Đột biến p53 được nhận biết trong nhiều loại bướu, thể hiện tính bất ổn bằng cách cho phép tích lũy những thay đổi về di truyền do quá trình sinh ung tạo ra. Vì vậy nghiên cứu này tìm hiểu tỉ lệ và kiểu đột biến của gen p53 trong ung thư niêm mạc miệng ở người Việt Nam.
Trang 1GIẢI TRÌNH TỰ CHUỖI DNA PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN GEN P53
TRONG UNG THƯ NIÊM MẠC MIỆNG
Trần Thị Kim Cúc*, Nguyễn Thị Hồng*
TÓM TẮT
Mở đầu: Đột biến p53 được nhận biết trong nhiều loại bướu, thể hiện tính bất ổn bằng cách cho phép tích
lũy những thay đổi về di truyền do quá trình sinh ung tạo ra
Mục tiêu: Nghiên cứu này tìm hiểu tỉ lệ và kiểu đột biến của gen p53 trong ung thư niêm mạc miệng ở
người Việt Nam
Đối tượng và phương pháp: Sử dụng kỹ thuật giải trình tự trực tiếp để phân tích vùng bảo tồn của gen
p53 từ exon 5 đến exon 8 trong ung thư tế bào gai nguyên phát ở hốc miệng của 109 bệnh nhân, và tìm hiểu mối liên quan giữa đột biến gen p53 với những thói quen nguy cơ ung thư như hút thuốc, uống rượu, nhai trầu
Kết quả: Tỉ lệ đột biến gen 53 là 47,7% Về kiểu đột biến, 62,2% là đột biến sai nghĩa; 18,9% đột biến vô
nghĩa; 9,4% đột biến mất đoạn gen; 5,7% đột biến ghép nối sai; 1,9% đột biến thêm đoạn gen và 1,9% đột biến trong khung Đa số là đột biến chuyển vị G:C>A:T (40,0%) và đột biến chuyển dạng G:C>T:A (25,5%) Tỉ lệ đột biến gen p53 ở những người có thói quen hút thuốc lá cao hơn có ý nghĩa so với ở những người không có thói quen này (p<0,05)
Kết luận: Nghiên cứu cho thấy vai trò của thuốc lá trong sự sinh ung thư và ảnh hưởng của thuốc lá đến
kiểu đột biến và phổ đột biến đặc hiệu của gen p53 ở bệnh nhân ung thư niêm mạc miệng
Từ khóa: Đột biến gen p53, giải trình tự DNA, ung thư niêm mạc miệng
ABSTRACT
DETECTION OF P53 GENE MUTATIONS IN ORAL CANCER BY DNA SEQUENCING
Tran Thi Kim Cuc, Nguyen Thi Hong
* Y Hoc TP Ho Chi Minh * Vol 15 - Supplement of No 2 - 2011: 119 - 127
Background: p53 gene mutation observed in many tumors, expresses instability by allowing the
accumulation of genetic alterations occurring in this multistep process
Objectives: The present study was conducted to investigate the incidence and patterns of p53 mutation in
patients with oral cancer
Materials and methods: DNA sequencing was used to explore the conserved region of the p53 gene (exon
5-8) in primary oral squamous cell carcinoma (OSCC) specimens from 109 patients Then, the correlation between p53 mutations and risk habits of oral cancer such as tobacco smoking, alcohol drinking and betel chewing was analyzed
Results: The result showed that 47.7% had p53 gene mutations at exon 5-8 Of which, 62.2% were
missense mutations, 18.9% were nonsense encoding translational stop codons, 9.4% were deletions, 5.7% were splice-site mutations, 1.9% was insertion, and 1.9% was inframe mutation G:T>A:T transitions and G:C>T:A transversions were the predominant mutations (65,5%) p53 gene mutation significantly related to tobacco smoking habit (p< 0.05)
