Bài viết này thông báo kết quả ứng dụng phần mềm tin học Modde 5.0 để thiết kế và tối ưu hóa quy trình tổng hợp altretamin. Altretamin được tổng hợp từ phản ứng giữa cyanuric clorid với dimethylamin trong dung môi aceton và sử dụng NaOH làm chất trung hòa axít.
Trang 1TỐI ƢU HÓA QUY TRÌNH TỔNG HỢP ALTRETAMIN LÀM THUỐC ĐIỀU TRỊ UNG THƢ BẰNG PHẦN MỀM TIN HỌC MODDE 5.0
Vũ Bình Dương*; Phan Đình Châu**
TãM T¾T
Altretamin được tổng hợp từ phản ứng giữa cyanuric clorid với dimethylamin trong dung môi aceton và sử dụng NaOH làm chất trung hòa axít Đã ứng dụng phần mềm Modde 5.0 để thiết
kế thí nghiệm và tối ưu hóa các điều kiện trong quy trình tổng hợp altretamin Kết quả: đã tìm được các điều kiện tối ưu cho tổng hợp altretamin gồm: tỷ lệ mol các chất tham gia phản ứng cyanuric clorid:DMA:NaOH là 1:4,05:3,75; nhiệt độ phản ứng 49 0 C; thời gian phản ứng 3,5 giờ Với các điều kiện tối ưu tìm được, hiệu suất của cả quy trình đạt 88,19% Sản phẩm altretamin thu được đạt các chỉ tiêu chất lượng theo Dược điển Mỹ 34 (USP 34) với phiếu kiểm nghiệm số 44G 566 ngày 26 tháng 8 năm 2014
* Từ khóa: Altretamin; Tổng hợp hóa học; Tối ưu hóa
Optimization of Synthesis Process of Altretamine Using Anticancer Medicines by Modde 5.0 Software
Summary
Altretamine was synthesized from the reaction between cyanuric chloride and dimethylamine
in acetone solvent and NaOH as a neutralizer Modde 5.0 software was applied to design experiments and optimize conditions of altretamine synthesis The optimal molar ratio of materials in the reaction was CYA:DMA:NaOH (1:4.05:3.75) at 49 0 C temperature in 3.5 hours The total process performance achieved 88.19% in the optimal conditions Substance (altretamine) meets requirements of USP
34 (Certificate of analysis - No 44G566 dated 26 Aug 2014)
* Key words: Altretamine; Synthesis; Optimization
ĐẶT VẤN ĐỀ
Altretamin có tên khoa học 2,4,6-tris
(dimethylamino)-s-triazin là chất kháng ung
thư được sử dụng trong điều trị các loại
ung thư như: ung thư phổi, ung thư vú,
ung thư buồng trứng (là các loại ung thư
phổ biến), đặc biệt được dùng trong điều
trị ung thư buồng trứng tiến triển sau
khi phương pháp trị liệu đầu tiên thất bại
[1, 2, 5] Altretamin hiện đang được lưu hành với biệt dược hexalen (U.S Bioscience), hexastat (Roger Bellon), hexamethylmelamin (Rhone-Poulenc), là thuốc được coi là ít độc hơn so với các thuốc hóa trị liệu khác
sử dụng điều trị ung thư và là thuốc có công thức đơn giản, quá trình tổng hợp ít giai đoạn, tính khả thi trong sản xuất khá cao [4, 6]
* Học viện Quân y
** Trường Đại học Bách khoa Hà Nội
Người phản hồi (Corresponding): Vũ Bình Dương (vbduong2978@gmail.com)
