Nội dung nghiên cứu với mục tiêu nhằm so sánh độ nhạy (Se), độ đặc hiệu (Sp) của kỹ thuật ASB realtime PCR phát hiện đột biến T1799A với FNAC trong chẩn đoán ung thư tuyến giáp thể nhú. Mời các bạn cùng tham khảo bài viết để nắm rõ nội dung chi tiết.
Trang 1TRONG CHẨN ĐOÁN UNG THƯ TUYẾN GIÁP THỂ NHÚ
Hoàng Quốc Trường*, Ngô Minh Hạnh**, Lê Hữu Song*
TÓM TẮT
Đặt vấn đề: Chọc hút tế bào bằng kim nhỏ (FNAC) là xét nghiệm thường quy trong chẩn đoán trước phẫu
thuật đối với các u tuyến giáp. Tuy nhiên, có khoảng 15% các trường hợp không kết luận được. Đột biến gen braf T1799A là một trong các dấu ấn phân tử gần đây được cho là có giá trị trong hỗ trợ chẩn đoán ung thư tuyến giáp thể nhú (UTTGTN).
Mục tiêu: So sánh độ nhạy (Se), độ đặc hiệu (Sp) của kỹ thuật ASB RealTime PCR phát hiện đột biến
T1799A với FNAC trong chẩn đoán UTTGTN.
Đối tượng và phương pháp: 45 mẫu nhân giáp được đưa vào nghiên cứu. Chẩn đoán cuối cùng dựa vào
kết quả mô bệnh học sau phẫu thuật. Đột biến T1799A được xác định bằng kỹ thuật ASB RealTime PCR. Độ nhạy, đặc hiệu, chính xác của ASB RealTime PCR được xác định trên các mẫu FNAC có kết quả chẩn đoán mô bệnh học.
Kết quả: Độ nhạy, đặc hiệu, chính xác của kỹ thuật ASB RealTime PCR so với FNAC được xác định tương
ứng là 92,3%; 83,3%; 91,1% so với 90,5%; 33,3% và 88,8%.
Kết luận: Xét nghiệm phát hiện đột biến gen braf T1799A kết hợp với FNAC sẽ làm tăng tính chính xác
của kỹ thuật này trong chẩn đoán ung thư tuyến giáp thể nhú
Từ khóa: ung thư tuyến giáp thể nhú, FNAC, BRAF
ABSTRACT
THE VALUE OF BRAF T1799A MUTATION ANALYSIS
IN THE DIAGNOSIS OF PAPILLARY THYROID CARCINOMA
Hoang Quoc Truong, Ngo Minh Hanh, Le Huu Song
* Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 17 ‐ Supplement of No 3 ‐ 2013: 63 ‐ 67
Background: Fine‐needle aspiration cytology is routinely used before surgery of thyroid nodules. However,
15% of FNAC are diagnosed as suspicious for malignancy and undetermined, so that the proportion of patients with inconclusive results in diagnosis. Recently, BRAF T1799A mutation is one of a valuable molecular markers
in Papillary thyroid carcinoma.
Aims: To compare sensitivity, specificity and accuracy of ASB RealTime PCR detecting T1799A mutation
assay with that of FNAC in the diagnosis of papillary thyroid carcinoma.
Patients and Methods: A total of 45 thyroid nodules from patients were prospectively analyzed for
cytology. A final diagnosis was confirmed by histology after surgery. BRAF T1799A mutation was analysed by ASB RealTime PCR. A sensitivity, specificity and accuracy of ASB RealTime PCR assay were determined based
on the results of histopathology.
Results: Sensitivity, specificity and accuracy of ASB RealTime PCR assay was 92.3%; 83.3% and 91.1%
compared with 90.5%; 33.3% and 88.8% which was determined by FNAC.