*: Khoa RHM – Đại học Y Dược Tp Hồ Chí Minh
Trang 2Conclusion: This study suggested an important contributing role of tobacco to p53 gene mutation and that
tobacco might induce specific patterns and spectrums of mutations in oral cancer patients
Key words: p53 gene mutations, DNA sequencing, oral cancer
ĐẶT VẤN ĐỀ
Ung thư là bệnh lý do những thay đổi về
mặt tế bào qua một loạt đột biến ở các gen đặc
hiệu, làm tăng sinh tế bào không kiểm soát
được Nguyên nhân của những thay đổi này do
tiếp xúc với một hay nhiều các tác nhân hóa học
hay vật lý, gây ra các lỗi trong quá trình sao
chép hay các lỗi trong quá trình sửa chữa DNA
Đột biến ở các gen kiểm soát chu kỳ tế bào và
đường dẫn truyền tín hiệu sửa chữa DNA là
những sự kiện bắt đầu và cần thiết của quá trình
sinh ung thư(5)
Những nghiên cứu gần đây cho thấy bất
hoạt các gen đè nén bướu là yếu tố quan
trọng trong quá trình sinh ung thư nhiều
bước Có nhiều gen đè nén bướu liên quan
đến các bướu ác tính khác nhau, cũng như
liên quan đến ung thư niêm mạc miệng
(UTNMM) Sự thay đổi gen đè nén bướu p53
là yếu tố di truyền được nói đến nhiều nhất
trong các loại ung thư ở người Các nghiên
cứu cho thấy tỉ lệ đột biến gen này thay đổi
từ 30-70% trong ung thư đầu cổ(2,4)
Gen p53, nằm trên nhiễm sắc thể 17, có 11
exon mã hóa cho protein ở nhân tế bào có trọng
lượng phân tử 53 kDa, được biết đến với chức
năng điều hòa sự tăng sinh tế bào Khi tế bào bị
tổn thương DNA, protein p53 làm dừng chu kỳ
tế bào ở pha G1 nhằm khởi động quá trình sửa
chữa DNA, hoặc quá trình chết tế bào theo lập
trình Do có vai trò quan trọng trong điều hòa
chu kỳ tế bào, gen p53 ảnh hưởng nhiều đến quá
trình điều trị ung thư như hóa trị hay xạ trị(1)
Phân tích các kiểu đột biến gen p53 giúp
nhận biết vị trí đột biến và làm rõ hơn chức năng
của protein p53 đột biến, chức năng này thường
bị bất hoạt trong tế bào ung thư Ngoài ra, các
kiểu đột biến có thể thay đổi tùy thuộc vào bản
chất của các yếu tố bệnh căn, và cho thấy phổ
đột biến của gen p53 có thể là dấu ấn sinh học
liên quan đến các tác nhân môi trường Đa số đột biến xảy ra từ exon từ 5 đến exon 8 của gen
p53, nằm ở vị trí đặc hiệu của gen- chính là khu
vực kết nối với DNA(9) Nghiên cứu này khảo sát
sự thay đổi của gen p53 trong UTNMM ở người
Việt Nam, với các mục tiêu sau:
- Xác định tỉ lệ đột biến gen p53 trong
UTNMM
- Xác định tỉ lệ các kiểu đột biến gen p53
trong UTNMM
- Phân tích mối liên quan giữa đột biến gen
p53 với các thói quen nguy cơ UTNMM (hút
thuốc, uống rượu, nhai trầu)
ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Mẫu nghiên cứu
Mẫu nghiên cứu về lâm sàng, giải phẫu bệnh và sinh học phân tử gồm 109 bệnh nhân được chẩn đoán xác định là UTNMM và được điều trị tại Bệnh viện Ung bướu Tp.HCM trong năm 2009 và 2010
Tiêu chuẩn chọn bệnh
- Có tổn thương ung thư nguyên phát ở hốc miệng
- Có chẩn đoán giải phẫu bệnh là carcinôm
tế bào gai
- Có trả lời phỏng vấn trực tiếp về các thói quen ăn trầu, hút thuốc, uống rượu
