Nghiên cứu được thực hiện với mục tiêu nhằm khảo sát tỉ lệ và kiểu đột biến của gen H-ras trong ung thư hốc miệng và giải trình tự chuỗi DNA của gen H-ras tại các exon 1 và 2 trong 18 ca ung thư tế bào gai ở hốc miệng. Mời các bạn cùng tham khảo bài viết để nắm rõ nội dung chi tiết.
Trang 1PHÁT HIỆN TỈ LỆ TƯƠNG ĐỐI CAO ĐỘT BIẾN GEN H-RAS
VÀ GEN P53 TRONG UNG THƯ HỐC MIỆNG Ở NGƯỜI VIỆT NAM
Nguyễn Thị Hồng*
TÓM TẮT
Mở đầu: Gen ras là một trong những oncogen thường bị đột biến nhất trong các ung thư ở người Trong
một nghiên cứu trước đây (năm 2002), chúng tôi đã tìm thấy 44,4% ung thư hốc miệng (UTHM) có đột biến gen p53 Điều này gợi ý khả năng có sự hoạt hóa oncogen ras gây ung thư, nhất là ở trường hợp không có đột biến gen đè nén bướu p53
Mục tiêu: Khảo sát tỉ lệ và kiểu đột biến của gen H-ras trong UTHM
Phương pháp: Giải trình tự chuỗi DNA của gen H-ras tại các exon 1 và 2 trong 18 ca ung thư tế bào gai ở
hốc miệng Thiết kế nghiên cứu: cắt ngang
Kết quả: Ngoài 8 ca có đột biến gen p53 đã tìm thấy, kết quả phát hiện thêm 3 ca có đột biến gen H-ras,
chiếm tỉ lệ 16,7% Trong 3 đột biến này, có 1 đột biến thêm 3 nucleotid (GGC) giữa codon 10 và codon 11 tạo ra thêm glycin (10 Gly 11) trong khung, 1 đột biến sai nghĩa tại codon 12 (GGC>AGC) và 1 đột biến sai nghĩa tại codon 13 (GGT>CGT) làm thay đổi axít amin Tất cả đột biến này đều xảy ra ở bệnh nhân nữ có thói quen nhai trầu, ung thư ở giai đoạn trễ, độ ác tính mô học thấp, và không có đột biến gen p53 Ngoài ra, có 5 đột biến im lặng (27,8%) biểu hiện đa hình nucleotid đơn (SNP) C81T Tổng cộng trong 18 ca UTHM, có 4 ca (22,2%) đột biến trên cả hai gen p53 và H-ras, tuy nhiên chỉ có đột biến gen p53 kiểu sai nghĩa hoặc ghép nối sai còn đột biến gen H-ras là đột biến im lặng
Kết luận: Đột biến gen H-ras có thể giữ vai trò quan trọng trong quá trình sinh ung thư hốc miệng ở người
Việt Nam
Từ khóa: Đột biến gen H-ras, đột biến gen p53, oncogen, gen đè nén bướu, UTHM
ABSTRACT
DETECTION OF RELATIVELY HIGH INCIDENCE OF H-RAS MUTATIONS AND P53 MUTATIONS
IN ORAL CANCER IN VIETNAMESE
Nguyen Thi Hong* Y Hoc TP Ho Chi Minh * Vol 15 - Supplement of No 2 - 2011: 128 - 133
Background: The ras gene is one of the most commonly detected mutated oncogenes in human cancers Our
previous study (2002) showed that 44.4% had mutation in p53 tumor suppressor gene We thus hypothesized that the ras oncogene could be activated, especially in cases without p53 mutation
Objectives: To investigate the incidence and patterns of H-ras mutation in oral cancer
Methods: In this cross-sectional study, DNA samples obtained from the same 18 primary oral squamous
cell carcinomas were screened for mutations of hot spots in exons 1 and 2 of the H-ras gene by DNA sequencing
Results: Besides p53 mutations found in 8 cases, the H-ras mutations were detected in 3 cases (16.7%) In
