Giá trị của phương pháp ELISA trong chẩn đoán nhiễm giun lươn strongyloides stercoralis

Mục tiêu nghiên cứu nhằm xác định độ nhạy, độ đặc hiệu, giá trị tiên đoán dương, giá trị tiên đoán âm đồng thời xem xét phản ứng chéo đối với các loại ký sinh trùng khác của kỹ thuật ELISA trong chẩn đoán strongyloides stercoralis.

GIÁ TRỊ CỦA PHƯƠNG PHÁP ELISA TRONG CHẨN ĐOÁN

NHIỄM GIUN LƯƠN STRONGYLOIDES STERCORALIS

Trần Thị Hồng*, Lê Đức Vinh*, Hoàng Thị Thanh Hằng**

TÓM TẮT

Mở đầu: Bệnh nhiễm Strongyloides stercoralis ở Việt Nam từ lâu vẫn được chẩn đoán theo phương pháp cổ

điển hoặc đôi khi tình cờ phát hiện khi soi phân, do đó tỷ lệ dương tính rất thấp, bỏ sót nhiều trường hợp nhiễm bệnh Để nâng cao khả năng phát hiện chúng tôi đã ứng dụng kỹ thuật huyết thanh chẩn đoán miễn dịch men (ELISA) và tiến hành điều chỉnh kỹ thuật này để có cơ sở ứng dụng rộng rãi tại các phòng xét nghiệm

Mục tiêu nghiên cứu: Xác định độ nhạy, độ đặc hiệu, giá trị tiên đoán dương, giá trị tiên đoán âm đồng

thời xem xét phản ứng chéo đối với các loại ký sinh trùng khác của kỹ thuật ELISA trong chẩn đoán Strongyloides stercoralis

Phương pháp nghiên cứu: Nghiên cứu thực nghiệm trong Labo (test chẩn đoán) Kháng nguyên thô điều

chế từ ấu trùng giai đoạn 2 của Strongyloides stercoralis Phân nhóm đối tượng nghiên cứu: nhóm 1: huyết thanh (HT) bệnh nhân chỉ có ấu trùng Strongyloides stercoralis trong phân, nhóm 2: HT bệnh nhân có ấu trùng Strongyloides stercoralis và giun móc trong phân, nhóm 3: HT bệnh nhân không có ấu trùng Strongyloides stercoralis nhưng nhiễm KST khác, nhóm 4: HT của những người hoàn toàn khỏe mạnh không nhiễm KST nào

Kết quả: Điểm cắt OD=0,9230 Phản ứng huyết thanh miễn dịch cho thấy độ nhạy: 93,6%, độ đặc hiệu:

95,7%, giá trị tiên đoán dương: 95,7%, giá trị tiên đoán âm: 93,5%, có 1 bệnh nhân nhiễm Fasciola spp và 1 bệnh nhân nhiễm Clonorchis sinensis có kháng thể phản ứng lại với kháng nguyên ấu trùng filariform của Strongyloides stercoralis

Kết luận: Từ kết quả trên chúng tôi nhận thấy phương pháp huyết thanh chẩn đoán giun lươn là phương

pháp khả thi, có độ tin cậy khá cao, kỹ thuật thực hiện không quá phức tạp, nên có thể ứng dụng rộng rãi vào việc chẩn đoán cũng như điều tra dịch tễ học, theo dõi hiệu quả điều trị

Từ khóa: Strongyloides stercoralis, bệnh giun lươn, phương pháp miễn dịch hấp phụ gắn men

ABSTRACT

THE VALIDITY OF ENZYME – LINKED IMMUNOSORBENT ASSAY (ELISA) FOR DIAGNOSIS OF

HUMAN STRONGYLODIASIS

Tran Thi Hong, Le Duc Vinh, Hoang Thi Thanh Hang

* Y Hoc TP Ho Chi Minh * Vol 16 - Supplement of No 1 - 2012: 24 - 29

Background: The diagnosis of Strongyloides stercoralis in VietNam based on direct examination until

today, so the sensitivity is very low and many cases with this disease were missed To elevate the sensitivity of diagnosis, we have applied Enzyme – Linked Immunosorbent Assay (ELISA) for diagnosis of human strongylodiasis