- Có hồ sơ bệnh án đầy đủ
- Chưa được điều trị ung thư đặc hiệu
Thiết kế nghiên cứu
Cắt ngang, mô tả và phân tích
Qui trình nghiên cứu
- Ghi nhận qua phỏng vấn trực tiếp các dữ liệu của bệnh nhân và thói quen hút thuốc, uống rượu, nhai trầu
- Khám và đánh giá lâm sàng
Trang 3- Đánh giá cận lâm sàng: giải phẫu bệnh,
chụp phim tia X, siêu âm, nội soi tai mũi họng,
xét nghiệm máu, nước tiểu, v.v…
- Chẩn đoán và điều trị ung thư (theo hồ sơ
bệnh án của bệnh viện)
- Mẫu mô lấy từ bệnh phẩm sinh thiết hay
phẫu thuật bướu nguyên phát được cố định,
vùi nến và nhuộm Hematoxylin- Eosin thường
qui tại Bệnh viện ung bướu để khảo sát giải
phẫu bệnh
- Tiến hành các kỹ thuật sinh học phân tử
gồm ly trích DNA từ mẫu mô sinh thiết ở tổn
thương hốc miệng và giải trình tự chuỗi DNA
tại phòng thí nghiệm sinh học phân tử- Đại học
Y Dược TP HCM
Bước 1: Ly trích DNA
Ly trích DNA từ mẫu mô sinh thiết một phần ở tổn thương ung thư bằng bộ ly trích Roche theo chỉ dẫn của nhà sản xuất
Bước 2: Phản ứng chuỗi polymerase (PCR)
- Do đa số đột biến gen p53 xảy ra ở exon 5
đến exon 8, nên nghiên cứu này chỉ khảo sát đột
biến từ exon 5 đến exon 8 của gen p53
- Dùng 4 cặp mồi để khuếch đại các exon 5,
6, 7 và 8 của gen p53 (các đoạn mồi được thiết kế
bằng phần mềm Oligo 4.1 dựa trên trình tự
chuẩn của gen p53 có mã số NG.017013 trong
GenBank) Trình tự các nucleotid của các đoạn mồi như sau:
Tên mồi Trình tự mồi (5’3’) Exon được khuếch đại Kích thước sản phẩm PCR (bp)
P53, 5-6R CACTGACAACCACCCTTAAC
P53seq7F GTGCTAGGAAAGAGGCAAGG
- Chuẩn bị 20μl hỗn hợp cho PCR gồm có:
2μl dung dịch đệm 1X, 2μl các deoxyribo
nucleotid triphosphat (dNTP), 0,15μl Takara HS
Taq DNA polymerase (5 unit/μl), 1μl đoạn mồi
cùng chiều, 1μl đoạn mồi ngược chiều, 12,85μl
nước cất và 1μl DNA đã ly trích
Chương trình PCR
980C x 2 phút
98 0 C x 10 giây
600C x 30 giây
720C x 2 phút
45 chu kỳ nhiệt
720C x 5 phút
- Một đợt thí nghiệm PCR luôn có một
chứng dương đã biết cho kết quả PCR (+) và
một chứng âm thay thế mẫu DNA ly trích
bằng nước cất
- Kết quả PCR được đánh giá bằng cách điện
di trên gel agarose 1,2% có nhuộm ethidium
bromide trong khoảng 20 phút và đọc kết quả
Nếu vạch của DNA khảo sát ở cùng mức với
vạch của chứng dương và có số base đọc ở thang
kích thước DNA phù hợp thì kết quả PCR (+),
cho biết đã khuếch đại được exon mong muốn
Bước 3: Giải trình tự các nucleotid trên chuỗi DNA và đọc kết quả
Đầu tiên tinh sạch sản phẩm PCR: sử dụng
bộ xét nghiệm của QIA gen (QIAquick Gel Extraction kit)
Thực hiện PCR qua 25 chu kỳ nhiệt để khuếch đại đoạn trên DNA cần xác định trình tự
Thành phần phản ứng Thể tích
Big Dye terminator V.3.1 4 l Primer (10µM) 0,3 l 1X seq buffer 12,7 µl Sản phẩm PCR đã tinh sạch 3 l
Chương trình PCR
960C x 2 phút
960C x 10 giây
500C x 5 giây
60 0 C x 4 phút
25 chu kỳ nhiệt
Kết tủa DNA bằng ethanol
- 20μl sản phẩm DNA trên được thêm 75μl ethanol 100% và 15μl5M NH4OAC Ly tâm 14.000 vòng/phút trong 15 phút Thêm 300μl ethanol 70%, quay ly tâm 14.000 vòng/phút