these three H-ras mutations, one was an insertion of three nucleotide (GGC) between codons 10 and 11 resulting
in in-frame insertion of glycine (10 Gly 11), one was a missense mutation in codon 12 (GGC>AGC) and one was a missense mutation in codon 13 (GGT>CGT) resulting in amino acid changes These H-ras mutations were only
*: Khoa RHM – Đại học Y Dược Tp Hồ Chí Minh
Trang 2found in female patients with betel chewing habit, advanced stage of the tumor, and low grade of malignancy, but without p53 mutation We also found silent mutations of H-ras gene, with C81T single nucleotide polymorphism (SNP), in 5 of 18 tumors (27.8%) Altogether, 4 cases (22.2%) had simultaneously H-ras mutation (silent mutation) and p53 mutation (missense or abberant splicing mutation)
Conclusion: H-ras gene mutation could play an important role in the tumorigenesis of oral carcinoma in
Vietnamese patients
Key words: H-RAS mutation, p53 mutation, oncogene, tumor suppressor gene, oral cancer
ĐẶT VẤN ĐỀ
Ung thư hốc miệng (UTHM) là một trong
mười loại ung thư thường gặp nhất(9) Mặc dù
cùng có thói quen hút thuốc, uống rượu, nhai
trầu – yếu tố nguy cơ UTHM, nhưng chỉ có một
số người có thói quen này bị ung thư Điều này
cho thấy các yếu tố di truyền có thể góp phần
thúc đẩy sự sinh ung thư Việc tìm ra những
biến đổi di truyền là cần thiết để tạo ra các chất
ức chế trong liệu pháp đích điều trị đặc hiệu
ung thư
Trong các ung thư ở người, gen đè nén bướu
p53 thường bị đột biến nhất Trong một nghiên
cứu trên 18 ca ung thư ở hốc miệng (năm 2002),
chúng tôi đã phát hiện 8 ca có đột biến gen p53,
chiếm tỉ lệ 44,4%(6) Nhiều trường hợp không có
đột biến ở gen đè nén bướu p53 gợi ý khả năng
đột biến ở oncogen
Trong các oncogen, gen ras thường bị đ ột
biến nhất(9,10) Họ gen ras, gồm có 3 gen là H-ras,
K-ras và N-ras, mã hóa protein p21 (p21 ras)
Protein này định vị ở màng tế bào, giữ vai trò
trung tâm điều hòa các đường dẫn truyền tín
hiệu tế bào Đường dẫn truyền tín hiệu
Ras-Raf-MEK-ERK hiện đang là điểm đích hấp dẫn cho
điều trị ung thư(9)
Để đánh giá đột biến gen H-ras trong
UTHM, nghiên cứu này nhằm các mục tiêu sau:
- Xác định tỉ lệ đột biến gen H-ras trong UTHM
- Khảo sát đồng đột biến gen H-ras và đột
biến gen p53 trong UTHM
- Khảo sát đột biến H-ras với một số đặc
điểm lâm sàng-giải phẫu bệnh của UTHM
ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Mẫu nghiên cứu
Gồm 18 ca ung thư tế bào gai ở hốc miệng
chưa điều trị đặc hiệu, được điều trị tại Bệnh viện Ung Bướu Tp.HCM tháng 7 và 8/2000
Thiết kế nghiên cứu
Cắt ngang mô tả
Các phương pháp thực hiện
Ly trích DNA
Ly trích DNA từ mẫu mô sinh thiết ở bướu nguyên phát bằng bộ ly trích QIAmp DNA Mini Kit (QIAGEN) theo chỉ dẫn của nhà sản xuất
Phản ứng chuỗi polymerase (PCR) khuếch đại các exon của gen p53 và gen H-ras