Conclusions: BRAF T1799A mutation analysis when combined with FNAC can significantly improve
*Bệnh viện Trung Ương Quân đội 108 **Viện nghiên cứu Y Dược Lâm sàng 108
Tác giả liên lạc: TS. Hoàng Quốc Trường ĐT: 0988709667 Email: hqtruong2002@yahoo.com
Trang 2Key words: papillary Thyroid carcinoma, FNAC, BRAF
ĐẶT VẤN ĐỀ
Kỹ thuật chọc hút tế bào bằng kim nhỏ
(FNAC) là xét nghiệm tế bào học thường quy
trong chẩn đoán trước phẫu thuật ung thư tuyến
giáp thể nhú (UTTGTN) với độ nhạy, độ đặc
hiệu kỹ thuật tương ứng đạt 70−98% và
55−100%(5). Đây là kỹ thuật đầu tay trong thực
hành lâm sàng, tuy nhiên, có tới 15−20% số
trường hợp không xác định được chẩn đoán và
có khoảng 10–40% số mẫu bệnh phẩm được
chẩn đoán nghi ngờ hoặc không đủ tiêu chuẩn
xét nghiệm(2,15). Gần đây kết quả FNAC không
xác định được đề xuất chia thành 3 nhóm: (1)
Tổn thương tế bào nang tuyến giáp không xác
định (follicular lesion of undetermined
significance, FLUS); (2) Tế bào Hurthle; và (3)
Nghi ngờ ác tính (suspicious for malignancy),
với tỉ lệ dự đoán ung thư tương ứng 5–10%, 20–
30%, và 50–75%(17). Việc phân loại trên với mục
đích trả lời kết quả xét nghiệm tế bào học chính
xác nhất. Tuy nhiên, trong số các trường hợp
phẫu thuật loại bỏ nhân giáp thì chỉ có 8–56%
phát hiện có tế bào ác tính(1), do đó có rất nhiều
bệnh nhân phải chịu cuộc phẫu thuật không cần
thiết dẫn đến nguy cơ mắc thêm bệnh và thêm
kinh phí điều trị( 11).Những bệnh nhân có kết quả
chẩn đoán FNAC không xác định thường trải
qua một cuộc phẫu thuật hạn chế, cắt một phần
tuyến giáp. Sau khi xác định là ung thư bằng kết
quả giải phẫu bệnh, các bệnh nhân này sẽ phải
chịu cuộc mổ thứ hai để cắt toàn bộ tuyến giáp
nên chi phí điều trị là rất tốn kém. Hơn nữa, có
1–3% số trường hợp chẩn đoán FNAC là âm tính
giả nên bệnh nhân mất cơ hội được điều trị(14). Vì
những lí do trên, việc phát triển các phương
pháp chẩn đoán có độ nhạy, độ đặc hiệu cao hỗ
trợ cho kỹ thuật FNAC chính xác hơn là vô cùng
cấp thiết.
Qua nghiên cứu người ta thấy đột biến gen
braf T1799A là dấu ấn phân tử rất có giá trị trong
chẩn đoán UTTGTN. Đột biến T1799A xuất hiện
trong UTTGTN với tần suất giao động từ 29–
69%(3,10) nhưng chưa có một công trình công bố nào cho thấy có sự xuất hiện của đột biến này ở các tế bào tuyến giáp lành tính(4). Các kết quả công bố trên thế giới đã khẳng định giá trị của đột biến này khi kết hợp với FNAC sẽ làm tăng
độ nhạy, độ đặc hiệu và tính chính xác của kỹ thuật chẩn đoán này(8,16). Từ kết quả nghiên cứu của đề tài tiềm năng mã số KC.10.TN.14/11‐15, chúng tôi đã xây dựng thành công kỹ thuật khuếch đại gen đặc hiệu alen kết hợp Blocker
(ASB RealTime PCR) phát hiện đột biến gen braf
T1799A trong UTTGTN(9). Trong nghiên cứu này, chúng tôi đánh giá độ nhạy, đặc hiệu, tính chính xác của kỹ thuật ASB RealTime PCR xác định đột biến T1799A và so sánh với kỹ thuật FNAC trong chẩn đoán UTTGTN.