Objectives: The sensitivity, specificity, positive predictive value and negative predictive value were calculate

using the method of Galent (1980) We also noted the cross- reactive

Methods: Diagnostic test was chosen for our study Serum sample obtained from individuals infected with

* Bộ môn Ký Sinh Trùng – Vi Nấm Học, Đại học Y Khoa Phạm Ngọc Thạch Tp Hồ Chí Minh

** Bộ môn Dịch Tễ Học Lâm Sàng, Đại học Y Khoa Phạm Ngọc Thạch Tp Hồ Chí Minh

Strongyloides stercoralis and other parasitic diseases as well as normal people were analyzed by indirect IgG- ELISA using crude antigen of filariform larvae Serum specimens used in this study were collected from four groups of patients: group 1: patients with Strongyloides stercoralis larvae in stool, group 2: patients with Strongyloides stercoralis larvae and hookworm in stool, group 3: patients were detected with at least one parasite

in stool or by serum test, group 4: parasite –free people

Results: The cut–off point was OD=0.9230 The sensitivity of the test was 93.6%, specificity was 95.7%

The positive and negative predictive value was 95.7% and 93.8% respectively One individual with Fasciola spp, one with Clonorchis sinensis had antibodies that were reactive against larval antigen

Conclusion: From our study, we realized that ELISA test for human strongyloidiasis is a very good method

with high sensitivity and specificity Furthermore its technique is not too difficult to do in many laboratory, so ELISA test method should be used commonly for valid diagnosis with would result in effective treatment for strongylodiasis in Vietnam

Key words: Strongyloides stercoralis, strongylodiasis, Enzyme–Linked Immunosorbent Assay (ELISA)

ĐẶT VẤN ĐỀ

Louis Normand lần đầu tiên phát hiện ra S

stercoralis trong phân một số lính Pháp đã hồi

hương về nước từ miền Nam- Việt Nam vào

năm 1876 Fulleborn (1911), Kreis (1932) và Faust

(1933) mới tiến hành nghiên cứu một cách kỹ

lưỡng về chu trình phát triển trong tự nhiên và

chu trình tự nhiễm của S stercoralis

Năm 1970 Trần Vinh Hiển và La Pierre phát

hiện 300 ca tại Paris bằng soi phân trực tiếp qua

phương pháp tập trung Baermann Đến năm

1981 Caroll mới đưa vào phương pháp huyết

thanh miễn dịch men ELISA với độ nhạy và

chuyên biệt cao(2) Theo nghiên cứu của Grove

vào năm 1996, trên thế giới có hơn 100 triệu

người nhiễm Strongyloides stercoralis Một số

nghiên cứu do Trần Thị Hồng và cộng sự tiến

hành ở huyện Củ Chi-TPHCM, nơi người dân

còn thói quen đi chân đất khi lao động, cho thấy

tỉ lệ nhiễm S stercoralis cao : xã An Nhơn Tây là

2%; xã An Phú là 28,7% ; xã Phước Vĩnh An là

2,1%; xã Trung Lập Thượng là 3,1%(9,11) Do đó,

việc phát hiện và chẩn đoán sớm bệnh nhiễm

giun lươn cho người dân hiện đang là đòi hỏi

cấp thiết

Phương pháp phát hiện ra ấu trùng S

stercoralis trong phân, dịch tá tràng, đàm hay

những dịch sinh học khác của cơ thể hay trong

mô ở những bệnh nhân bị nhiễm S stercoralis là

chẩn đoán rất đáng tin cậy Mặt khác, S

stercoralis lại có thêm chu trình tự nhiễm Ấu trùng của S stercoralis được nở ra trong niêm

mạc ruột non (trinh sản), một số theo phân ra ngoài, nhưng một số lại xuyên qua thành ruột, theo hệ tuần hoàn về phổi, và trở lại ruột non Chu trình này xảy ra thường xuyên liên tục khiến lúc nào trong cơ thể ký chủ cũng có ấu

trùng của S stercoralis luân lưu, kéo dài gần như

suốt đời dù ký chủ chỉ bị nhiễm từ đất ẩm một lần trong quá khứ và sau đó không bị tái nhiễm lại nữa Trong quá trình di chuyển trong mô, ấu