Nghiên cứu chỉ khảo sát đột biến từ exon 5
đến exon 8 của gen p53 do đa số (87%) đột biến gen p53 xảy ra trong những exon này(2) Dùng 4 cặp mồi để khuếch đại các exon 5, 6, 7 và 8 của
gen p53 Trình tự các nucleotid của các đoạn mồi
và phản ứng PCR đã được mô tả trong y văn (Sakai 1992)(7)
Đối với DNA của gen H-ras, trình tự các
đoạn mồi và phản ứng PCR khuếch đại exon 1
và exon 2 thực hiện như đã nêu trong y văn (Munirajan 1998, Murugan 2008)(4,5)
Mỗi đợt thí nghiệm luôn có chứng dương đã biết cho kết quả PCR (+) và một chứng âm thay thế mẫu DNA bằng nước cất Kết quả PCR được đánh giá bằng cách điện di trên gel
Giải trình tự chuỗi DNA
Tinh sạch sản phẩm PCR Thực hiện PCR qua 25 chu kỳ nhiệt để khuếch đại đoạn gen cần giải trình tự Sau đó, sản phẩm PCR tinh sạch được giải trình tự chuỗi DNA bằng Big Dye
Trang 3Terminator v 1.1 cycle sequencing kit ở máy giải
trình tự ABI-Prism 3100 Genetic Analyzer
(Applied Biosystem) Tất cả các mẫu đều được
thực hiện PCR hai lần, gồm 1 lần PCR với đoạn
mồi cùng chiều và 1 lần PCR với đoạn mồi
ngược chiều
KẾT QUẢ
Đột biến gen p53
8 ca có đột biến gen p53, chiếm tỉ 44,4% Về
exon đột biến, 2 ca đột biến ở exon 5; 2 ca ở exon
7; 3 ca ở exon 8 và 1 ca ở hai exon 7 và 8 Không
đột biến ở exon 6 (Bảng 1) Tổng cộng phát hiện
được 9 đột biến trong 8 ca, trong đó có 7 đột
biến điểm sai nghĩa (77,8%) và 2 đột biến ghép
nối sai (22,2%)
Tỉ lệ đột biến gen p53 trong nhóm bệnh nhân
có thói quen nhai trầu (57,1%), hút thuốc (42,9%)
cao hơn ở nhóm không có những thói quen trên
(25%) Tỉ lệ đột biến gen p53 ở nhóm bệnh nhân
dưới 60 tuổi, ung thư giai đoạn trễ, độ ác tính
mô học trung bình, tăng cao hơn ở nhóm bệnh
nhân trên 60 tuổi, giai đoạn sớm, độ mô học
thấp (Bảng 2)
Đột biến gen H-ras
Đột biến gen H-ras xảy ra trong 7 ca (38,9%),
trên exon 1, bao gồm (Bảng 1):
- 1 ca đột biến thêm 3 nucleotid (GGC) vào giữa codon 10 và codon 11 nên tạo ra thêm 1 axít amin là glycin (10Gly11) trong khung
- 1 ca đột biến điểm sai nghĩa tại codon 12 (GGC>AGC) và đột biến im lặng tại codon 27
- 1 ca đột biến điểm sai nghĩa tại codon 13 (GGT>CGT)
- 4 ca đột biến im lặng C81T tại codon 27 biểu hiện đa hình nucleotid đơn (SNP)
Không kể đột biến im lặng, tỉ lệ đột biến gen
H-ras trong mẫu nghiên cứu này là 16,7% Tổng
cộng có 8 đột biến trong 7 ca Trong đó, có 5 đột biến im lặng không làm thay đổi protein (62,5%)
và 3 đột biến làm thay đổi protein (37,5%)
Trong 3 ca đột biến này, có 2 ca đột biến điểm (66,7%) Tất cả 3 ca này đều xảy ra ở bệnh nhân nữ, trên 60 tuổi, có thói quen nhai trầu, ung thư ở giai đoạn trễ, bướu có độ ác tính mô
học thấp và không có đột biến gen p53 (Bảng 3)
Đồng đột biến p53 và H-ras
Có 4 ca (22,2%) đột biến xảy ra trên cả hai
gen p53 và H-ras Tuy nhiên, chỉ có đột biến gen
p53 kiểu sai nghĩa hoặc ghép nối sai trong khi
