Mục tiêu nghiên cứu của đề tài này nhằm phân tích TLR5+1174 ở ba nhóm người Trung Quốc, Ấn Độ và Mã Lai cư ngụ ở Malaysia; đánh giá mối liên hệ giữa điểm đa hình này với nhiễm khuẩn H. pylori hay nguy cơ ung thư dạ dày. Nghiên cứu áp dụng trên 370 đối tượng tham gia nghiên cứu; nhóm chứng: 123 người Trung Quốc, 108 người Ấn Độ, 84 người Mã Lai và nhóm bệnh gồm 55 người Trung Quốc bị ung thư dạ dày.
Trang 1ĐIỂM ĐA HÌNH TLR5+1174 KHÔNG ẢNH HƯỞNG ĐẾN NGUY CƠ UNG
THƯ DẠ DÀY HAY NHIỄM Helicobacter pylori
Hà Mai Dung *
, Hazel Mitchell**
TÓM TẮT
Mở đầu: Helicobacter pylori là vi khuẩn có chiên mao quan trọng vì lây nhiễm khoảng nửa dân số thế
giới và có thể đưa đến bệnh lý nặng là ung thư dạ dày Điểm đa hình TLR5+1174 là điểm đa hình có chức năng đáng được nghiên cứu của gen TLR5 trong mối liên hệ với các vi khuẩn có chiên mao
Mục tiêu nghiên cứu: Phân tích TLR5+1174 ở ba nhóm người Trung Quốc, Ấn Độ và Mã Lai cư ngụ
ở Malaysia; đánh giá mối liên hệ giữa điểm đa hình này với nhiễm khuẩn H pylori hay nguy cơ ung thư dạ dày
Đối tượng và phương pháp nghiên cứu: Hai nhóm bao gồm 370 đối tượng tham gia nghiên cứu;
nhóm chứng: 123 người Trung Quốc, 108 người Ấn Độ, 84 người Mã Lai và nhóm bệnh gồm 55 người Trung Quốc bị ung thư dạ dày TLR5+1174 được phân tích bằng phương pháp PCR-RFLP với enzyme giới hạn là DdeI Nhiễm khuẩn H pylori được xác định bằng kít ELISA HELICOBACTER PYLORI IgG của Biohit Diagnostics SPSS phiên bản 17 và GraphPad InStat3 dùng để xác định 2 test, Fisher Exact test
và OR
Kết quả: Có sự khác biệt có ý nghĩa về điểm đa hình TLR5+1174 giữa nhóm Trung Quốc và nhóm Ấn
Độ hay nhóm Mã Lai Không có mối liên hệ giữa TLR5+1174 và nhiễm H pylori hay ung thư dạ dày
Kết luận: Đặc điểm điểm đa hình TLR5+1174 ở các dân tộc khác nhau có thể khác nhau TLR5 có thể
không có mối liên hệ với nhiễm khuẩn H pylori hay nguy cơ ung thư dạ dày
Từ khóa: Điểm đa hình, Toll like receptor 5, nhiễm Helicobacter pylori, ung thư dạ dày
ABSTRACT
TLR5 + 1174 SPN NOT ASSOCIATED WITH GASTRIC CANCER RISK
OR Helicobacter pylori Infection
Ha Mai Dung, Hazel Mitchell * Y Hoc TP Ho Chi Minh * Vol 15 - Supplement of No 1 - 2011: 36 - 41
Background: Helicobacter pylori was an important flagellated bacterium because it infected a half of
the world population and could lead to a severe outcome, gastric cancer TLR5+1174 polymorphism was a functional polymorphism of the gen TLR5 and was considered to be worth to be studied in the association
with H pylori infection or gastric cancer risk
Aims: Anylyzing TLR5+1174 polymorphism in three control ethnic groups resident in Malaysia