ĐỐI TƯỢNG ‐ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tượng nghiên cứu
Mẫu chứng dương và chứng âm của nghiên cứu
Dòng tế bào HT‐29 mang đột biến gen braf
T1799A (ATCC, Mỹ).
Dòng tế bào HCT‐116 mang gen BRAF kiểu
dại (ATCC, Mỹ).
45 bệnh nhân được khám và chẩn đoán bệnh tại phòng xét nghiệm tế bào ‐ Bệnh viện Nội tiết Trung Ương và Khoa Giải phẫu bệnh lý, Bệnh viện TƯQĐ 108. Tất cả các bệnh nhân này vừa
có kết quả tế bào học, vừa có kết quả mô bệnh học sau phẫu thuật.
Cách lấy bệnh phẩm làm xét nghiệm xác định đột biến gen braf T1799A
Mỗi mẫu bệnh phẩm chọc hút được chia thành 2 phần: 1/2 được trải ra lam để chẩn đoán tế bào, 1/2 được chia sang ống eppendorf
vô trùng để làm xét nghiệm phát hiện đột biến. Trong các trường hợp chọc hút tế bào mà lượng mẫu bệnh phẩm lấy ít sẽ loại khỏi nghiên cứu này.
Trang 3Phương pháp tách chiết ADN tổng số từ các
mẫu FNA
Các mẫu chọc hút tế bào được rửa trong
nước muối sinh lý 0,9% và được tiến hành tách
chiết ADN tổng số theo quy trình của Hoàng
Quốc Trường và cộng sự(6,7).
Phương pháp phát hiện đột biến gen BRAF
T1799A bằng kỹ thuật khuếch đại gen đặc
hiệu alen kết hợp Blocker
Trình tự primer và Blocker đặc hiệu phát
hiện đột biến gen braf T1799A được thiết kế dựa
trên các công trình đã công bố(16). Đột biến gen
braf T1799A được xác định bằng kỹ thuật
RealTime PCR kết hợp Blocker. Phản ứng được
tiến hành với thể tích 20 μL, tỉ lệ các thành phần
như sau: 2X PCR master mix SYBR Green (ABI),
mồi No.1: 5ʹ‐CTGTTTTCCTTTACTTACT
ACACCTCAGAT‐ 3’ (0,375 pM), mồi đặc hiệu
alen No.2: 5’‐CCCACTCCATCGAGATTTCT‐ 3’
(0,375 pM) và 300 pM Blocker: 5’‐
CATCGAGATTTCAC TGTAGCTAGA‐PO4‐3’.
2,5 μL ADN tổng số và 0,5 μL nước cho phản
ứng RealTime PCR. Phản ứng khuếch đại gen
đặc hiệu alen kết hợp Blocker được thực hiện
trên máy RealTime PCR 7500, Mỹ với chu kỳ
nhiệt như sau: 50°C/5 phút; 95°C/10 phút, 45 chu
kỳ (95°C/15 giây, 60°C/1 phút). Do việc thiết kế
trình tự mồi đặc hiệu alen kết hợp sử dụng
Blocker, phản ứng khuếch đại gen sẽ chỉ xẩy ra
trên mạch khuôn ADN mang điểm đột biến và
được hiển thị ngay sau mỗi chu kỳ nhiệt của
phản ứng qua việc ghi nhận tín hiệu huỳnh
quang của SYBR Green. Trong khi, các mẫu
không có tín hiệu huỳnh quang là các mẫu kiểu
dại không chứa đột biến gen braf T1799A(18).
