Đề tài: Khảo sát một số yếu tố tổng hợp polymer đóng dấu phân tử salbutamol định hướng ứng dụng làm pha tĩnh trong kỹ thuật chiết tách pha rắn tách salbutamol có tính chọn lọc được tiến hành nhằm góp phần phát triển thêm những phương pháp kiểm nghiệm thực phẩm, mỹ phẩm rẻ tiền nhưng hiệu quả.
Trang 1KHẢO SÁT MỘT SỐ YẾU TỐ TỔNG HỢP POLYMER
ĐÓNG DẤU PHÂN TỬ SALBUTAMOL - ĐỊNH HƯỚNG ỨNG DỤNG LÀM PHA TĨNH TRONG KỸ THUẬT
CHIẾT PHA RẮN CÓ TÍNH CHỌN LỌC CAO
Nguyễn Thanh Trà*, Phan Văn Hồ Nam*
TÓM TẮT
Mở đầu: C{c phương ph{p định lượng salbutamol trong thịt heo như HPLC-MS/MS thì đắt và phải sử
dụng chất chuẩn đồng vị Polymer đóng dấu phân tử salbutamol là một giải ph{p đơn giản hóa quy trình phân tích salbutamol trong những mẫu phức tạp Do đó, đề tài: "Khảo sát một số yếu tố tổng hợp polymer đóng dấu phân tử salbutamol định hướng ứng dụng l|m pha tĩnh trong kỹ thuật chiết tách pha rắn tách salbutamol có tính chọn lọc" được tiến hành nhằm góp phần phát triển thêm những phương ph{p kiểm nghiệm thực phẩm, mỹ phẩm
rẻ tiền nhưng hiệu quả
Mục tiêu: Tổng hợp polymer đóng dấu phân tử salbutamol (Salbutamol-MIP) theo phương ph{p kết tủa
trong dung môi Khảo sát khả năng lưu giữ thuận nghịch của salbutamol-MIP để tìm ra các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng t{ch salbutamol
Đối tượng: Salbutamol-MIP có khả năng lưu giữ salbutamol thuận nghịch
Phương pháp nghiên cứu: Tổng hợp các hạt Salbutamol-MIP bằng phương ph{p kết tủa trong lượng lớn
dung môi Nhồi cột SPE Khảo sát khả năng lưu giữ salbutamol của Salbutamol-MISPE bằng phương ph{p quang phổ UV-Vis và quang phổ huỳnh quang
Kết quả: Salbutamol-MIP được tổng hợp th|nh công có kích thước nano có khả năng lưu giữ salbutamol
gấp 2,48 lần so với polymer không đóng dấu (81,00% so với 32,65%)
Kết luận: Salbutamol-MIP kích thước nano với khả năng lưu trữ salbutamol thuận nghịch lần đầu tiên
được tổng hợp bằng phương ph{p kết tủa trong lượng lớn dung môi, định hướng để ứng dụng làm vật liệu hấp
phụ có tính chọn lọc trong kỹ thuật chiết pha rắn v| c{c thước pháp sắc ký khác ở Vietnam
Từ khóa: Polymer đóng dấu ph}n tử salbutamol, chiết pha rắn chọn lọc
ABSTRACT
INVESTIGATING SYNTHETIC FACTORS OF SALBUTAMOL-IMPRINTED POLYMER,
DIRECTED TO APPLY AS THE SORBENT FOR SELECTIVE SOLID-PHASE EXTRACTION
Nguyen Thanh Tra, Phan Van Ho Nam
* Y Hoc TP Ho Chi Minh * Supplement Vol 22 - No 1- 2018: 210 - 215
Introduction: Determination of salbutamol in pork by HPLC-MS/MS is expensive and complex because of
using isotopic standard Salbutamol imprinted polymer could be applied for simplifying analysis procedures of salbutamol in complicated samples Thus, the topic “Investigating synthetic factors of salbutamol-imprinted polymer, directed to apply as the sorbent for selective solid-phase extraction” was realized for contributing the development of cheap and effective quality control method of food and medicine