including Chinese, Indian and Malay Evaluating the association between this SNP (Single Nucleotide
Polymorphism) with H pylori infection or gastric cancer risk
Methods: Two groups include 370 subjects participating in the study; a control group including 123
Chinese, 108 Indians and 84 Malays; and a case group of 55 Chinese gastric cancers TLR5+1174 polymorphism was analyzed by PCR-RFLP with the restriction enzyme DdeI H pylori infection was
*
Trường Đại học Quốc tế - Đại học Quốc gia Tp.HCM
**
Trường Đại Học New South Wales, Sydney, Australia
Trang 2determined by ELISA HELICOBACTER PYLORI IgG from Biohit Diagnostics SPSS version 17 and GraphPad InStat3 was used to calculate 2 test, Fisher Exact test and OR
Results: Significant differences in TLR5+1174 were found between the Chinese and the Indians or the
Malays No association was found between TLR5+1174 and H pylori infection or gastric cancer
Conclusion: Characteristics of TLR5+1174 polymorphism in different ethnic groups may be different TLR5 may not associate with H pylori infection or gastric cancer risk
Keywords: Single Nucleotide Polymorphism, Toll like receptor 5, Helicobacter pylori infection,
gastric cancer
MỞ ĐẦU
Helicobacter pylori được xem là một tác
nhân nhiễm khuẩn quan trọng vì có hơn phân
nửa dân số thế giới nhiễm phải loại vi khuẩn
này; tình trạng nhiễm khuẩn kéo dài cả đời
nếu không được điều trị thỏa đáng và bệnh
cảnh nhiễm khuẩn đa dạng từ viêm dạ dày
mãn tính, viêm loét dạ dày tá tràng đến ung
thư dạ dày(11) Tuy nhiên có thể thấy một điều
là tại sao H pylori có thể gây ra một bệnh cảnh
nhiễm khuẩn kéo dài cả đời ở người như vậy
vẫn là một câu hỏi chưa có những trả lời
thích đáng
Ung thư dạ dày là bệnh cảnh trầm trọng
nhất của nhiễm H pylori Mối liên hệ giữa
nhiễm H pylori và ung thư dạ dày đã được
xác định qua nhiều nghiên cứu khác nhau
trên thế giới(6,9,10,14,15,16) Tuy nhiên việc chỉ có
một tỉ lệ nhỏ (<3%) người nhiễm H pylori phát
triển ung thư dạ dày (18) đưa ra một vấn đề là
ngoài yếu tố nhiễm khuẩn còn có những yếu
tố khác tham gia vào cơ chế bệnh sinh của
ung thư dạ dày Gần đây yếu tố di truyền của
người bệnh đã được nghiên cứu nhiều và cho
thấy có góp phần vào việc phát sinh ung thư
dạ dày(19,3,4,2,12)
Việc H pylori là vi khuẩn có một chùm
chiên mao ở một cực đưa đến một câu hỏi là
liệu các chiên mao này có vai trò gì trong
bệnh cảnh nhiễm khuẩn mãn tính của H
pylori hay việc phát triển bệnh lý ung thư dạ
dày hay không Trong hệ thống miễn dịch
không đặc hiệu chống lại bệnh nhiễm khuẩn,
TLR5 (Toll Like Receptor 5) là các thụ thể