Ngày nhận bài: 23/09/2014; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 21/11/2014
Ngày bài báo được đăng: 26/11/2014
Trang 2T¹p chÝ y - d-îc häc qu©n sù sè 9-2014
Ở nước ta, nhu cầu về thuốc điều trị
ung thư khá lớn, các thuốc ung thư đều
phải nhập ngoại với giá thành quá đắt, chi
phí cho điều trị quá cao Hiện nay, Học
viện Quân y đã và đang nghiên cứu cải
tiến quy trình tổng hợp altretamin với hiệu
suất khá cao, thực hiện đơn giản, dễ dàng
triển khai sản xuất quy mô công nghiệp [3]
Trong bài này, chúng tôi thông báo kết
quả ứng dụng phần mềm tin học Modde
5.0 để thiết kế và tối ưu hóa quy trình
tổng hợp altretamin
NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG
PHÁP NGHIÊN CỨU
1 Nguyên liệu, hóa chất
Cyanuric clorid, dimethylamin, aceton,
cồn 96º, natri hydroxyd, altretamin chuẩn
2 Thiết bị nghiên cứu
- Cân điện tử Electronic Balance
WT-CF; cân phân tích Metller có độ chính xác
0,1 mg, tủ sấy Medda, máy khuấy từ gia
nhiệt IKA RH Basic 2 (Đức), máy cất quay
Rotavapor R.200, bơm hút chân không,
phễu lọc hút chân không Buchner
- Dụng cụ thủy tinh đạt tiêu chuẩn
dùng cho phòng thí nghiệm tổng hợp hữu
cơ (bình ba cổ 500 ml, 1.000 ml, sinh hàn
hồi lưu, nhiệt kế, bình cầu 250 ml, bình
gạn có nút mài 250 ml, bình định mức,
pipet các ống nghiệm…)
- Bản mỏng silicagel Kieselgel 60 F254
(Merck), đèn soi sắc ký UV hai bước sóng
254 và 360 nm
- Máy đo nhiệt độ nóng chảy Stuart,
SMP-10
- Máy ghi phổ hồng ngoại (IR) GX-
PerkinElmer (Mỹ)
- Máy ghi phổ khối lượng (MS) AutoSpec Primer tại Phòng Phân tích Cấu trúc, Viện Hóa học (Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam)
- Máy ghi phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1H - NMR và 13C - NMR) Bruker - AV500 tại Phòng Phân tích Cấu trúc, Viện Hóa học (Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam)
3 Phương pháp nghiên cứu
* Phương pháp tổng hợp và tinh chế altretamin:
Tổng hợp altretamin từ nguyên liệu cyanuric clorid (CyA) và dimethylamin (DMA) trong dung môi aceton với NaOH làm chất xúc tác và trung hòa axít theo sơ
đồ phản ứng sau:
N
Cl Cl
Cl
Aceton
N
N N
N
+
+ NaCl + H 2 O
Cyanuric clorid
Altretamin
Phản ứng được tiến hành trong điều kiện nhiệt độ, tỷ lệ mol các chất CyA:DMA:NaOH trong thời gian phản ứng khác nhau (theo dõi bằng sắc ký lớp mỏng) Hỗn hợp sau phản ứng cho vào nước đá để thu lấy tủa, lọc rửa tủa và kết tinh lại trong cồn 960 [3]
Sản phẩm kết tinh được xác định nhiệt độ nóng chảy, sắc ký lớp mỏng, khối lượng
và tính hiệu suất phản ứng
* Phương pháp thiết kế thí nghiệm và tối ưu hóa:
- Thiết kế thí nghiệm:
Sử dụng phương pháp thiết kế theo
mô hình mặt hợp tử tại tâm với sự trợ
8
Trang 3giúp của phần mềm Modde 5.0 [7] để
khảo sát các yếu tố ảnh hưởng tới hiệu
suất phản ứng bao gồm: nhiệt độ phản
ứng, tỷ lệ mol DMA, tỷ lệ mol NaOH với
các mức khác nhau và được mã hóa
như bảng 1 Các yếu tố này gọi là biến
độc lập hay tham số Hiệu suất của phản ứng được gọi là biến phụ thuộc hay hàm
số (Y%) Sử dụng phần mềm thiết kế tối ưu Modde 5.0 để thiết kế thí nghiệm, phần mềm đưa ra thí nghiệm cần tiến hành
Bảng 1: Ký hiệu và các mức của biển đầu vào
- Tối ưu hóa:
Sau khi có kết quả làm thực nghiệm, sử dụng phẩn mềm Modde để phân tích ảnh
hưởng các biến độc lập đến hiệu suất phản ứng (biến phụ thuộc) bằng việc thiết lập
phương hồi quy bậc 2 về mối tương quan giữa biến phụ thuộc và biến độc lập
Phương trình có dạng:
Y = b0 + b1X1 +b2X2 +b3X3 + b1(X1)2 + b2(X2)2 + b3(X3)2 + b1,2,3(X1 X2 X3 )
Ngoài ra, phần mềm còn đưa ra dự đoán điều kiện tối ưu để hiệu suất phản ứng
cao nhất (Y = max) Sau khi thu được điều kiện tối ưu từ phần mềm, làm lại thí nghiệm
để thẩm định kết quả tối ưu
* Phương pháp xác định độ tinh khiết
và cấu trúc hóa học:
- Sơ bộ kiểm tra độ tinh khiết của sản
phẩm bằng sắc ký lớp mỏng và đo nhiệt
độ nóng chảy
- Xác định cấu trúc của altretamin tổng
hợp được dựa vào phân tích phổ tử ngoại
(UV), phổ hồng ngoại (IR) và phổ khối
lượng (MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân
(1H - NMR và 13C -NMR)
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ
BÀN LUẬN
1 KÕt qu¶ thiÕt kÕ thÝ nghiÖm và thùc nghiÖm
Sau khi đưa các biến độc lập vào phần mềm Modde 5.0, phần mềm đưa ra kết quả thiết kế gồm 17 thí nghiệm Tiến hành 17 thí nghiệm tổng hợp altretamin theo thiết
kế Sau mỗi thí nghiệm, cân xác định khối lượng sản phẩm và tính hiệu suất phản ứng
Trang 4T¹p chÝ y - d-îc häc qu©n sù sè 9-2014
Bảng 2: Kết quả thiết kế thí nghiệm và thực nghiệm thu được
STT
Đ
(Y%)
Nhập kết quả thực nghiệm vào phần mềm Modde 5.0, nhận được phương trình hồi quy như sau: Y = 86,17 + 1,43X1 + 2,79X2 + 12,57X3 - 2,63X22 - 13,37 X23 + 1,18X2X3,
Phương trình có hệ số tương quan R2 = 0,996 Điều này chứng tỏ có mèi tương quan rất chặt chẽ giữa các biến đầu ra và đầu vào theo phương trình hồi quy tìm được Phần mềm cũng đưa ra mặt đáp về ảnh hưởng các biến độc lập (yếu tố khảo sát) tới hiệu suất phản ứng
Hình 1: Mặt đáp tối ưu thực nghiệm của các yếu tố đầu vào tới hiệu suất
Trang 5Phân tích ảnh hưởng yếu tố kết hợp
và từng yếu tố độc lập cho thấy: khi tăng
nhiệt độ thì hiệu suất phản ứng tăng,
nhưng tăng không nhiều Khi tăng tỷ lệ
mol NaOH, hiệu suất tăng, nhưng tăng tới