Objectives: Synthesis of salbutamol-imprinted polymer (salbutamol-MIP) particles by precipitation
*Khoa Dược, Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh
Trang 2polymerization in large solvent Investigating the ability of salbutamol-MIP in retaining salbutamol reversibly in order to find out the factors affecting their separation
Subjects: Salbutamol-MIP with ability of reversibly retaining salbutamol
Study methods: Synthesis of salbutamol-imprinted polymer (salbutamol-MIP) particles by precipitation
polymerization in large solvent Packaging salbutamol-MIP into SPE column Investigations were carried out to find out the polymer having the ability of retaining high Salbutamol content via UV-Vis and fluorescence spectroscopies
Results: Salbutamol-MIP in nano size was successfully synthesized with capable of storing salbutamol 2.48
times higher than non-imprinted polymer (81.00% compared to 32.65%)
Conclusions: Salbutamol-MIP in nano size with reversibly holding caffeine effect was firstly synthesized by
precipitation polymerization directed to apply to selective solid-phase extraction and other chromatography methods in Vietnam
Keywords: Salbutamol-imprinted polymer, selective solid-phase extraction
ĐẶT VẤN ĐỀ
Salbutamol là chất chủ vận beta (β – agonist)
được dùng trong y kho để điều trị một số bệnh
liên qu n đến co thắt đường hô hấp Ngoài ra,
nó còn được sử dụng trong chăn nu i như l| một
chất tạo nạc nhằm tăng lợi nhuận Tuy nhiên,
salbutamol tồn dư trong thực phẩm có khả năng
tích lũy lại trong gan, thận, mỡ, võng mạc và gây
suy giảm chức năng g n, ảnh hưởng sức khỏe
người tiêu dùng Chính vì vậy, nhu cầu về kiểm
tra chất lượng thực phẩm hay kiểm nghiệm salbutamol trong thực phẩm là vô cùng thiết yếu(3) Những phương ph{p được sử dụng để định lượng salbutamol trong thịt heo được sử dụng điển hình như HPLC-MS/MS thì đắt và cần phải có chất chuẩn đồng vị (theo TCCS: H.HD.QT.110 Ref: USDA CLG-AGON1.0 của Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm quốc gia)(1)
Hình 1: Kỹ thuật đóng dấu phân thử
Polymer đóng dấu phân tử salbutamol
(salbutamol-MIP) là một giải ph{p đơn giản hóa
quy trình phân tích salbutamol trong những
mẫu phức tạp(5) Kỹ thuật đóng dấu phân tử là
một kỹ thuật được dùng để thiết kế nhân tạo
một thụ thể có tính chọn lọc v| độ đặc đặc hiệu
cao với một chất ph}n tích được chọn trước đó
MIP được tạo thành trong quá trình polymer hóa
có sự hiện diện chất ph}n tích được chọn trước
đó v| s u đó chất ph}n tích n|y được rửa giải để loại bỏ khỏi polymer và bộc lộ những lỗ trống có khả năng t{i hấp phụ chất phân tích nhờ sự phù hợp về cấu trúc không gian và các liên kết hydro, van der waals, ion (Hình 1) Bằng cách này
Trang 3polymer sẽ sở hữu các yếu tố nhận biết phân tử
mạnh mẽ như c{c thụ thể sinh học tự nhiên, ví
dụ: kháng thể và thụ thể sinh học(2,4) MIP có các
ưu điểm bền về vật lý, ổn định hóa học, dễ tổng