trùng của S stercoralis kích thích hệ miễn dịch

của cơ thể ký chủ sản xuất kháng thể chống các

chất tiết ra từ ấu trùng S stercoralis Qua những

hiểu biết về chu trình tự nhiễm nêu trên, người

ta đã phát triển và đưa vào ứng dụng phương pháp thử nghiệm miễn dịch và đạt được kết quả rất tốt(3,4,5,6,7) Nhờ phương pháp này mà những

ca nhiễm S stercoralis mạn tính, không biến

chứng có thể gặp ở người bình thường, không suy giảm miễn dịch, đa số không có triệu chứng, nếu có thường biểu hiện ở da như những đường ngoằn ngoèo ở da, bầm máu da, nổi mề đay, hay biểu hiện ở đường tiêu hoá như đau bụng, tiêu chảy, ngứa hậu môn, sụt cân nhẹ có thể được chẩn đoán sớm và điều trị kịp thời Đa số các xét nghiệm miễn dịch dựa trên nguyên tắc là phát

hiện kháng thể kháng S stercoralis trong huyết

thanh bệnh nhân, các xét nghiệm này được mô

tả và áp dụng như thử nghiệm sàng lọc, ngày càng trở nên phổ biến và được ứng dụng rộng

rãi Các xét nghiệm miễn dịch này gồm có: thử

nghiệm nội bì (ID), thử nghiệm kết tủa

(previpitin test), thử nghiệm cố định bổ thể, thử

nghiệm miễn dịch huỳnh quang (IFA), thử

nghiệm miễn dịch hấp phụ gắn men (ELISA)

Hiện nay việc áp dụng KT ELISA để chẩn

đoán bệnh nhiễm S stercoralis đang được sử

dụng rộng rãi ở nhiều nước trên thế giới, nhất là

tại các nước đang phát triển như Việt Nam,

Pakistan, Brasil, Iran do giá thành rẻ và dễ thực

hiện Ngoài việc sử dụng như một xét nghiệm

thường qui để chẩn đoán bệnh nhiễm S

stercoralis, KT ELISA còn được dùng để theo dõi

bệnh nhân sau khi qua một đợt hóa trị liệu

thông qua việc theo dõi hiệu giá kháng thể giảm

dần Do vậy chúng tôi tiến hành đề tài “Khảo sát

giá trị phương pháp hấp phụ gắn men (ELISA)

gián tiếp trong chẩn đoán nhiễm S stercoralis”

nhằm mục đích xác định độ nhạy và độ đặc

hiệu cho xét nghiệm này Kháng nguyên được

dùng trong thử nghiệm ELISA gián tiếp mà

chúng tôi tiến hành là kháng nguyên thô được

điều chế từ ấu trùng giai đoạn 2 của S stercoralis

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Thiết kế nghiên cứu

Test chẩn đoán trong phòng thí nghiệm

Địa điểm nghiên cứu

Nghiên cứu được tiến hành tại bộ môn Ký

Sinh, Đại học Y Phạm ngọc Thạch, TP HCM

Đối tượng nghiên cứu

Những người nghi ngờ nhiễm Strongyloides

stercoralis và những bệnh nhân nhiễm

Strongyloides stercoralis theo dõi điều trị

Dân số chọn mẫu

Huyết thanh được thu thập từ những bệnh nhân ở các cơ sở y tế trong thành phố được giới thiệu đến xét nghiệm… và người dân trong cộng đồng tình nguyện tham gia vào nghiên cứu

Huyết thanh bệnh nhân được chia làm 4 nhóm:

NHÓM 1: huyết thanh bệnh nhân chỉ có ấu

trùng Strongyloides stercoralis (+) trong phân Đạt

các tiêu chuẩn sau:

+Đã được chẩn đoán nhiễm S stercoralis qua

xét nghiệm phân cải tiến 3 lần liên tiếp +Chỉ được tìm thấy có giun lươn, không có giun khác

NHÓM 2: Huyết thanh bệnh nhân có ấu

trùng S stercoralis (+) và các ký sinh trùng khác

trong phân

NHÓM 3: Huyết thanh bệnh nhân không có

S stercoralis nhưng nhiễm ký sinh trùng khác

NHÓM 4: Huyết thanh của những người hoàn toàn khỏe mạnh không nhiễm bất kỳ ký sinh trùng nào