nhận biết protein flagellin của các chiên mao
của vi khuẩn Một số nghiên cứu khởi đầu vào năm 2003 và 2005 cho thấy là có thể quá
trình nhiễm khuẩn H pylori có liên quan đến
các thụ thể TLR5(13,17) Xem xét các điểm đa
hình của gen TLR5 có chức năng là
TLR5+1174C>T (Arg392Stop), TLR5+2081A>G
(Asp694Gly) và TLR5+2464C>T (Leu822Phe) thì hai điểm đa hình TLR5+2081A>G và
TLR5+2464C>T chiếm tỉ lệ rất thấp trong cộng
đồng (<5%) nên không được xem xét; điểm đa
hình TLR5+1174C>T cho thấy là đáng được
nghiên cứu vì chiếm tỉ lệ tương đối khá (11,85%) trong một số nghiên cứu và cũng được chứng minh là có liên quan đến bệnh
nhiễm vi khuẩn có chiên mao như là Legionella
pneumophila(5,8)
MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU
Phân tích điểm đa hình TLR5+1174C>T ở
ba nhóm người Trung Quốc, Ấn Độ và Mã Lai
cư ngụ ở Malaysia để xem có sự khác biệt; đồng thời đánh giá mối liên hệ giữa điểm đa
hình này với tình trạng nhiễm khuẩn H pylori
hay ung thư dạ dày
ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tượng nghiên cứu
Đối tượng nghiên cứu được thu thập từ phòng nội soi đường tiêu hoá trên tại Bệnh viện của khoa Y, trường đại học Malaysia từ tháng 01/2004 đến tháng 7/2007 Có 55 trường hợp người Trung Quốc bị ung thư dạ dày không phải ở tâm vị, được chẩn đoán dựa vào kết quả giải phẩu bệnh là ICD-9 151 tham gia nghiên cứu; và 315 người không có tổn thương dạ dày bao gồm 123 người Trung Quốc, 108 người Ấn Độ và 84 người Mã Lai
Trang 3tham gia nghiên cứu với vai trò làm nhóm
chứng Tất cả các trường hợp này đều không
được sử dụng kháng sinh, kháng viêm hay
kháng acid hai tháng trước khi tham gia
nghiên cứu Các trường hợp nhiễm HIV cũng
bị loại trừ Các đối tượng tham gia nghiên cứu
ký giấy đồng ý tham gia nghiên cứu, cho 5ml
máu toàn phần với chất chống đông EDTA để
phân tích đa hình gen và 5ml máu đông dùng
ly trích huyết thanh để chẩn đoán nhiễm
Helicoabcter pylori Tóm tắt về tuổi và giới của
các đối tượng tham gia nghiên cứu được mô
tả trong bảng 1
Bảng 1: Số lượng, tuổi trung bình và giới của các
nhóm tham gia nghiên cứu
Tuổi trung bình (khoảng tuổi)
Giới (%
nam)
Người Trung Quốc
Người Ấn Độ bình
Người Mã Lai
Người Trung Quốc
ung thư dạ dày dạng
Phương pháp nghiên cứu
Ly trích DNA: DNA được ly trích từ máu
toàn phần bằng cách sử dụng bộ kít Qiagen
Blood minikit và thực hiện theo hướng dẫn
của nhà sản xuất
Xác định các đa hình của TLR5+1174: Bằng
kỹ thuật PCR-RFLP (Polymerase Chain
Reaction - Restriction Fragment Length
Polymorphism) bao gồm hai bước Bước 1
thực hiện phản ứng PCR với PCR kit của công
ty Qiagen và cặp mồi TLR5+1174F: GGT AGC