Trang 4trong 10 phút Đổ dịch nổi, lấy cặn lắng và để
khô tự nhiên
- Hòa tan tủa trong 20μl dung dịch đệm
Formamide
- Biến tính DNA ở 95C trong 2 phút và làm
lạnh đột ngột để tách thành các chuỗi đơn Lấy
10μl dung dịch đệm chứa DNA đưa vào giếng
đặt vào máy giải trình tự
Giải trình tự và đọc kết quả
- Đoạn DNA chứa 4 exon được chia thành 2
đoạn nhỏ, đoạn chứa exon 5 và 6; đoạn chứa
exon 7 và 8
- Mỗi đoạn DNA này được giải trình tự hai
chiều với đoạn mồi cùng chiều và đoạn mồi
ngược chiều
- Trình tự các nucleotid trên chuỗi DNA
được phân tích qua máy giải trình tự DNA tự
động (ABI 3100 Genetic Analyser) Nếu có đột
biến thì sẽ phát hiện tạị một vị trí có hai
nucleotid thay vì chỉ có một nucleotid như bình
thường, do mẫu DNA được định chuỗi có chứa
những chuỗi bình thường và chuỗi đột biến Kết
quả cũng được đối chiếu với trình tự các
nucleotid trên DNA bình thường (mã số
NG.017013) để xác định chính xác các nucleotid
bị đột biến
- Dữ liệu đột biến được tra cứu theo dữ liệu
của IARC (R15- năm 2010)
Thống kê và xử lý dữ liệu
Các dữ liệu được nhập bằng phần mềm
Excel và được xử lý bằng phần mềm SPSS 16.0
Mối liên quan giữa các thói quen với đột biến
gen p53 được xác định qua phép kiểm χ2, liên
quan có ý nghĩa khi giá trị p<0,05
KẾT QUẢ Đặc điểm mẫu khảo sát
109 bệnh nhân có tuổi từ 29 đến 78 tuổi, với
độ tuổi trung bình 59 ±12 tuổi, trong đó 95 bệnh nhân (87,2%) trên 45 tuổi
Có 75 bệnh nhân nam (68,8%) và 34 nữ (31,2%), tỉ lệ nam:nữ là 2,2:1
Các vị trí bướu theo thứ tự giảm dần là lưỡi (43,1%), sàn miệng (23,9%), nướu răng (18,3%), niêm mạc má (7,4%), khẩu cái (4,5%) và môi (2,8%)
Bướu ở giai đoạn trễ (III và IV) chiếm tỉ lệ 80,73%
Có 78 bệnh nhân (73 nam và 5 nữ), chiếm tỉ
lệ 71,5% có thói quen hút thuốc, 64 bệnh nhân nam có thói quen hút thuốc kèm theo uống rượu (58,7 %)
16 bệnh nhân nữ (14,7%) có thói quen nhai trầu
Đột biến gen p53 trong UTNMM
Kết quả ở bảng 1 cho thấy trong 109 bệnh nhân UTNMM, có 52 bệnh nhân có đột biến gen
p53, chiếm tỉ lệ 52/109 (47,7%) Trong đó, một
bệnh nhân có hai đột biến khác nhau trên cùng một exon Như vậy, tổng cộng có 53 đột biến
được phát hiện trên các exon 5-8 của gen p53
Trong số 53 đột biến, đột biến gen p53 xuất
hiện nhiều nhất trên exon 5, gồm 24 trường hợp (45,3%) Có 33 vị trí codon bị đột biến, trong đó hai vị trí axít amin bị đột biến nhiều nhất là Arg175 và Tyr 205, cùng có tỉ lệ 7,6% Đột biến ở Tryp146, Val157 và Arg196 cùng chiếm tỉ lệ 5,7% Các vị trí đột biến Ala159, Val 216, Gly 245, Gly 266 và Arg 282 xuất hiện với tỉ lệ 3,8% Các
vị trí codon khác chỉ xuất hiện một lần, tỉ lệ xuất hiện là 1,9%
Bảng 1: Đột biến gen p53 trong UTNMM
Mã số
BN Tuổi Exon Codon Đột biến nucleotid
Thay đổi nucleotid
Thay đổi acid amin
Kiểu đột biến
*
Trang 5Mã số
BN Tuổi Exon Codon Đột biến nucleotid
Thay đổi nucleotid
Thay đổi acid amin
Kiểu đột biến
*
Trang 6Mã số
BN Tuổi Exon Codon Đột biến nucleotid
Thay đổi nucleotid