Xử lý số liệu: bằng phần mềm SPSS 16.0 for Windows(8)

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

Với các nồng độ nêu trên chúng tôi tiến hành thử nghiệm với 94 mẫu huyết thanh của 4 nhóm và thu được các kết quả OD như sau:

Bảng 1: Các giá trị OD của 94 mẫu huyết thanh:

+ 0,841 2,194 2,614 1,282 2,444 0,564 0,365 0,595 0,570 0,830 0,935

Bảng 2: Độ nhạy, độ đặc hiệu thu được khi chọn các

diểm cắt tại các giá trị khác nhau

Điểm cắt Độ nhạy % Độ đặc hiệu (%)

Biểu đồ 1: Phân phối giá trị OD của 94 mẫu huyết

thanh se: độ nhạy; sp: độ đặc hiệu

Biểu đồ 2 Đường cong ROC và các giá trị độ nhạy,

độ đặc hiệu tương ứng với từng điểm cắt phân bố trên đường cong

Diện tích dưới đường cong AUC=0,966 (0,8 - 0,9 là tốt, >0,9 là rất tốt)

Sai số chuẩn SE=0,024

BÀN LUẬN

Điểm cắt ở OD=0,9230 là giá trị tốt nhất

Mẫu huyết thanh được gọi là dương tính khi giá

trị OD >0,9230 Với điểm cắt này, các giá trị OD

trong nhóm 4 đều thấp hơn, chỉ ở 2 giá trị trong

nhóm 3 cao hơn hẳn, và 1 giá trị trong nhóm 3

bằng với điểm cắt Nhóm 1 và nhóm 2 ở giá trị

OD cao hơn hẳn giá trị điểm cắt, ngoại trừ 3 giá

trị thấp hơn không đáng kể, tại điểm cắt

OD=0,9230 là điểm nằm trên đường cong ROC

và ở khoảng cách ngắn nhất tới đỉnh của biểu

đồ Cách chọn này sẽ cho một kết quả khách

quan và chính xác nhất(8)

So với điểm cắt trong nghiên cứu của

Andarias Mangali làm tại Thái Lan(1) là 0,075 là

giá trị điểm cắt của chúng tôi cao hơn mặc dù chúng tôi và Andarias Mangali đo cùng ở bước sóng 405nm và dùng cùng một loại máy Có sự khác biệt này vì nghiên cứu của Andarias Mangali làm trên nhiều loại protein tinh chế từ kháng nguyên thô của Strongyloides stercoralis, mỗi loại cho một giá trị điểm cắt khác nhau, trong khi đó kháng nguyên mà chúng tôi sử dụng trong nghiên cứu là kháng nguyên khác Mặt khác, các giá trị OD cũng ở thể khác nhau tùy thuộc vào nhóm chứng, vào nguyên liệu sử dụng và bước sóng dùng để đọc huyết thanh, điều đã thể hiện qua sự khác biệt giữa chúng tôi

và các tác giả Koosha S và cs, Lucia Helena F và

cs(7) Thêm vào đó, cách chọn điểm cắt của Andarias Mangali và các tác giả khác là cách

