trị thay đổi mật độ quang ở
290 nm
12,2: Hằng số hấp thu phân tử của acid uric
ở 290 nm (lit/[mmol×cm])
Khả năng ức chế enzym XO được tính theo công thức sau:
I% = 100% × (∆C uric/chứng - ∆C uric/thử ) ÷ ∆C uric/chứng
Trong đó
I%: Khả năng ức chế enzyme XO của mẫu
thử
∆C uric/chứng : Giá trị thay đổi nồng độ acid uric
của cuvet chứng sau 30 phút (μM)
∆C uric/thử : Giá trị thay đổi nồng độ acid uric
của cuvet mẫu sau 30 phút (μM) Giá trị IC50 μg/ml (nồng độ có khả năng ức chế 50%) của mẫu được tính dựa trên đồ thị hồi quy tương quan giữa nồng độ (Cpư) và khả năng
ức chế (I%)
Phương pháp nghiên cứu in vivo
Phác đồ điều trị dự phòng
Trang 4Chuột nhắt trắng được chọn một cách ngẫu
nhiên để chia thành các lô (mỗi lô 10 con) bao
gồm:
Lô bình thường (chứng sinh lý): uống nước
cất 4 ngày Ngày 5 tiêm phúc mô NaCl 0, 9%,
uống nước cất
Lô chứng bệnh lý: uống nước cất 4 ngày
Ngày 5 tiêm phúc mô kali oxonat 300 mg/kg, 1
giờ sau uống nước cất
Lô thử: uống cao 4 ngày Ngày 5 tiêm phúc
mô kali oxonat 300 mg/kg, 1 giờ sau uống cao
Lô đối chiếu: uống nước cất 4 ngày Ngày 5
tiêm phúc mô kali oxonat 300 mg/kg, 1 giờ sau
uống allopurinol 10mg/kg
Vào ngày thứ 5, 2 giờ sau khi tiêm kali
oxonat, tiến hành lấy máu đuôi chuột để định
lượng hàm lượng acid uric trong huyết tương
theo hướng dẫn của Kit ACID URIC
LIQUICOLOR (Human Diagnostic Ltd Co.,
Germany) trên máy phân tích sinh hóa bán tự
động Screen Master 3000
Phác đồ thử nghiệm điều trị cấp
Chuột nhắt trắng được chọn một cách ngẫu
nhiên để chia thành các lô (mỗi lô 10 con) tương
tự như 4.2.1.1 nhưng chỉ cho chuột uống nước
cất, cao hoặc thuốc một liều duy nhất 1 giờ sau
khi tiêm phúc mô kali oxonat và tiến hành lấy
máu đuôi chuột 2 giờ sau khi tiêm để định
lượng acid uric trong huyết tương
Chuột được chia thành các lô (mỗi lô 10
con), bao gồm:
Lô bình thường (chứng sinh lý): uống nước
cất trong 7-14 ngày
Lô chứng bệnh lý: tiêm phúc mô kali oxonat
cách ngày, bắt đầu từ liều 300 mg/kg (ngày 1),
giảm dần xuống 250 mg/kg (ngày 3), 200 mg/kg
(ngày 5) và duy trì ở liều 150 mg/kg (ngày 7, 9,
11, 13) Chuột được cho uống nước cất hàng
ngày trong 7-14 ngày
Lô thử: Gây mô hình tương tự như lô chứng
bệnh lý Chuột được cho uống các cao thử hàng
ngày trong 7-14 ngày
Lô đối chiếu: Gây mô hình tương tự như lô chứng bệnh lý Chuột được cho uống allopurinol 10mg/kg vào ngày 7 và ngày 14 Lấy máu đuôi chuột ở các thời điểm ngày 1,7, 14 để định lượng acid uric trong huyết
tương
Đánh giá kết quả
Các số liệu được biểu thị bằng trị số trung bình: M ± SEM (Standard error of the mean – sai
số chuẩn của giá trị trung bình) và xử lý thống
kê dựa vào phép kiểm One–Way ANOVA và Student-Newman-Keuls test (phần mềm Jandel Scientific SigmaStat) Kết quả thử nghiệm đạt ý nghĩa thống kê với độ tin cậy 95% khi P < 0,05 so
với lô chứng
KẾT QUẢ-BÀN LUẬN
Kết quả nghiên cứu in vitro
Bảng 2: Kết quả khảo sát khả năng ức chế enzym
xanthine oxidase in vitro
Hoạt tính
ức chế
XO (I%)
Nồng độ mẫu (µg/ml)