Thay đổi acid amin
Kiểu đột biến
*
15 76 Intron 6 GAGgtc GAGttc G T IVS6+1G>T S
٭: M: đột biến sai nghĩa, N: đột biến vô nghĩa, F: đột biến dịch khung, I: đột biến trong khung, S: đột biến ghép nối sai
Các kiểu đột biến gen p53
Các đột biến chủ yếu là dạng đột biến điểm,
chiếm tỉ lệ 81,1%, bao gồm đột biến sai nghĩa
(62,2%) và đột biến vô nghĩa (18,9%) Đột biến
dịch khung chiếm tỉ lệ 11,3%, bao gồm đột biến
mất hay đột biến thêm đoạn gen Các đột biến
ghép nối sai tại vị trí ghép nối intron và exon
chiếm tỉ lệ 5,7%
Đột biến chuyển vị chiếm 52,7%, chủ yếu là
dạng G:C>A:T Đột biến chuyển dạng với tỉ lệ
34,6%, chủ yếu là dạng G:C>T:A
Bảng 2: Các kiểu đột biến ở Exon 5-8 và phổ đột biến
của gen p53 trong 109 bệnh nhân UTNMM
Đột biến gen p53 Số ca (%)
Kiểu đột biến 43 (81,1)
Đột biến sai nghĩa 10 (18,9)
Đột biến vô nghĩa 06 (11,3)
Đột biến mất 01 (1,9)
Đột biến thêm 01 (1,9)
Phổ đột biến 14 (25,4)
Chuyển vị 08 (14,6)
Đột biến gen p53 Số ca (%)
G:C>A:T 07 (12,7) G:C>A:T tại vị trí CpG 19 (34,6)
A:T>G:C 03 (5,5)
G:C>C:G 01 (1,8)
A:T>T:A 06 (10,9)
A:T>C:G 01 (1,8)
Khuyết đoạn gen Thêm đoạn gen
Liên quan giữa đột biến gen p53 với các
thói quen nguy cơ của UTNMM
Tỉ lệ đột biến gen p53 ở người hút thuốc là
53,8% (42/78 ca), trong đó ở người hút thuốc và uống rượu là 50% (32/64 ca)
Tỉ lệ đột biến gen p53 ở người nhai trầu là
43,8% (7/16 ca), trong đó 2 người nhai trầu và
hút thuốc đều có đột biến gen p53 (100%)
Nhóm bệnh nhân có thói quen hút thuốc có
tỉ lệ đột biến gen p53 cao hơn có ý nghĩa thống
kê so với nhóm 31 bệnh nhân không có thói
quen này (p<0,05)
Tỉ lệ đột biến gen p53 ở bệnh nhân có thói
quen nhai trầu (43,8%), cao hơn nhóm 15 bệnh nhân không có thói quen này (33,3%), nhưng sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê (p>0,05)
Bảng 3: Liên quan giữa đột biến gen p53 với các thói
quen nguy cơ của UTNMM
Trang 7Thói quen Tổng
Số ca
Đột biến
gen p53 (+)
Đột biến
gen p53 (+)
Giá trị p
Số
ca %
Số
ca %
Hút thuốc 78 42 53,8 36 46,2
0,042 Không thói quen 31 10 32,3 21 67,7
Nhai trầu (nữ) 16 7 43,8 9 56,2
0,552 Không thói quen
(nữ) 15 05 33,3 10 66,7
BÀN LUẬN
Tỉ lệ đột biến gen p53
Theo số liệu mới nhất về đột biến gen p53
của tổ chức quốc tế nghiên cứu về ung thư
(IARC) năm 2010 (dữ liệu R15), tỉ lệ đột biến gen
p53 trong ung thư đầu cổ nói chung là 43%(14)
Trong UTNMM, tỉ lệ này thay đổi từ 5,4% đến
67% tùy từng nghiên cứu(8) Sự khác biệt nhiều
có thể do sự khác biệt về vị trí ung thư và thói
quen nguy cơ(2,4) Đột biến gen p53 khá phổ biến
ở Nhật Bản, Pháp, Mỹ (53,3%), nơi mà hút thuốc
và uống rượu được xem là những yếu tố nguy
cơ chính trong UTNMM Kết quả tỉ lệ đột biến
gen p53 trong nghiên cứu này là 47,7%, cao hơn
so với nhiều nước phổ biến thói quen nhai trầu
như Ấn độ (17%-24%)(2,7), nhưng tương tự kết
quả nghiên cứu tại Đài Loan (48,86%) Nghiên
cứu đầu tiên về đột biến gen p53 ở Việt nam trên
18 bệnh nhân UTNMM phát hiện tỉ lệ đột biến
gen p53 là 44,4%(8) Điều này cho thấy gen p53 dễ