đột biến gen H-ras là đột biến im lặng
Bảng 1: Đột biến gen H-ras và đột biến gen p53 trong 18 ca UTHM
ST
T Tuổi Giới Thói quen Vị trí mô Độ
học
Giai đoạn
p53
(exon5-8)
Nucl-eotid
Codon Axit
Amin
Kiểu đột biến
1
81
GGC-AGC CAT-CAC
G12S H27H
Sai nghĩa
Im lặng
(-)
6 70 Nam Hút thuốc Sàn m 2 III 81 CAT-CAC H27H Im lặng Exon 7, 8
*: Nhai trầu kèm xỉa thuốc lá
Trang 4Bảng 2: Đột biến gen p53 và lâm sàng-giải phẫu
bệnh UTHM
Đặc điểm Tổng
18 ca
Đột biến p53
8 ca (44,4%)
Không đột biến p53 10 ca (55,6%) Tuổi ≤60 7 4 (57,1) 3 (42,9)
>60 11 4 (36,4) 7 (63,6)
Giới
tính
Thói
quen
Nhai
trầu
Hút
thuốc
Không 4 1 (25,0) 3 (75,0)
Vị trí Lưỡi 7 2 (28,6) 5 (71,4)
Sàn
miệng
Giai
đoạn
I và II 3 1 (33,3) 2 (66,7)
III và
IV 15 7 (46,6) 8 (53,3)
Độ mô
học
Độ 1 11 4 (36,4) 7 (63,6)
Độ 2 7 4 (57,1) 3 (42,9)
Bảng 3: Đột biến gen H-ras và lâm sàng-giải phẫu
bệnh UTHM
Đặc điểm Tổng
18 ca
Đột biến H-ras
3 ca (16,7%)
Không đột biến Hras 12 ca (83,3%)
Tuổi
≤60
>60
7
11
0 (0)
3 (27,3)
7 (100)
8 (72,7) Giới tính
Nam
Nữ
7
11
0 (0)
3 (27,3)
7 (100)
8 (72,7) Thói quen
Nhai trầu
Hút thuốc
Không
7
7
4
3 (42,9)
0 (0)
0 (0)
4 (57,1)
7 (100)
4 (100)
Vị trí
Lưỡi
Má
Sàn miệng
Môi
Nướu
7
6
2
2
1
0 (0)
2 (33,3)
0 (0)
0 (0)
1 (100)
7 (100,0)
4 (66,7)
2 (100)
2 (100)
0 (0) Giai đoạn
I và II
III và IV
3
15
0 (0)
3 (20,0)
3 (100)
12 (80,0)
Độ mô học
Độ 1
Độ 2
11
7
3 (27,3)
0 (0)
8 (72,7)
7 (100)
BÀN LUẬN
Khảo sát đột biến gen p53 và gen H-ras
Hơn 30% ung thư ở người có đột biến trên
1 trong 3 gen ras: K-, N- và H-ras Để phân tích đột biến gen ras, nghiên cứu này chọn khảo sát gen H-ras, vì đa số đột biến trong UTHM chỉ tìm thấy ở gen H-ras mà rất ít khi ở gen K-ras
và N-ras(9)
Gen H-ras nằm trên nhiễm sắc thể 11, chứa 4
exon mã hóa protein p21 (p21ras)(10) Nghiên cứu
này chỉ phân tích exon 1 và exon 2 của gen H-ras,
vì đây là những exon dễ bị đột biến nhất, có nhiều điểm nóng đột biến như codon 12 và 13 trên exon 1 (vùng gắn GTP), codon 61 (vùng GTPase) trên exon 2(8,9,10) Đột biến tại những vị trí này khiến cho protein luôn ở trạng thái được hoạt hóa (đột biến tăng chức năng) Kết quả
nghiên cứu cũng tìm thấy đột biến H-ras tại
codon 12 và 13 Trong nghiên cứu của Sathyan (2007)(9), đa số đột biến H-ras tại codon 12 (63%),
tiếp theo là codon 13 (32%), codon 61 (5%)
Gen p53 nằm trên nhiễm sắc thể 17 Việc giải trình tự gen p53 để tìm đột biến phức tạp hơn, mất nhiều thời gian hơn gen H-ras, vì gen
p53 dài hơn (11 exon), thường phải khảo sát 4
exon từ exon 5 đến 8 là nơi tập trung đa số (87%) đột biến(2)
Tỉ lệ đột biến gen p53 và H-ras
Đột biến gen p53 ít xảy ra trong UTHM liên
quan thói quen nhai trầu, do thường có tỉ lệ tương đối thấp ở nhiều nước châu Á phổ biến thói quen nhai trầu như Ấn Độ (17-21%), Myanmar (17,5%), Papua New Guinea (10%), Đài Loan (5,4%)(2,3,6) Tuy nhiên, chúng tôi đã