Hoạt tính enzyme xanthine oxidase (XO) được định nghĩa là khả năng chuyển hóa cơ chất xanthine sinh ra acid uric trong đơn vị thời gian (phút) Bằng phương pháp đo tốc độ sinh ra acid uric khi cho một lượng cơ chất xanthine vào dịch chiết enzym từ gan trong điều kiện thích hợp có thể xác định được hoạt tính XO Chất có khả năng ức chế hoạt tính XO sẽ làm giảm tốc độ sinh ra acid uric Thuốc đối chiếu allopurinol có khả năng ức chế XO ở nồng độ rất thấp và cho kết quả IC50 = 0, 1225 μg/ml Hoạt
tính ức chế XO in vitro của cao cồn và cao nước
yếu hơn so với allopurinol với IC50 lần lượt là 170,7 μg/ml và 170,5 μg/ml
Kết quả tác dụng hạ acid uric máu của các cao chiết trên mô hình gây tăng acid uric cấp ở chuột nhắt trắng
Trang 5Bảng 3: Hàm lượng acid uric máu ở các lô thử
nghiệm trên mô hình gây tăng acid uric cấp bằng kali
oxonat ở chuột nhắt trắng
(g/kg)
Điều trị cấp Hàm lượng acid uric (g/dl)
Điều trị dự phòng Hàm lượng acid uric (g/dl)
Chứng bình
#P 0,001: So với lô bình thường; *P 0,01: So với lô
chứng bệnh lý; **P<0,001: So với lô chứng bệnh lý
Lô chứng tiêm kali oxonat có lượng acid uric
tăng 69,7-76,1%, đạt ý nghĩa thống kê so với lô
bình thường chứng tỏ kali oxonat với liều 300
mg/kg tiêm phúc mô có tác dụng ức chế enzyme
uricase, làm tăng hàm lượng acid uric trong
máu Lô thuốc đối chiếu allopurinol có hàm
lượng acid uric giảm 53,4% đạt ý nghĩa thống kê
so với lô chứng tiêm kali oxonat Cao cồn (liều
2,552g/kg và 1,276 g/kg) và cao nước Đại bi (liều
2,5 g/kg và 1,25 g/kg) cho uống liều duy nhất 1
giờ sau khi tiêm kali oxonat (điều trị cấp) hay
uống hàng ngày trong 5 ngày (điều trị dự
phòng) đều làm giảm hàm lượng acid uric máu
đạt ý nghĩa thống kê so với lô chứng tiêm kali
oxonat
So sánh giữa khả năng làm giảm hàm lượng
acid uric của các liều của cao cồn và cao nước
thì thấy có sự tương đương về tác dụng làm
giảm hàm lượng acid uric giữa hai dạng cao
chiết So sánh thống kê giữa hai liều cao cồn Đại
bi (2,552g/kg và 1,276g/kg) và cao nước Đại bi
(liều 2,5 g/kg và 1,25 g/kg) cho thấy việc làm
giảm hàm lượng acid uric không khác nhau có ý
nghĩa thống kê giữa các liều này và ở cả hai
phác đồ điều trị cấp và dự phòng Cho nên có
thể chọn cao cồn hoặc cao nước Đại bi trong cả
hai phác đồ điều trị tăng acid uric cấp và dự
phòng Tác động hạ acid uric máu của các cao
chiết từ lá Đại bi yếu hơn thuốc đối chiếu
allopurinol, nhưng có ưu điểm là hạn chế được các tác dụng phụ và tương tác thuốc trong điều trị Allopurinol có thể làm bùng phát bệnh viêm khớp gout trong khi mức acid uric huyết đang bước đầu được điều chỉnh và tránh không bắt đầu dùng allopurinol trong khi viêm hoạt động
vì thuốc có thể làm nặng và kéo dài cơn viêm khớp gout cấp Allopurinol có thể gây nhiễm độc gan và tương tác với một số kháng sinh Kết quả tác dụng hạ acid uric máu của các cao chiết trên mô hình gây tăng acid uric mạn ở chuột nhắt trắng
Bảng 4: Hàm lượng acid uric máu ở các lô thử
nghiệm trên mô hình gây tăng acid uric mạn bằng kali oxonat ở chuột nhắt trắng
Lô
N =10
Liều TN (g/kg)
Hàm lượng acid uric (g/dl)
Chứng bình thường
-
0,03
0,11#
2,35 ± 0,10#
2,19 ± 0,07#
Cao cồn
0,07*
1,73 ± 0,07*
1,76 ± 0,06*
0,05*
1,93 ± 0,09*