bị đột biến ờ người Việt Nam trong quá trình
sinh ung thư ở hốc miệng
Vị trí exon và codon đột biến
PCR và định trình tự chuỗi DNA được sử
dụng để phát hiện trực tiếp kiểu đột biến gen
Các đột biến điểm làm thay đổi chỉ một
nucleotid trong tổng số 23.000 nucleotid trong
gen Đột biến gen p53 thường được tìm thấy
trong 280 trên 393 codon cần thiết cho sự tổng
hợp protein Điều này làm cho chẩn đoán đột
biến trở nên khó khăn hơn, vì vùng phân tích
hầu như trải dài trên toàn bộ gen Nhiều nhóm
nghiên cứu chỉ tập trung trên exon 5-8, vì
80-90% đột biến xảy ra tại các vị trí exon này Kỹ
thuật phân tử khá phức tạp nhưng đây là
phương tiện chẩn đoán duy nhất để xác định chính xác loại đột biến(1,11)
Trong nghiên cứu này, tỉ lệ đột biến gen p53
ở các exon 5, 6, 7, 8 lần lượt là 45,2%, 22,6%, 15,1% và 11,3%
Nhiều nghiên cứu ghi nhận exon 5 dễ bị đột biến nhất(7,13), trong khi một số nghiên cứu cho thấy exon 8 lại là vùng đích dễ bị đột biến(8) Nghiên cứu về cấu trúc đã cho thấy các codon mã hóa các axít amin trong các vùng đột biến nóng chủ yếu ở vùng trung tâm (vị trí từ a.a.102-292), chỉ một số ít các đột biến nằm ở vùng điều hòa (đầu cùng N từ a.a 1-99 và đầu cùng C từ a.a 301-393) Một số codon cho thấy
có tần suất đột biến cao, với 28% đột biến ảnh
hưởng đến chỉ 6 vị trí của gen p53, như Arg175,
Gly245, Arg248, Arg249, Arg273 và Arg282 Các
vị trí axít amin đột biến thường gặp (điểm nóng)
là vùng DNA dễ bị tổn thương hoặc là bộ mã di truyền mã hóa cho một acid amin chủ chốt trong vùng thực hiện chức năng sinh học của protein, hoặc cả hai(1,6) Nghiên cứu này cũng tìm thấy 3 điểm nóng thường gặp nhất là Arg175, Gly245
và Arg282, chiếm tỉ lệ 15,2%
Kiểu đột biến gen p53
Đặc điểm của kiểu hình đột biến gen p53
thường gặp là đột biến sai nghĩa Kết quả nghiên cứu từ exon 5 đến exon 8 cho thấy đa số (62,3%)
là đột biến sai nghĩa Theo Stojnev(12), hơn 75%
đột biến gen p53 gây ra sự thay đổi một axít
amin riêng lẻ, dẫn đến sự tổng hợp protein có chiều dài đầy đủ và ổn định, nhưng mất chức năng gắn DNA đặc hiệu và tích lũy trong nhân
tế bào bướu Kết quả bất hoạt protein p53 do đột biến gây ra sự thay thế axít amin làm cho nhiều
tế bào buớu có biểu hiện protein p53 đột biến Những protein này thường ổn định hơn protein nguyên thủy, và hiện diện ở mức cao hơn trong
tế bào bướu(1) Trong các đột biến, 20-25% ảnh hưởng trên
sự tổng hợp protein không toàn vẹn Thông thường các loại đột biến này là đột biến vô nghĩa, tạo thành sự dừng codon, hoặc là dạng
Trang 8khuyết/thêm gen một đoạn nhỏ, dẫn đến những
đột biến dịch khung(12) Chúng tôi tìm thấy tỉ lệ
30,2% các đột biến vô nghĩa và đột biến dịch
khung Các đột biến dịch khung xảy ra thường
xuyên trong ung thư đầu cổ hơn các vị trí ung
thư khác(2)
Đột biến ghép nối sai tại các vị trí intron–
exon chiếm 5,7% các loại đột biến, phù hợp với
quan điểm của các tác giả cho rằng đột biến
ghép nối sai trên gen p53 có thể gặp trong ung
thư miệng hầu(14)