0.000

0.500

1.000

1.500

2.000

2.500

3.000

3.500

Nhóm 1 Nhóm 2 Nhóm 3 Nhóm 4

Điểm cắt

0,923

chọn bằng phương pháp tính X trung bình của

nhóm nhiễm KST khác và nhóm không nhiễm

rồi + 2SD hoặc +3SD, kết quả của cách chọn này

khác với cách chọn điểm cắt của chúng tôi là

dạng chương trình máy tính để chọn theo

chương trình máy tính để chọn theo phương

pháp của James A Hanley

Sai số chuẩn trong nghiên cứu của chúng tôi

SE=0.024 cho thấy dự đoán của chúng tôi chọn

mẫu ban đầu là hoàn toàn hợp lý, qua đó cũng

cho thấy nghiên cứu của chúng tôi có độ chính

xác cao

Về phản ứng cho với các KST khác, với

ngưỡng OD=0,9230, ở nhóm 3 chúng tôi ở 2 ca

dương tính giả với Fasciola và Clonorchis sinensis,

ở thể do bệnh nhân đã nhiễm Strongyloides trước

đó và đã chữa hết trong thời gian gần đây Mặt

khác, kháng nguyên dùng trong nghiên cứu của

chúng tôi là kháng nguyên thô, chứa nhiều

thành phần protein khác nhau, ở thể giống

thành phần của nhiều loại protein khác, cần làm

những kỹ thuật tinh chế hơn như Western blot,

nhưng kỹ thuật này phức tạp và đắt tiền, chỉ sử

dụng cho nghiên cứu, chứ không phù hợp để

tầm soát bệnh ở các nước đang phát triển, nơi

được xem như vùng nội dịch của S stercoralis

Chỉ ở nghiên cứu của Trần Phủ mạnh Siêu(12)

là không ở trường hợp dương tính giả xảy ra,

còn nghiên cứu của Lucia Helena F thì trường

hợp dương tính giả xảy ra trong nhóm chứng

bao gồm 50 người khỏe mạnh, nghiên cứu của

Andarias Mangali và Koosha S ở dương tính giả

nhưng với tỷ lệ thấp, tương đồng với nghiên

cứu của chúng tôi

Xác định độ nhạy, độ đặc hiệu

Qua quá trình thử nghiệm và phân tích kết

quả thu được của phương pháp chẩn đoán

huyết thanh miễn dịch men, chúng tôi xác định

được độ nhạy của thử nghiệm là 93,6% và độ

đặc hiệu của thử nghiệm là 95,7% So với các tác

giả của Andarias Mangali và cs, Koosha S và cs,

Lucia Helena F và cs, thì kết quả của chúng tôi

không sai biệt nhiều Tuy nhiên, vẫn ở trường

hợp âm tính giả xảy ra, ở 3 trường hợp tìm thấy

ấu trùng giun lươn S stercoralis trong phân

nhưng huyết thanh chẩn đoán âm tính, tỷ lệ l: 3/47=6% Theo Grove và Blair năm 1981, tỷ lệ tìm

thấy kháng thể IgG ở người nhiễm S stercoralis

là 98%, như vậy ở 2% là âm tính giả Genta và Weil 1982(6), tỷ lệ này là 92%, như vậy ở 8% âm tính giả, theo Tribouley và cs, tỷ lệ kháng thể IgG là 85-95%, điều này ở thể do khiếm khuyết đáp ứng miễn dịch của bệnh nhân, hoặc có thể

do ấu trùng còn khu trú ở ruột chưa di chuyển vào mô nhiều nên chưa tạo được đáp ứng miễn dịch đầy đủ để ở thể phát hiện bằng huyết thanh chẩn đoán Tuy nhiên, tỷ lệ âm tính giả của chúng tôi là 6%, khá phù hợp với các tác giả khác Khoảng tin cậy 95% của độ nhạy, độ đặc hiệu tương ứng tại điểm cắt OD=0,9230 là (0,8599, 0,9869), KTC chúng tôi thu được tương đối hẹp, điều này giúp chúng tôi giảm thiểu được sai số ngẫu nhiên trong nghiên cứu

Xác định giá trị dự báo dương tính, giá trị

dự báo âm tính

Giá trị dự báo dương tính

95,7%, với giá trị dự báo dương như vậy, thử nghiệm ELISA sẽ cho xác suất mỗi người sẽ mắc bệnh khi kết quả thử nghiệm dương tính là 95,7% Điều này giúp giảm khả năng sai lầm khi tiến hành điều trị cho những người ở kết quả thử nghiệm dương tính đối với bệnh, giảm thiểu

số người phải tốn chi phí và thời gian lâu dài để theo dõi phác đồ điều trị khi thực sự những người đó không mắc bệnh