phát hiện đột biến gen p53 trong UTHM với tỉ lệ
tương đối cao 44,4% mặc dù trong mẫu nghiên cứu này cũng có 38,9% bệnh nhân có thói quen nhai trầu Tỉ lệ này gần tương tự tỉ lệ đột biến
gen p53 khá cao ở Nhật Bản (63%), Mỹ (53%),
Pháp (67%) - nơi mà hút thuốc và uống rượu được xem là những yếu tố nguy cơ chính(1,2,7)
Ngược lại, đột biến gen H-ras thường gặp trong UTHM ở người nhai trầu Đột biến gen
Trang 5H-ras chiếm tỉ lệ 12,5-35% ở Ấn Độ, và liên quan
với thói quen nhai trầu(4,8,9), nhưng lại có tỉ lệ
thấp 0-5% ở Anh, Nhật, Mỹ(7,9) Nghiên cứu này
phát hiện tỉ lệ đột biến gen H-ras trong UTHM là
16,7%, và tất cả các ca đột biến đều có thói quen
nhai trầu
Sự thay đổi nhiều về tỉ lệ đột biến gen p53
và ras trong UTHM giữa các nước chủ yếu do
sự khác biệt về thói quen nguy cơ(1,10) Ngoài
ra, có thể do sự khác nhau về kỹ thuật phát
hiện, vị trí ung thư, chế độ dinh dưỡng, tình
trạng răng miệng
Tỉ lệ tương đối cao 38,9% không có đột biến
gen p53 và gen H-ras gợi ý UTHM còn do sự
biến đổi của những gen và protein khác trong tế
bào (như MDM2) hay do virus sinh ung thư
(như virus gây bướu nhú ở người HPV)
Trong UTHM, tỉ lệ đột biến gen p53 (44,4%)
cao hơn tỉ lệ đột biến gen H-ras (16,7%) Nhìn
chung, đột biến gen đè nén bướu p53 và
oncogen H-ras tương đối phổ biến trong UTHM
ở người Việt Nam
Kiểu đột biến gen p53 và H-ras
Đa số đột biến trên gen p53 và trên gen H-ras
là đột biến điểm
Đột biến trên gen p53 thường gặp đột biến
sai nghĩa (87,5%) sản xuất protein p53 bị mất
chức năng Trong khi trên gen H-ras, thường gặp
đột biến im lặng (62,5%) hơn đột biến sai nghĩa
(25%) và đột biến thêm vào (12,5%) Tuy nhiên,
nếu xét riêng đột biến làm thay đổi protein, đa
số đột biến H-ras vẫn là đột biến sai nghĩa
(66,7%)
Theo y văn(2), nitrosamin trong thuốc lá nhai
có thể alkylat hóa DNA ở vị trí nucleotid guanin
(G) và thymin (T) dẫn tới chuyển vị G:C>A:T
Benzopyren trong khói thuốc lá có thể gây đột
biến chuyển dạng G:C>T:A Trong nghiên cứu
này, đột biến chuyển vị (G:C>A:T) và đột biến
chuyển dạng (như G:C>C:G) đều gặp trong đột
biến gen p53 cũng như gen H-ras Trong 2 ca đột
biến sai nghĩa trên gen H-ras, một ca nhai trầu
kèm xỉa thuốc có đột biến dạng chuyển vị
G:C>A:T Tất cả 5 đột biến im lặng hay đa hình nucleotid đơn (SNP) C81T giống nhau trên gen
H-ras đều ở những bệnh nhân thường sử dụng
thuốc lá (gồm 4 ca nhai trầu-xỉa thuốc và 1 ca hút thuốc), và cũng đều có đột biến chuyển vị (C:G>T:A) Kết quả phù hợp với y văn, cho thấy khả năng N-nitrosamin trong thuốc lá nhai hay
xỉa gây đột biến gen H-ras
Đột biến gen H-ras và lâm sàng UTHM
Đa số các nghiên cứu cho rằng đột biến gen
p53 không liên quan với tuổi, giới tính, giai đoạn
TNM, thói quen hút thuốc, nhai trầu; tuy nhiên
cũng có nghiên cứu tìm thấy đột biến gen p53
liên quan với tiên lượng xấu(2,3,6)