Liên quan giữa tỉ lệ đột biến gen p53 với
các thói quen nguy cơ của UTNMM
Đột biến gen xảy ra ở 53,8% bệnh nhân hút
thuốc có kèm uống rượu, khác biệt có ý nghĩa so
với bệnh nhân không có thói quen này (p<0,05)
Brennan phát hiện 42% UTNMM có đột biến
gen p53 xảy ra ở 58% bệnh nhân hút thuốc và
uống rượu, 33% bệnh nhân hút thuốc, 17% bệnh
nhân không thói quen, cho thấy hút thuốc và
uống rượu có liên quan với tỉ lệ cao đột biến gen
trong ung thư đầu cổ(3)
Tỉ lệ người nhai trầu có đột biến gen p53 cao
hơn so với nhóm bệnh nhân không có thói quen
này, tuy nhiên sự khác biệt không có ý nghĩa
Điều này đặc biệt thấy rõ ở các nước châu Á phổ
biến thói quen nhai trầu thường có tỉ lệ đột biến
gen p53 khá thấp(2,4)
Liên quan giữa phổ đột biến với tác nhân
gây ung thư
Nghiên cứu tìm thấy 52,7% là đột biến
chuyển vị, với 40% là dạng chuyển vị G:C>A:T
(trong đó hơn 1/3 trường hợp chuyển vị này xảy
ra tại vị trí CpG) Soussi phân tích tất cả các đột
biến điểm cho thấy 51% đột biến là dạng chuyển
vị G:C >A:T, 59% trong số các dạng đột biến này
xuất hiện tại vị trí CpG- vùng DNA nơi
nucleotid cytosin theo sau bởi nucleotid guanin
dọc theo chuỗi DNA(11) Sự chuyển vị G:C>A:T
tại vị trí CpG được biết là do sự khử amin của
5-methylcytosin thành thymin dẫn đến sự bắt cặp
T/G bị lỗi, nếu không sửa chữa được, sẽ gây ra tỉ
lệ cao đột biến p53 chuyển vị Các chất sinh ung
ngoại sinh như bức xạ tia cực tím, benzopyren trong thuốc lá có ảnh hưởng mạnh hơn đến quá trình methyl hóa dinucleotid CpG Các chất sinh ung nội sinh, do sự trao đổi chất trong tế bào bị thay đổi, cũng có thể nhắm đích các dinucleotid methyl hóa, gây tỉ lệ chuyển vị cao hơn(10,11) Với sự chuyển vị G:C>A:T không phải tại vị trí CpG, nghiên cứu labo cho thấy đây là dạng đột biến thường gặp nhất do các tác nhân alkylate gây ra, dẫn đến sự bắt cặp sai O6 -methylguanin với thymin N-nitrosamin trong thuốc lá hút là nguyên nhân gây ra dạng đột biến chuyển vị này(2,10), đồng thời N-nitrosamin trong thực phẩm ở Trung quốc và Ấn độ cũng góp phần gây nên dạng đột biến chuyển vị G:C>A:T(13) 15 trên tổng số 22 (68%) trường hợp đột biến chuyển vị kiểu này liên quan đến thói quen hút thuốc trong nghiên cứu này
Tỉ lệ cao chuyển dạng G:C>T:A thường thấy trong ung thư phổi, ung thư thực quản và ung thư đầu cổ Chuyển dạng GT tại codon
157, 158, 248, 273 xảy ra trong 30% trường hợp ung thư phổi, ít hơn 10% trong các ung thư khác và được xem là hậu quả tiếp xúc với thuốc lá, như ảnh hưởng sinh ung của benzopyren(6,11) Trong nghiên cứu này xuất hiện 10/14 trường hợp đột biến chuyển dạng GT ở người có thói quen hút thuốc, uống rượu, và 3 (21,4%) trường hợp đột biến tại codon 157 đều gặp ở người hút thuốc lá nhiều
Ở bệnh nhân UTNMM có thói quen nhai trầu, các N-nitrosamin có trong thuốc lá nhai kèm theo có chứa một lượng lớn N-nitronornicotine (NNN), và hợp chất (4 methylnitrosoamino-1-3 pyridyl 1-1-butanone) (NKK) có thể gây đột biến chuyển vị G:C>A:T NKK cũng gây đột biến chuyển dạng G:C>T:A trong thực nghiệm trên chuột, thỏ Chúng tôi tìm thấy 3/7 bệnh nhân nhai trầu có đột biến chuyển vị G:C>A:T và 3/7 có đột biến chuyển dạng G:C>T:A Điều này cho thấy khả năng gây