CTA CAT TGA TTT GC và TLR5+1174R: GAT
TCT CTG AAG GGG TTT G Cặp mồi này
được tác giả thiết kế có một số thay đổi so với
cặp mồi của tác giả Hawn trước đó (8) Điều
kiện phản ứng PCR như sau: Biến tính chuỗi
DNA ở 940C trong 4 phút; sau đó thực hiện 35
chu kỳ nhiệt với 940C 30 giây, 560C 30 giây,
720C 45 giây; sau cùng là 720C trong 5 phút
Bước 2 là dùng dùng enzym giới hạn DdeI
(công ty New England Biolabs) cắt sản phẩm PCR và xác định kiểu mẫu cắt bằng cách chạy điện di với agarose 2% có kèm FN1 DNA ladder để so sánh Sau đó bản thạch được nhuộm với Ethidium bromide và đọc kết quả bằng hệ thống Gel Doc Các genotype của
điểm đa hình TLR5+1174 được xác định như
trong hình 1
Đánh giá tình trạng nhiễm H pylori: bằng
kít ELISA HELICOBACTER PYLORI IgG của công ty Biohit Diagnostics
Quản lý và phân tích dữ liệu bằng Phần
mềm SPSS phiên bản 17 Phần mềm GraphPad InStat 3 dùng để xác định Chisquare test, Fisher Exact test và OR (Odd Ratio) nhằm xác định mối liên quan giữa điểm đa hình
TLR5+1174 và nhiễm H pylori hay ung thư
dạ dày
KẾT QUẢ Tất cả các nhóm nghiên cứu đều thoả mãn tiêu chuẩn Hardy-Weinberg equilibrium
Khi phân tích điểm đa hình TLR5+1174,
các nhóm nghiên cứu đều thoả mãn tiêu chuẩn Hardy-Weinberg equilibrium với các giá trị p>0,05 Cụ thể giá trị p bằng 1 (nhóm Trung Quốc); 0,6 (nhóm Ấn Độ) và 0,6 (nhóm
Mã Lai)
Có sự khác biệt có ý nghĩa về kiểu gen của
điểm đa hình TLR5+1174 giữa nhóm Trung
Quốc và nhóm Ấn độ hay nhóm Mã Lai
Trang 4So sánh tần suất các genotype và T allele
của TLR5+1174 giữa ba nhóm dân tộc sống ở
Malaysia cho thấy tần suất genotype C/T ở
người Trung Quốc (2,4%) thấp rõ rệt so với
người Ấn Độ (18,5%) hay người Mã Lai
(21,4%) (p<0,001) Tương tự tần suất T allele là
rất thấp ở người Trung Quốc (1%) so với
người Ấn Độ (9%) hay người Mã Lai (11%)
(p<0,001) (bảng 2)
Bảng 2: Tần suất các đa hình của TLR5+1174 ở ba
nhóm dân tộc cư ngụ ở Malaysia
Kiểu đa hình
Trung Quốc n=123 n(%)
Ấn độ n=108 n(%)
Mã Lai n=84 n(%)
Giá trị P (Two-sided 2 test)
Kiểu đa hình
Trung Quốc n=123 n(%)
Ấn độ n=108 n(%)
Mã Lai n=84 n(%)
Giá trị P (Two-sided 2 test)
C/C 120(97,6) 88(81,5) 66(78,6) Tần suất T
Không có mối liên hệ giữa các đa hình của
TLR5+1174 và nhiễm H pylori
Ở mỗi nhóm dân tộc được chia ra hai
nhóm nhỏ là H pylori (+) và H pylori (-) So sánh kiểu đa hình của TLR5+1174 giữa hai nhóm H pylori (+) và H pylori (-) không cho
thấy sự khác biệt có ý nghĩa với tất cả giá trị p>0,05 Tuy nhiên ở nhóm người Trung Quốc, những người mang genotype C/T hay allele T
ở nhóm H pylori (+) nhiều hơn 5,2 hay 5,1 lần
so với nhóm H pylori (-) (bảng 3).