hợp và giá thành rẻ nên là một vật liệu đầy hứa
hẹn ứng dụng trong kỹ thuật chiết pha rắn(5) Do
đó, đề t|i n|y được tiến hành nhằm góp phần
phát triển thêm những phương ph{p kiểm soát
chất kích thích tăng trọng trong chăn nu i, sản
xuất rẻ tiền nhưng hiệu quả - cụ thể là ứng dụng
MIP trong chiết tách chọn lọc và làm giàu
salbutamol
ĐỐI TƯỢNG – PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Đối tượng nghiên cứu
Salbutamol-MIP tổng hợp bằng phương
pháp kết tủa trong dung môi
Chất đối chiếu
Salbutamol sulfat chuẩn, số lô: QT105 070317
H|m lượng 99,7% Viện Kiểm nghiệm TP.HCM
Hóa chất – dung môi
Vinyl pyrrolidon (VP), acid methacrylic
(MAA), acid acrylic (AA), ethylene glycol
dimethacrylate (EDMA), azobisisobutyronitrile
AI N được sản xuất bởi Sigma-Aldrich
Methanol, acid acetic, cloroform xuất xứ Trung
Quốc Methanol, acid acetic dành cho sắc ký lỏng
do Merck sản xuất
Trang thiết bị
Máy cô quay chân không R-210S Bucchi - Thụy Sĩ, bếp cách thủy Memmert WB-14 - Đức,
tủ sấy Memmert WM 500 CO - Đức, bể siêu âm Elma T840 DH - Đức, c}n điện tử phân tích
HR-200 A&D - Nhật, Máy quang phổ Shimadzu
UV-2450 - Nhật, máy quang phổ huỳnh quang
F-7000 Flourescence Spectrophotometry Hitachi - Nhật, máy khuấy từ gia nhiệt IKA - Đức, kính hiển vi Olympus CH2 - Nhật, SPE Manifold Waters - Mỹ
Phương pháp nghiên cứu
Tổng hợp polymer đóng dấu phân tử salbutamol (salbutamol-imprinted polymer - salbtamol-MIP) và polymer trắng (non-imprinted polymer - NIP)
Quy trình tổng hợp salbutamol-MIP bằng phương ph{p kết tủa: Cho monomer, cross – linker, chất mồi và phân tử mẫu hòa tan hoàn toàn trong dung môi Tạo hỗn hợp tiền polymer hóa bằng cách ủ hỗn hợp ở nhiệt độ phòng trong vòng 24 giờ Tiến hành polymer hóa bằng c{ch đun v| khuấy từ ở 60 oC trong vòng 8 giờ Tiến hành tổng hợp polymer đóng dấu phân tử salbutamol theo những công thức
được trình bày ở Bảng 1 Tổng hợp polymer
trắng (non-imprinted polymer – NIP tương tự như MIP, tuy nhiên trong công thức tổng hợp không có thành phần phân tử mẫu, được dùng
để so s{nh đối chiếu với MIP
Bảng 1: Thành phần các công thức salbutamol-MIP
STT Tên công
thức
Monomer(mg) Cross linke
(mg)
Chất mồi (µl) Phân tử mẫu (mg) Dung môi
polymer hóa (ml)
AA MAA VP EGDMA AIBN 12% Salbutamol
sulfat Salbutamol Methanol Chloroform Acetonitril
Trang 4Khảo sát sự lưu giữ salbutamol của
Salbutamol-MIP
Các polymer sau khi tổng hợp ở dạng hạt
n no được kiểm tr kích thước bằng cách quan
s{t dưới kính hiển vi có độ phóng đại 100 lần
S u đó hạt được rửa sạch salbutamol, nhồi cột
SPE, tiến hành tái hấp thu salbutamol và rửa giải
để kiểm tr đặc tính lưu giữ salbutamol Dịch
thu được sau khi rửa giải được định lượng bằng
phương ph{p qu ng phổ UV – Vis tại bước sóng
278 nm v| phương ph{p qu ng phổ huỳnh
quang với bước sóng kích thích 230 nm - bước
sóng phát xạ 305 nm
Nhồi hạt vào cột SPE: hạt tạo r được đem
nhồi ướt dưới áp suất giảm vào vỏ một xy lanh