Phương pháp xác định trình tự axit nucleic
Để kiểm định độc lập sự có mặt đột biến gen
braf T1799A trong mẫu chuẩn dương HT‐29 và
các mẫu bệnh phẩm FNAC chúng tôi tiến hành
giải trình tự trực tiếp đoạn gen bằng cặp mồi (mồi
CTGTTTTCCTTTACTTACTACACCTCAGAT‐
3’, mồi No.3: 5’‐CAACTGTTCAA ACTGATGGG‐ 3’), trên hệ thống máy CEQ 8800 sequencer (Beckman Coulter, Mỹ). Kết quả giải trình tự được phân tích bằng phần mềm BioEdit và công
cụ so sánh trình tự trực tuyến Blast search
Phương pháp đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu, chính xác của kỹ thuật ASB RealTime PCR phát hiện đột biến T1799A
Độ nhạy của kỹ thuật được tính theo công thức sau:
Độ nhạy =(TP/(TP + FN)) x 100.
Độ đặc hiệu của kỹ thuật được tính theo công thức sau:
Độ đặc hiệu =(TN/(TN + FP)) x 100.
Độ chính xác của kỹ thuật được tính theo công thức sau:
Độ chính xác =((TP + TN)/(TP + TN + FP + FN)) x 100.
Trong đó: TP: Là các mẫu FNAC phát hiện dương tính
với đột biến T1799A và kết quả chẩn đoán mô bệnh học
là ung thư tuyến giáp thể nhú; FP: Là các mẫu FNAC
phát hiện dương tính với đột biến T1799A nhưng kết
quả mô bệnh học là lành tính; TN: Là các mẫu FNAC
âm tính với đột biến T1799A và kết quả chẩn đoán mô
bệnh học là lành tính; FN: Là các mẫu FNAC âm tính
với đột biến T1799A và kết quả chẩn đoán mô bệnh học
là ung thư tuyến giáp thể nhú.
Phân tích và xử lý số liệu
Số liệu nghiên cứu được tổng hợp và xử lý theo phương pháp thống kê y học sử dụng phần mềm STAT 7.0 và STAVIEW 4.57.
KẾT QUẢ Kết quả chẩn đoán tế bào bằng kỹ thuật FNAC
Bảng 1. Kết quả chẩn đoán tế bào bằng kỹ thuật
FNAC và mô bệnh học.
Trang 4FNAC là 40/45 (88,9%), có 5 bệnh nhân được
chẩn đoán là nghi ngờ bằng FNAC, trong 5 BN
này có 3 BN là UTTGTN, còn lại 2 BN là u tuyến
giáp lành tính.
Kết quả phát hiện đột biến gen braf
T1799A bằng kỹ thuật ASB RealTime PCR
trên các mẫu FNAC
Bảng 2. Kết quả phát hiện đột biến T1799A trên 45
mẫu bệnh phẩm FNAC.
Kết quả chẩn đoán
FNAC
BRAF T1799A (+) (n, %)
BRAF T1799A (-) (n, %)
Bướu nang tuyến
giáp
Nhận xét: Như vậy, trên 45 mẫu FNAC
chúng tôi phát hiện được 37 mẫu có đột biến gen
braf T1799A. Tỷ lệ đột biến gen braf T1799A ở
nhóm UTTG cao hơn so với 2 nhóm còn lại.
Giá trị của đột biến gen braf T1799A trong
chẩn đoán ung thư tuyến giáp thể nhú
Bảng 3. So sánh độ nhạy, đặc hiệu, chính xác của kỹ
thuật ASB RealTime PCR phát hiện đột biến T1799A
với kỹ thuật FNAC trong chẩn đoán UTTGTN.
Phương pháp chẩn
đoán
hiệu
Độ chính xác
Nhận xét: Độ chính xác, độ nhạy và độ đặc
hiệu của kỹ thuật ASB RealTime là cao hơn so
với FNAC trong chẩn đoán UTTGTN (91,1%,
92,3% và 83,3% so với 88,8%, 90,5% và 33,3%).