Bảng 3: So sánh các điểm đa hình của TLR5+1174 giữa hai nhóm H pylori (-) và H pylori (+) ở các nhóm
chứng tham gia nghiên cứu
Kiểu đa hình
TLR5+1174
H pylori (-)
Giá trị P (Two-sided Fisher’s Exact test)
Không có mối liên hệ giữa các đa hình của
TLR5+1174 và ung thư dạ dày ở nhóm người
Trung Quốc
Phân tích mối liên hệ giữa kiểu đa hình
của TLR5+1174 với ung thư dạ dày dạng
không nằm ở tâm vị (non-cardia gastric cancer) ở nhóm người Trung Quốc cho thấy không có sự liên hệ có ý nghĩa với giá trị p=0,4 Tuy nhiên cũng có thể quan sát thấy genotype C/T và allele T phổ biến nhiều hơn ở nhóm người bệnh với OR=2,3 (bảng 4)
Trang 5Bảng 4: So sánh các kiểu đa hình của TLR5+1174
giữa nhóm người Trung Quốc chứng và nhóm
người Trung Quốc bị ung thư dạ dày
Kiểu đa
hình
TLR5+11
74
Nhóm
Trung
Quốc
chứng
n(%)
Nhóm Trung Quốc ung thư dạ dày n(%)
OR(95%CI)
Giá trị P (Two-sided Fisher’s Exact test)
2,3(0,5-11,8)
C allele 243(98,8) 107(97,3) 1(ref) 0,4
T allele 3(1,2) 3(2,7)
2,3(0,5-11,4)
BÀN LUẬN
Có thể quan sát thấy sự khác biệt rõ rệt về
tần suất genotype C/T hay allele T của điểm
đa hình TLR5+1174 giữa người Trung Quốc
và người Ấn hay người Mã Lai (p<0,001)
Điều này cho thấy khi thực hiện các nghiên
cứu về di truyền ngay trong một quốc gia, sự
chọn lọc nhóm tham gia nghiên cứu có nguồn
gốc dân tộc giống nhau cần được quan tâm
Điểm đa hình TLR5+1174 là một điểm đa
hình có chức năng với sự thay đồi nucleotide
từ C sang T dẫn đến sự thay đổi từ axít amin
Arginin ở vị trí 392 của gen thành stop codon;
sự thay đổi này làm đình chỉ hoạt động của
gen Gen TLR5 được xem là gen liên quan đến
phản ứng của cơ thể với với cấu trúc chiên
mao (flagellar) của vi khuẩn có chiên mao như
Salmonella sp, Helicobacter sp hay Legionella sp;
Sự khác biệt về mặt di truyền của gen này của
nhóm người Trung Quốc, Ấn và Mã Lai có thể
góp phần dẫn đến sự nhạy cảm với các bệnh
nhiễm khuẩn này ở các dân tộc này là khác
nhau
Vấn đề nghiên cứu mối liên hệ giữa gen
TLR5 và nhiễm khuẩn H pylori lúc đầu được
đặt ra vì như trong phần mở đầu đã đề cập,
do có một số báo cáo trước đó cho thấy có
mối liên hệ giữa nhiễm H pylori và TLR5 (13, 17)
Tuy nhiên kết quả của nghiên cứu này cho
thấy không có mối liên quan có ý nghĩa thống
kê giữa điểm đa hình TLR5+1174 và nhiễm H
pylori (tất cả giá trị p>0,05) Nhìn lại những kết
quả nghiên cứu gần đây về mối liên quan
giữa TLR5 và nhiễm H pylori cho thấy những
kết quả trái ngược nhau Nếu như tác giả Smith và cộng sự cho rằng TLR2 và TLR5 là các thụ thể quan trọng của miễn dịch không
đặc hiệu trong việc nhận dạng H pylori (13), thì một số tác giả khác lại cho rằng TLR5 không
đóng vai trò nhận biết nhiễm khuẩn H pylori
(1, 7) Cụ thể tác giả gewirtz và cộng sự chứng minh rằng so với các vi khuẩn có chiên mao
khác, H pylori không tiết flagellin; flagellin tái
tổ hợp của H pylori cho thấy hoạt động 1000 lần kém hơn so với flagellin của Salmonella
typhimurium trong tác dụng kích hoạt TLR5;
thử nghiệm huỷ gen H pylori FlaA cũng cho
thấy không ảnh hưởng đến quá trình tiết IL-8
do nhiễm H pylori (7) Mối liên hệ giữa giữa điểm đa hình
TLR5+1174 và ung thư dạ dày cũng được
đánh giá ở nhóm người Trung Quốc (do số lượng bệnh ung thư dạ dày tham gia nghiên cứu tương đối lớn ở nhóm này) cho thấy không có mối liên hệ có ý nghĩa thống kê giữa điểm đa hình này và ung thư dạ dày (bảng 4)