Các ca đột biến gen H-ras đều xảy ra ở nữ, có
thói quen nhai trầu, vị trí ung thư ở niêm mạc
má và nướu răng, ung thư ở giai đoạn trễ, bướu
có độ ác tính mô học thấp Trong nghiên cứu của Sathyan trên 152 ca UTHM ở Ấn Độ (2007)(9), đột
biến H-ras liên quan có ý nghĩa với giới tính nữ
nhiều hơn nam, diễn tiến không tái phát, tiên lượng tốt; nhưng không liên quan với di căn hạch, kích thước bướu, độ ác tính mô học, giai đoạn bệnh
KẾT LUẬN
Nghiên cứu đã phát hiện tỉ lệ tương đối cao
đột biến gen p53 (44,4%) và H-ras (16,7%) Như vậy, đột biến gen p53 và H-ras thường hiện diện
trong UTHM ở người Việt Nam Không chỉ đột
biến bất hoạt gen đè nén bướu p53, đột biến hoạt hóa oncogen H-ras đều có thể góp phần trong
quá trình sinh ung thư ở hốc miệng
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1 Chitra G., Chandramouli A., Chanchal C (2010) “P53 mutations in head and neck squamous cell carcinoma” Int J
Pharm Biomed Res 1(3) pp 117-121
2 Greenblatt M.S., Bennett W.P., Hollstein M., Harris C.C (1994) “Mutations in the p53 tumor suppressor gene: Clue to cancer etiology and molecular pathogenesis” Cancer Research 54 pp 4855-4878
3 Hsieh L.L., Wang P.F., Chen I.H., Liao C.T., Chen C.M., Chang C.J.T (2001) “Characteristics of mutations in the p53 gene in oral squamous cell carcinoma associated with betael quid chewing and cigarette smoking in Taiwaneses”
Carcinogenesis 22(9) pp 1497-1503
4 Munirajan A.K., Mohanprasad B.K.C., Shanmugam G., Tsuchida N (1998) “Detection of a rare point mutation at
Trang 6codon 59 and relatively high incidence of H-ras mutation in
Indian oral cancer” Int J Oncol 13 pp 971-974
5 Murugan A.K., Hong N.T., Fukui Y., Munirajan A.K.,
Tsuchida N (2008) “Oncogenic mutations of the PIK3CA
gene in head and neck squamous cell carcinomas” Int J
Oncol 32 pp 101-111
6 Nguyễn Thị Hồng, Phạm Hùng Vân, và cộng sự (2002) “Đột
biến gen p53 trong ung thư miệng: phát hiện qua kỹ thuật
PCR-SSCP” Tạp chí Y học Tp.HCM 4(6) Trang 52-57
7 Sakai E., Rikimaru K., Ueda M., Matsumoto Y., Ishii N.,
Enomoto S., Yamamoto H and Tsuchida N (1992) “The p53
tumor-suppressor gene and ras oncogene mutations in oral
squamous-cell carcinoma” Int J Cancer 52 pp 867-872
8 Saranath D., Chang S.E., Bhoite L.T., Panchal R.G., Kerr I.B, Mehta A.R., Johnson N.W., Deo M.G (1991) “High frequency
of mutation in codon 12 and 61 of H-ras oncogene in chewing tobacco-related human oral carcinoma of India” Br J Cancer
63 pp 573-578
9 Sathyan K.M., Nalinikumari K.R., Kannan S (2007) “H-Ras mutation modulates the expression of major cell cycle regulatory proteins and disease prognosis in oral carcinoma” Modern Pathol 20 pp 1141-1148
10 Süzen S., Parry J.M (2001) “Analysis of ras gene mutation in
human oral tumours by polymerase chain reaction and direct
sequencing” Turk J Med Sci 31 pp 217-223