BÀN LUẬN
Đột biến gen braf là một trong những dấu ấn
phân tử giúp chẩn đoán phát hiện UTTGTN với
độ nhạy và độ đặc hiệu tương ứng 80% và 99,7%
khi kết hợp với kỹ thuật chẩn đoán tế bào(13). Xác
định được đột biến gen braf T1799A sẽ giúp hạn
chế các trường hợp chẩn đoán UTTGTN bị bỏ
sót bởi kỹ thuật FNAC, nâng cao chất lượng
chẩn đoán, theo dõi và quản lý bệnh nhân. Giá
trị chẩn đoán xác định của các dấu ấn SHPT khi
kết hợp với chẩn đoán tế bào sẽ đem lại lợi ích cho bệnh nhân trong các trường hợp bắt buộc phải phẫu thuật, phẫu thuật triệt để phòng chống ung thư tái phát.
Trong chẩn đoán ban đầu, giá trị lớn nhất của dấu ấn phân tử này được thể hiện trong việc
hỗ trợ kỹ thuật FNAC chẩn đoán chính xác hơn, đặc biệt trong các trường hợp chẩn đoán nghi ngờ hoặc không xác định. Trong công trình công
bố bởi Suk Kyeong Kim và cộng sự năm 2011 cho thấy, trong số 865 trường hợp FNAC u tuyến giáp, 504, 141, 54, 140, 10 và 16 được chẩn đoán là bướu nhân, nghi ngờ, nghi ngờ ung thư, ung thư, nghi ngờ ung thư tuyến giáp thể nang
và không đủ tiêu chuẩn. Thì tỉ lệ phát hiện đột biến T1799A trên các nhóm được chẩn đoán FNAC tương ứng: 0% với nhóm bướu nhân, 45/141 (31,9%) với nhóm nghi ngờ, 46/54 (85,2%) với nhóm nghi ngờ ung thư, 129/140 (92,1%) với nhóm ung thư và 1/10 (10%) với nhóm nghi ngờ ung thư tuyến giáp thể nang. Đặc biệt trong số
45 trường hợp nghi ngờ phát hiện có đột biến T1799A, 30 trường hợp được làm xét nghiệm mô bệnh học sau mổ xác định 29 ca là UTTGTN và 1
ca là hạch viêm quá sản(12). Trong nghiên cứu của chúng tôi với 45 mẫu FNAC thì có 37, 5, 3 mẫu được chẩn đoán là carcinôm tuyến giáp, nghi ngờ carcinôm và bướu nang. Tỷ lệ phát hiện đột biến T1799A trên các mẫu này tương ứng là 32/37 (86,5%) carcinôm tuyến giáp, 3/5 (60%) nghi ngờ carcinôm và 2/3 (66,7%) bướu nang. Trong khi kết quả hồi cứu mô bệnh học có 39/45 (86,7%) carcinôm thể nhú và 6/45 (13,3%) bướu tuyến giáp lành tính, tương ứng với tỉ lệ phát hiện đột biến T1799A là 36/39 (92,3%) và 1/6 (16,7%) (Bảng 1, 2 và Phụ lục 1). Trong số 05 mẫu FNAC chẩn đoán nghi ngờ carcinôm có 03 mẫu phát hiện đột biến T1799A, phù hợp kết quả mô bệnh học carcinôm thể nhú. 2/3 mẫu FNAC bướu nang dương tính với đột biến T1799A, xét nghiệm mô bệnh học xác nhận 01 mẫu bướu tuyến giáp lành tính và 01 mẫu vi carcinôm thể nhú. Như vậy, kết quả nghiên cứu của chúng tôi cũng tương tự như những nghiên cứu trước đây. Từ những kết quả đó cho thấy độ
Trang 5nhạy của ASB RealTime PCR thấp hơn so với
FNAC (92,1% so với 97,6%), nhưng độ đặc hiệu
thì cao hơn (83,3% so với 33,3%) và độ chính xác
cũng cao hơn (90,9% so với 89,4%).
KẾT LUẬN
Xét nghiệm phát hiện đột biến gen braf
T1799A nên được kết hợp với FNAC trong thực
hành lâm sàng chẩn đoán ung thư tuyến giáp
thể nhú.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1 Baloch ZW, LiVolsi VA, Asa SL, Rosai J et al (2008). Diagnostic
terminology and morphologic criteria for cytologic diagnosis
of thyroid lesions: a synopsis of the National Carcinôm
Institute Thyroid Fine‐Needle Aspiration State of the Science
Conference. Diagn Cytopathol, 36:425–437.