tỷ lệ 3,75 thì hiệu suất ít tăng, thậm chí
giảm chút ít Tỷ lệ mol DMA ảnh hưởng
nhiều tới hiệu suất phản ứng Khi tăng
tỷ lệ tới khoảng 4, hiệu suất tăng nhanh,
nhưng quá tỷ lệ này thì hiệu suất giảm
Trong 3 yếu tố khảo sát, mức độ ảnh hưởng
tới hiệu suất được sắp xếp từ ít tới nhiều
như sau: nhiệt độ < tỷ lệ NaOH < DMA
Chạy trương trình tổi ưu hóa trên phần
mềm Modde với kết quả từ 17 mẻ thí
nghiệm thu được các điều kiện tối ưu
cho hiệu suất cao là: nhiệt độ (X1) = 490C;
tỷ lệ mol DMA:CYA (X2) = 4,05; tỷ lệ mol
NaOH:CYA (X3) = 3,75 Khi đó, hiệu suất
theo tính toán của phần mềm là 88,06%
Tiến hành thực nghiệm với các điều
kiện tối ưu trên để kiểm chứng lại kết quả
dự đoán trên phần mềm Modde 5.0 đưa ra
Bảng 3: Kết quả thực nghiệm kiểm tra
kết quả tối ưu hóa
(%)
(0C)
Dự đoán
(1)
Thực nghiệm (2)
Kết quả thực nghiệm tiến hành phản ứng theo các điều kiện dự đoán của phần mềm tối ưu cho thấy hiệu suất của phản ứng đạt 88,19% (dự đoán của phần mềm
là 88,06%) Như vậy, sự khác biết giữa
dự đoán của phần mềm và thực nghiệm không có ý nghĩa thống kê với p > 0,05
Có thể sử dụng các điều kiện tối ưu mà phần mềm đưa ra là: tỷ lệ mol CYA:DMA: NaOH = 1:4,05:3,75, phản ứng được thực hiện trong 3,5 giờ, nhiệt độ phản ứng 49oC
2 Thiết lập quy trình sản suất
Với các điều kiện tối ưu hóa, chúng tôi xây dựng quy trình tổng hợp altretamin ở quy mô phòng thí nghiệm như sau: cho 9,4 g (0,05 mol) cyanuric clorid vào bình
ba cổ dung tích 500 ml, có lắp sinh hàn, nhiệt kế, phểu nhỏ giọt, nồi cách thủy, máy khuấy từ, cho vào 40 ml aceton, khuấy 10 phút, tiếp đó cho thêm vào dung dịch này 23 ml dimetylamin 40% (0,205 mol) Làm lạnh ngoài bằng nước đá, vừa khuấy vừa cho 7,5 g (0,1875 mol) natri hydroxyd vào, khuấy 10 phút, sau đó đun hồi lưu 3 giờ 30 phút Sau khi phản ứng kết thúc, vừa khuấy vừa cho nước đá để thu lấy tủa, tinh chế lại sản phẩm vào hỗn hợp phản ứng trong 120 ml nước cất - đá, tủa tạo ra được khuấy tiếp 30 phút, sau
đó lọc qua phễu Buchner lấy sản phẩm thô Kết tinh lại toàn bộ sản phẩm thô trong etanol 96o, sấy khô sản phẩm ở 70oC trong tủ hút chân không 3 giờ, thu được 9,37 g sản phẩm altretamin, tinh thể hình kim trắng, nhiệt độ nóng chảy 172 - 174oC Hiệu suất 89,19%
Trang 6T¹p chÝ y - d-îc häc qu©n sù sè 9-2014
3 Kết quả xác định độ tinh khiết,
nhận dạng cấu trúc hóa học và kiểm
nghiệm sản phẩm
Kết quả xác định độ tinh khiết của mẫu
thu được gồm:
- Đo điểm chảy: nhiệt độ chảy của sản
phẩm altretamin ở các mẻ khác nhau dao
động từ 171 - 174oC