nhự PE đã đệm sẵn miếng xốp PTFE 10 µm và
giấy lọc RC 0,45 µm
Rửa cột với dung môi: cho dung môi qua cột
Kiểm tra sự tồn dư của monomer và salbutamol
trong dịch rửa bằng phương ph{p qu ng phổ
UV-Vis: thu mỗi 10 ml đem quét phổ UV trong
vùng 250 nm đến 400 nm đến khi dịch rửa
không còn hấp thu trong vùng này nữa
Quá trình tái hấp thu gồm 3 gi i đoạn Thứ
nhất là nạp mẫu: cho 1 ml dung dịch phân tử
mẫu (1 mg/ml) qua cột, hứng dịch thừa qua cột
v|o bình định mức 10 ml, điền đầy đến vạch
bằng meth nol để thu được dịch thừa (1) Thứ 2
là rửa cột: cho dung môi rửa qua cột, hứng mỗi
10 ml dịch rửa riêng rẽ, quét phổ UV trong vùng
250 đến 400 nm, đến khi dịch hứng không còn
hấp thu nữa Gộp các dịch có hấp thu lại với
nh u để thu được dịch rửa (2) Thứ 3 là rửa giải
salbutamol sulfat: rửa giải salbutamol sulfat
bằng 10 ml methanol – acid acetic (8:2), thu dịch
rửa giải (3)
Tiến h|nh tính to{n lượng phân tử mẫu thu
được trong dịch thừa (1), dịch rửa (2) và dịch rửa
giải 3 Lượng phân tử mẫu lưu giữ lại cột được
tính bằng phần trăm lượng phân tử mẫu trong
dịch rửa giải thu được so với lượng phân tử mẫu
được nạp vào cột lúc b n đầu
KẾT QUẢ Tổng hợp polymer đóng dấu phân tử salbutamol (salbutamol-imprinted polymer - salbtamol-MIP) và polymer trắng (non-imprinted polymer - NIP)
Hạt polymer thu được hình 2 có kích thước khoảng 800-1000nm khi qu n s{t dưới kính hiển
vi có độ phóng đại 100 lần
Hình 2: Hạt polymer thu được quan sát bằng kính
hiển vi có độ phóng đại 100x
Khảo sát sự lưu giữ salbutamol của Sa lbutamol-MIP:
Lượng salbutamol trong dịch dư (1), dịch rửa
(2), dịch rửa giải (3) v| % lưu giữ salbutamol của
cột được trình bày trong Bảng 2
Kết quả là không có sự khác nhau về sự lưu giữ ở các cặp MIP v| NIP Như vậy tất cả các cột đều kh ng lưu giữ salbutamol Dự đo{n khi sử dụng salbutamol ở dạng sulf t để tổng hợp, trong phân tử salbutamol sulfat có H+ đã ngăn cản sự hình thành liên kết hydro giữa salbutamol và monomer nên không có lỗ liên kết đặc hiệu được tạo ra
Trang 5Bảng 2: Lượng salbutamol trong dịch thừa (1), dịch rửa (2), dịch rửa giải (3) v| % lưu giữ salbutamol của cột (S:
salbutamol; SS: salbutamol sulfat)
Công thức
Lượng
mẫu nạp
cột 1mg
Dịch thừa (1)
Dịch rửa (2) Dịch rửa giải
(3) Tổng lượng
thu hồi (g) Thu hồi (%) Lưu giữ
(%)
Phương pháp định lượng MeOH aceton MeOH – acid
acetic (8:2)
UV
Huỳnh quang
BÀN LUẬN
Để loại bỏ ảnh hưởng của H+, tiến hành tổng
hợp polymer MAA sử dụng salbutamol dạng tự
do - công thức VI (MAA-chlor , đem t{i hấp thu
với salbutamol và salbutamol sulfat, kết quả vẫn
chư có sự lưu giữ salbutamol sulfat hay
salbutamol ở cả hai loại polymer MIP và NIP
lưu giữ 0% ở cả hai loại Tuy nhiên, lượng dung
m i để rửa và rửa giải thì có sự khác biệt Lượng
dung môi dùng rửa salbutamol liên kết không
đặc hiệu ra khỏi cột nhiều hơn so với khi tái hấp
thu salbutamol sulfat (7,5 lần) Từ đó, có thể thấy
H+ trong salbutamol sulfat có ảnh hưởng đến sự