2 Cooper DS, Doherty GM, Haugen BR et al (2006).
Management guidelines for patients with thyroid nodules and
differentiated thyroid carcinôm. Thyroid, 16:109–142.
3 Cooper DS, Doherty GM, Haugen BR, Kloos RT et al (2006).
Management guidelines for patients with thyroid nodules and
differentiated thyroid carcinôm, Thyroid, 16:109–142.
4 Fukushima T, Suzuki S, Mashiko M, Ohtake T et al (2003).
BRAF mutations in papillary carcinôms of the thyroid.
Oncogen, 22: 6455‐6457.
5 Gharib H & Goellner JR (1993). Fine‐needle aspiration biopsy
of the thyroid: an appraisal. Annals of Internal Medicine, pp.
282–289.
6 Hoàng Quốc Trường và cs (2011). Chẩn đoán nhanh vi khuẩn
lao kháng rifampicin bằng kỹ thuật khuếch đại gene đa mồi
đặc hiệu alen. Tạp chí Y dược lâm sàng 108, 6(5):74–79.
7 Hoàng Quốc Trường và cs (2012). Nghiên cứu xây dựng quy
trình phát hiện đột biến gen braf T1799A trong ung thư tuyến
giáp thể nhú bằng kỹ thuật ASB RealTime PCR. Tạp chí Y‐
Dược học Quân sự, 37: 20 – 25.
8 Kim SK, Hwang TS, Yoo YB, Han HS, Kim DL, et al (2011). Surgical Results of Thyroid Nodules according to a Management Guideline Based on the BRAF V600E Mutation Status. J Clin Endocrinol Metab, 96(3): 658 – 64.
9 Lang AH et at (2011). Optimized Allele‐Specific RealTime PCR assays for the detection of common mutations in KRAS and BRAF. The Journal of Molecular Diagnostics, 13(1): 23 – 28.
10 M Xing (2005). BRAF mutation in thyroid carcinôm.
Endocrine‐Related Carcinôm, 12: 245‐262.
11 Mazzaferri EL (1993). Management of a solitary thyroid nodule. N Engl J Med, 328:553–559.
12 Nikiforov YE, Steward DL, Robinson‐Smith T, et al (2009). Molecular testing for mutations in improving the fine needle aspiration diagnosis of thyroid nodules. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism, 94: 2092–2098.
13 Pacini F et al (2010). Impact of Proto‐Oncogene Mutation Detection in Cytological Specimens from Thyroid Nodules Improves the Diagnostic Accuracy of Cytology. J Clin Endocrinol Metab, 95(3):1365– 369.
14 Robertson ML, Steward DL, Gluckman JL, Welge J (2004). Continuous laryngeal nerve integrity monitoring during thyroidectomy: does it reduce risk of injury? Otolaryngol. Head Neck Surg, 131:596–600.
15 Sclabas GM, Staerkel GA, Shapiro SE, Fornage BD, et al (2003). Fine‐needle aspiration of the thyroid and correlation with histopathology in a contemporary series of 240 patients. Am J Surg, 186: 702–709.
16 Xing M et al (2005). BRAF mutation predicts a poorer clinical prognosis for papillary thyroid carcinôm. J Clin Endocrinol Metab, 90: 6373‐6379
17 Yassa L, Cibas ES, Benson CB, Frates MC, Doubilet PM,Gawande AA, Moore Jr FD, Kim BW, Nose´ V, Marqusee
E, Larsen PR, Alexander EK (2007). Long term assessment of a multidisciplinary approach to thyroid nodule diagnostic evaluation. Carcinôm, 111:508–516.
Ngày nhận bài báo 18‐06‐2013 Ngày phản biện nhận xét bài báo: 20‐06‐2013 Ngày bài báo được đăng: 15–07‐2013