KẾT LUẬN
Đặc điểm điểm đa hình TLR5+1174 ở các
dân tộc khác nhau có thể khác nhau, điều này đòi hỏi sự giống nhau về dân tộc của các đối tượng tham gia nghiên cứu trong các nghiên cứu về đặc điểm di truyền
Nghiên cứu này cho thấy điểm đa hình
TLR5+1174 không có mối liên hệ với nhiễm
khuẩn H pylori hay ung thư dạ dày Điều này
cho thấy rằng có thể là TLR5 không đóng vai
trò gì trong nhiễm khuẩn H pylori hay ung
thư dạ dày
CÁM ƠN
Nghiên cứu này được thực hiện với sự giúp đỡ kinh phí từ hiệp hội ung thư New South Wales, Australia (REF 66/04)
Trang 6TÀI LIỆU THAM KHẢO
Cookson BT, Logan SM, et al (2005) Evasion of Toll-like
receptor 5 by flagellated bacteria Proceedings of the
National Academy of Sciences of the United States of
America 102(26):9247-52
Helicobacter pylori infection in gastric cancer World
Journal of Gastroenterology 12(2):181-6
what is new? Cancer Epidemiology, Biomarkers &
Prevention 14(8):1865-8
inflammation, and the development of malignancy Current
Opinion in Gastroenterology 21(1):32-8
V, et al (2005) Host susceptibility and clinical outcomes in
toll-like receptor 5-deficient patients with typhoid fever in
Vietnam Journal of Infectious Diseases 191(7):1068-71
Wald N, et al (1991) Association between infection with
Helicobacter pylori and risk of gastric cancer: evidence from
a prospective investigation British Medical Journal
302(6788):1302-5
RM, Jr (2004) Helicobacter pylori flagellin evades toll-like
receptor 5-mediated innate immunity Journal of Infectious
Diseases 189(10):1914-20
et al (2003) A common dominant TLR5 stop codon
polymorphism abolishes flagellin signaling and is associated
with susceptibility to legionnaires' disease Journal of
Experimental Medicine 198(10):1563-72
pylori Lyon, IARCPress
Konishi T, et al (1995) Serum anti-Helicobacter pylori
antibody and gastric carcinoma among young adults
Research Group on Prevention of Gastric Carcinoma among Young Adults Cancer 75(12):2789-93
H, et al (1995) Local acid production and Helicobacter pylori: a unifying hypothesis of gastroduodenal disease European Journal of Gastroenterology & Hepatology 7(5):461-5
gastric cancer prevention is possible Cancer Detection & Prevention 28(6):392-8
AM, Ryan K, et al (2003) Toll-like receptor (TLR) 2 and TLR5, but not TLR4, are required for Helicobacter pylori-induced NF-kappa B activation and chemokine expression
by epithelial cells Journal of Biological Chemistry 278(35):32552-60
Perez-Perez GI, Blaser MJ (1991) Helicobacter pylori infection and gastric carcinoma among Japanese Americans in Hawaii New England Journal of Medicine 325(16):1132-6
Vogelman JH, Orentreich N, et al (1991) Helicobacter pylori infection and the risk of gastric carcinoma New England Journal of Medicine 325(16):1127-31
association between Helicobacter pylori infection and gastric cancer Lancet 341:1359-62
pylori induces interleukin-8 secretion by Toll-like receptor 2- and Toll-like receptor 5-dependent and -independent pathways Infection & Immunity 73(3):1523-31
Yamaguchi S, Yamakido M, et al (2001) Helicobacter pylori infection and the development of gastric cancer New England Journal of Medicine 345(11):784-9
A (2006) Of microbe and man: determinants of Helicobacter pylori-related diseases FEMS Microbiology Reviews 30(1):131-56