- Sắc ký bản mỏng: sơ bộ kiểm tra bằng sắc ký lớp mỏng so với chất chuẩn với hệ dung môi khai triển (toluen:AcOEt:CHCl3:MeOH là 6:1:4:3) cho 1 vết gọn (Rf = 0,769) lên ngang đúng vết altretamin chuẩn, hiện thị rõ dưới ánh sáng đèn tử ngoại t¹i bước sóng 254 nm
- Số liệu phân tích phổ (bảng 4):
IR (KBr), υ max cm -1
2858 (υC aromatic -N-CH 3 ); 2278 (δ s
C-H/N-CH 3 ), 1528 (υC=N); 1385 (δ s CH 3 ); 1211 (υC-N)
2866 (υC aromatic -N-CH 3 ); 2278 (δ s C-H/N- CH 3 ), 1527 (υC=N); 1386 (δ s CH 3 ); 1211 (υC-N)
EI MS (m/z) 210 (M+); 195 [M+-CH 3 ]; 167 [M+-N(CH 3 ) 2 ];
152[195-N(CH 3 ) 2 ]; 96[167-NH=C-N(CH 3 ) 2 ];
81[152-NH=C-N(CH 3 ) 2 ]
210 (M+); 195 [M+-CH 3 ]; 167 [M+-N(CH 3 ) 2 ]; 152[195-N(CH 3 ) 2 ]; 96[167-NH=C-N(CH 3 ) 2 ]; 81[152-NH=C-N(CH 3 ) 2 ]
1
13
C-NMR (ppm) 165,66(s,3C,C triazin ); 35,65(s,6C,6CH 3 ) 165,66(s,3C,C triazin ); 35,65(s,6C,6CH 3 )
Từ kết quả đo diểm chảy, phân tích sắc ký bản mỏng, phân tích phổ IR, MS,1H - NMR
và 13C - NMR của hợp chất tổng hợp được và chất chuẩn cho phép chúng tôi kết luận altretamin tổng hợp được tinh khiết và có cấu trúc đúng như dự kiến
- Chất lượng của altretamin tổng hợp được: kiểm nghiệm theo Dược điển Mỹ 2010 (USP 34) Kết quả mẫu gửi kiểm nghiệm đạt yêu cầu chất lượng theo Dược điển Mỹ
2010 (USP 34), Phiếu kiểm nghiệm số 44G 566 ngày 26 tháng 8 năm 2014 của Viện Kiểm nghiệm Thuốc Trung ương
KẾT LUẬN
Đã ứng dụng phần mềm Modde 5.0 để
thiết kế thí nghiệm và tối ưu hóa các điều
kiện trong quy trình tổng hợp altretamin
Kết quả: đã tìm được điều kiện tối ưu
cho tổng hợp altretamin gồm: tỷ lệ mol
các chất tham gia phản ứng cyanuric
clorid:DMA:NaOH là 1:4,05:3,75; nhiệt
độ phản ứng 490C; thời gian phản ứng
3,5 giờ Với các điều kiện tối ưu, hiệu suất
của cả quy trình đạt 88,19% Sản phẩm altretamin thu được đạt các chỉ tiêu chất lượng theo Dược điển Mỹ 34 (USP 34) với phiếu kiểm nghiệm số 44G 566 ngày
26 tháng 8 năm 2014
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1 Nguyễn Bá Đức Hóa chất điều trị ung
thư NXB Y học Hà Nội 2003, tr.130-137
2 Trịnh Văn Quang Bách khoa toàn thư,
ung thư học NXB Y học 2002, tr.69-70
Trang 73 Phan Đình Châu, Vũ Bình Dương,
Nguyễn Thị Thu Hằng, Bùi Thị Thu Hà
Nghiên cứu quy trình sản xuất altretamin là
thuốc điều trị ung thư Tạp chí Dược học
2014, số 462, tr.2-6
4 Đinh Thị Thanh Hải, Hoàng Thu Trang
Nghiên cứu tổng hợp altretamin làm thuốc
điều trị ung thư Tạp chí Dược học 2010,
407, tr.25-27
5 Goodman and Gilman’s The Pharmacological
basis of Therapeutics 10th Ed MC Grow Hill Inc New York, London, Seol, Tokyo, Singapore, Sydney, Toronto 2001, Vol II, Chapter 52
6 Kaiser D W et al J Am Chem Soc
1952, 73, pp.2984-2986
7 Sartorius Stedim Biotech Company User
guide Bio Pat Modde 5.0 2013