1,92 ± 0,06*
Cao nước
0,09*
1,81 ± 0,07*
1,43 ± 0,06*
0,10*
1,89 ± 0,11*
1,86 ± 0,07*
0,05**
1,09 ± 0,03**
1,05 ± 0,05**
# P 0,001: So với lô bình thường
* P 0,01: So với lô chứng bệnh lý
** P<0,001: So với lô chứng bệnh lý
Lô chứng tiêm kali oxonat có lượng acid uric tăng 69,8% (ngày 1), 95,8% (ngày 7) và 69,8% (ngày 14), đạt ý nghĩa thống kê so với lô bình thường chứng tỏ kali oxonat tiêm cách nhật trong 7-14 ngày có tác dụng ức chế enzyme uricase, làm tăng hàm lượng acid uric trong máu Cao cồn (liều 2,552g/kg và 1,276 g/kg) và cao nước Đại bi (liều 2,5 g/kg và 1,25 g/kg) cho uống 1 ngày, 7 ngày hay kéo dài đến 14 ngày đều làm giảm hàm lượng acid uric máu đạt ý nghĩa thống kê Cao cồn liều 2,552 g/kg và cao nước liều 2,5 g/kg có khuynh hướng làm giảm hàm lượng acid uric mạnh hơn liều còn lại và
Trang 6hiệu quả tăng hơn ở ngày 7 và 14 so với chỉ
uống cao một ngày Vì allopurinol chỉ sử dụng
làm giảm acid uric cấp nên chỉ cho chuột uống
vào các ngày 1, 7 và 14, kết quả hàm lượng acid
uric của lô cho uống allopurinol hầu như tương
đồng nhau cho dù có tiêm kali oxonat 1 lần (mô
hình tăng acid uric cấp) hay lặp lại nhiều lần
(mô hình tăng acid uric mạn) Tác động hạ acid
uric máu của các cao chiết từ lá Đại bi yếu hơn
allopurinol
KẾT LUẬN
Cao chiết từ lá Đại bi có hoạt tính ức chế
xanthine oxidase và có tác dụng hạ acid uric
máu trên mô hình thực nghiệm gây tăng acid
uric cấp và mạn Kết quả này làm cơ sở cho các
nghiên cứu ứng dụng Đại bi trong hỗ trợ điều
trị bệnh gout
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1 Fazilatun N, Zhari I, Nornisah M (2010), Xanthine oxidase
inhibitory activities of extracts and flavonoids of the leaves of
Blumea balsamifera, Pharm Biol., 48(12), pp 1405-1412
2 Mai Thanh Thi Nguyen, Suresh Awale, Yasuhiro Tezuka, Liying Shi, Syed Faisal Haider Zaidi, Jun-ya Ueda, Quan Le Tran, Yukihisa Murakami, Kinzo Matsumoto, and Shigetoshi Kadota
(2005), Hypouricemic Effects of Acacetin and
4,5-O-Dicaffeoylquinic Acid Methyl Ester on Serum Uric Acid Levels
in Potassium Oxonate-Pretreated Rats”, Biol Pharm Bull., 28(12), pp 2231—2234
3 Nguyễn Thị Mai Hương, Nguyễn Thị Thanh Mai, Nguyễn Anh Thy, Đặng Bích Phượng, Trần Hoài Thu, Nguyễn Thị Thanh Trúc (2007), Bước đầu khảo sát thành phần hóa học và hoạt tính
ức chế enzyme xanthine oxidase của cây Đại bi (Blumea balsamifera), họ Cúc (Asteraceae), Báo cáo khoa học, Hội nghị
‘Ngày Khoa học TP HCM lần 5’, hội Hóa Học TP.HCM, trang 84-89
4 Nguyễn Thị Nghi Trung, Nguyễn Phương Dung (2010), Nghiên cứu tác dụng kháng viêm, kháng khuẩn của dịch chiết lá Đại Bi
(Blumea balsamifera) trên chuột nhắt trắng”, Tạp chí Y Học
TP.HCM, tập 14, phụ bản của số 2, tr 101-105
5 Watanabe S, Kimura Y, Shindo K, and Fukui T (2006), Effect of Human placenta extract on potassium oxonate-induced elevation of blood uric acid concentration, Journal of Health Science, 52 (6), pp 738-742
6 Viện Dược liệu (2003), Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam, Nhà xuất bản Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội, tập 1, tr
722-724