Giá trị dự báo âm tính

93,8%, với giá trị tiên đoán âm như trên, thử nghiệm ELISA sẽ cho xác suất mỗi người sẽ không mắc bệnh khi kết quả thử nghiệm âm tính

là 93,8% Điều này giúp làm giảm số người mắc bệnh bị bỏ sót không được điều trị khi kết quả thử nghiệm bệnh của họ âm tính, đây là vấn đề hết sức quan trọng vì những biến chứng của

bệnh nhiễm S stercoralis về lâu dài là rất nguy

hiểm đối với người bệnh

Giá trị dự báo dương tính và giá trị dự báo

âm tính của chúng tôi so với các tác giả

Andarias Mangali và cs, Koosha S và cs, Lucia

Helena F và cs không có sự chênh lệch nhiều mà

còn tương đối đồng đều nhau, chỉ ở khác biệt

duy nhất với Koosha S và cs về giá trị tiên đoán

dương, giá trị tiên đoán dương của chúng tôi

cao hơn nghiên cứu của Koosha S và cs Tuy

nhiên giá trị tiên đoán âm của chúng tôi lại kém

hơn giá trị tiên đoán âm của Koosha S và cs

Giá trị dự báo dương tính và giá trị dự báo

âm tính trong nghiên cứu của chúng tôi cho

thấy giá trị của kỹ thuật hấp phụ gắn men mà

chúng tôi tiến hành rất đáng tin cậy trong chẩn

đoán nhiễm S stercoralis

KẾT LUẬN

Từ những kết quả thu được qua thí nghiệm

chúng tôi có những kết luận sau:

Ngưỡng xác định dương tính S stercoralis

trong nghiên cứu của chúng tôi OD = 0,9230

Độ nhạy và độ đặc hiệu của test ELISA

trong nghiên cứu của chúng tôi lần lượt là

95,7% và 93,6%

Giá trị dự báo dương và giá trị dự báo âm

trong nghiên cứu của chúng tôi lần lượt là

95,7 và 93,8%

KIẾN NGHỊ

Hiện nay ở nước ta, kỹ thuật chẩn đoán

bệnh nhiễm S stercoralis còn khá thô sơ, ít được

chú ý đến, khả năng phát hiện bệnh thấp Do

đó, việc nâng cao hiệu quả chẩn đoán bằng

phương pháp huyết thanh miễn dịch là cần

thiết Chúng tôi kiến nghị:

Ứng dụng phương pháp miễn dịch hấp

phụ gắn men ELISA trong chẩn đoán nhiễm

S stercoralis trong chẩn đoán và điều tra dịch

tễ học

Cần phát triển thêm nghiên cứu sử dụng các kháng nguyên tinh chế trong tương lai để ở thể

phát hiện một cách hiệu quả nhất bệnh nhiễm S stercoralis, ngày càng có số người mắc bệnh cao

ở Việt Nam

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Immunosorbent Assay for the diagnosis of human Strongyloidosis Southeast Asian J Trop Med public Health, 22:

88 – 92

of human strongyloidiais by an enzyme – linked immunosorbent assy Transaction of the Royal Society of Tropical medicine and Hygiene, 75: 706 - 709

serodiagnosis of Journal of Tropical Medicine and Hygiene, 75:

109 - 111

Genta RM (1987) Seroepidemiology of Strongyloidiasis in Thai village International Journal for Parasitology, 17: 1343 – 1348

Strongyloidiasis: A major roundworm infection of man, Chapter 5: 133 – 149, Copyright© Grove D I., 1989 Taylor & Francis Ltd 4 John St, London WC 1N 2ET

stercoralis larval surface antigens in chronic strongyloidiasis Laboratory investigation, 47: 87 – 90

Extract for the Diagnosis of Human Strongyloidiasis by Enzyme-linked Immunosorbent Assay Mem Inst Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro, 98(6): 849-851

nghiên cứu y học, tr 1 – 10

giun móc, giun lươn tại xã Trung lập Thượng huyện Củ Chi Y học thành phố Hồ Chí Minh, Phụ bản của tập 5, số 1: 25 -29

Strongyloidiasis: A major roundworm infection of man, Chapter 3: 95 – 102, Copyright© Grove D I., 1989, Taylor & Francis Ltd

4 John St, London WC 1N 2ET

11 Trần Thị Hồng (2006) Strongyloides In: Trần thị Hồng (eds)

Ký sinh trùng y học 1st edition, tr 110 – 114, Nhà xuất bản Y học, TP Hồ Chí Minh

thanh miễn dịch men trong chẩn đoán bệnh nhiễm giun lươn Y học thành phố Hồ Chí Minh, Phụ bản của tập 5, số 1:

37 – 43