đột biến p53 của N-nitrosamin trong thuốc lá
nhai hay xỉa trên lâm sàng
Trang 9Nghiên cứu dịch tễ học phân tử đã cho thấy
mối liên quan giữa sự phơi nhiễm với các tác
nhân sinh ung và đặc điểm của đột biến gen
p53(2,4) Các kết quả phân tích dạng đột biến gen
p53 trong nghiên cứu này cũng tìm thấy mối liên
quan giữa phổ đột biến và tác nhân sinh ung
thuốc lá
KẾT LUẬN
Gen đè nén bướu p53 với nhiều chức năng
quan trọng trong tế bào như dừng chu kỳ tế bào,
chết tế bào theo lập trình, biệt hóa tế bào và sửa
chữa DNA Đột biến gen p53 ảnh hưởng nghiêm
trọng đến quá trình sinh ung thư vì protein p53
bị đột biến làm gia tăng tính bất ổn trong hệ gen
của tế bào bướu và thúc đẩy sự tiến triển cuả
bướu Nghiên cứu này cho thấy tỉ lệ khá cao đột
biến gen p53 (47,7%) trong UTNMM với 81% là
đột biến điểm, chủ yếu là đột biến sai nghĩa làm
gia tăng biểu hiện protein p53 trong tế bào bướu
Tỉ lệ đột biến và phổ đột biến gen p53 ở nhóm
bệnh nhân UTNMM này có liên quan rõ với thói
quen hút thuốc lá, cho thấy thuốc lá giữ vai trò
quan trọng trong cơ chế sinh ung thư ở người
Việt Nam
TÀI LIỆU THAM KHẢO
therapeutic application”, Journal of Cancer Molecules 2(4),
pp 141-153
Neoplasms”, Hum Mutat 21, pp 252-253
R.H., Eby Y.J (1995), “Associaton between cigarette smoking
and mutation of the p53 gene in squamous cell carcinoma of the head and neck”, New Eng J Med 332, pp.712-717
mutations in head and neck squamous cell carcinoma “, Int J Pharm Biomed Res 1(3), pp.117-121
“Human papilloma virus- mediated carcinogenesis and HPV- associated oral and orophageal squamous cell carcinoma Part 1: Human papilloma virus- mediated carcinogenesis”, Head and Face Medicine, 6:14
(1994), “Mutations in the p53 tumor suppressor gene: Clue to cancer etiology and molecular pathogenesis”, Cancer Research 54, pp.4855-4878
C.J.T (2001), “Characteristics of mutations in the p53 gene in oral squamous cell carcinoma associated with betal quid chewing and cigarette smoking in Taiwanese”, Carcinogenesis 22(9), pp.1497-1503
protein p53, MDM2, KI67, MMP9 trong ung thư niêm mạc miệng ở người Việt Nam”, Luận án tiến sĩ y học, Đại học Y Dược TP Hồ Chí Minh
Vahakangas K.H (2010), “p53 in head and neck cancer: Functional consequences and environmental implications of TP53 mutation”, Head and Neck Oncology, 2:36
S.S., Hainaut P (2002), “Tobacco smoke carcinogens, DNA damage and p53 mutation in smoking-associated cancer”, Oncogene 21, pp.7435-7451
molecular biology to clinical investigation”, Annals New York Academy of Sciences, pp.121
mutations-From guardian of the genome to oncogene”, Acta Medica Medianae 48(4), pp.59-63
SudhikaranW (2010), “Specific intronic p53 mutation in esophageal squamous cell carcinoma in Southern Thailand”, World J Gastroenterol 16 (42), pp.5359-5366