tạo liên kết đặc hiệu giữa polymer và phân tử
mẫu Cụ thể H+ ngăn cản sự tạo thành liên kết
đặc hiệu giữa phân tử mẫu và polymer
Giải thích cho việc dù đã loại H+ trong quá
trình tổng hợp, tức đã phải có liên kết đặc hiệu
được tạo r nhưng vẫn không có sự lưu giữ
salbutamol lại trong cột (dịch rửa giải không có
salbutamol), có hai giả thuyết: Thứ 1: Số liên kết
đặc hiệu tạo ra quá ít Thứ 2: Dung môi methanol
(dung môi rử đã đủ mạnh để bẻ gãy hết tất cả
liên kết đặc hiệu được tạo ra
Do đó, tiến hành tái hấp thu salbutamol với cột được nhồi polymer công thức VI (MAA-chlor) Khi tiến hành tái hấp thu với salbutamol,
sử dụng hệ dung môi rửa và rửa giải vẫn là methanol và methanol – acid acetic (8:2), phát hiện bằng huỳnh quang, kết quả là có sự khác biệt giữa VI chlor)-MIP và VI (MAA-chlor)-NIP, nhưng kh ng nhiều, sự lưu giữ lần lượt là 3,00% và 2,00% Khi tiến hành tái hấp thu với salbutamol, sử dụng hệ dung môi rửa và rửa giải là aceton và methanol - acid acetic (8:2), phát hiện bằng huỳnh quang Kết quả là có sự khác biệt rõ về sự lưu giữ của VI (MAA-chlor)-MIP (81,00%) và VI (MAA-chlor)-NIP (32,65%) Như vậy, polymer đóng dấu phân tử tổng hợp từ công thức IV (MAA-chlor đã tạo được liên kết đặc hiệu với salbutamol Và cặp dung môi rửa giải là aceton và methanol – acid acetic (8:2) giúp phân biệt được mức độ lưu giữ salbutamol của công thức này Salbutamol-MIP của công thức VI này có khả năng lưu giữ salbutamol gấp 2,48 lần so với NIP (81,00% so với 32,65%) Công thức VI cũng có khả năng lưu giữ gấp khoảng 2 lần so với các công thức khác, vì hệ dung môi methanol - acid acetic
Trang 6(8:2) chỉ rửa giải được lần lượt 54,33% và
55,13% lượng salbutamol tái hấp thu đối với
MIP và NIP khi so với các công thức khác luôn
bị rửa giải trên dưới 100%
KẾT LUẬN
Đề t|i đã tổng hợp được salbutamol-MIP
có khả năng lưu giữ salbutamol, bên cạnh đó
cũng lần đầu tiên tổng hợp thành công vật liệu
ph tĩnh cho SPE với kích thước hạt hàng
n no Đ}y l| bước đầu tiên cơ sở cho sự
nghiên cứu và phát triển củ phương ph{p
đóng dấu phân tử để ứng dụng vào các
phương ph{p ph}n tích như chiết pha rắn hay
sắc ký, một lĩnh vực mà hiện nay Việt Nam
chư được nghiên cứu và phát triển
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1 Cục Quản lý Chất lượng Nông lâm sản và thủy sản (2014) Thực
Phẩm - X{c Định Dư Lượng β – Agonist Trong Thịt Gia Súc –
Phương Ph{p Sắc Ký Lỏng Ghép Hai Lần Khối Phổ Hà Nội, Bộ Khoa học và Công nghệ 2014 1 - 13
2 Lieberzeit PA, Findeisen A, Mähner J, Samardzic R, Pitkänen J, Anttalainen O, Dickert FL (2010) Artificial receptor layers for
detecting chemical and biological threats Procedia Engineering
5(Supplement C):381-384
3 Nguyễn Thị Thu Thủy (2011) Khảo s{t dư lượng bê ta-Agonist (Clenbuterol và salbutamol) trong thịt gà và thịt heo trên thị trường thành phố Cần Thơ Luận án tiến sĩ Đại học Y Dược Cần Thơ TP Cần Thơ
4 Phan N, Sussitz H, Lieberzeit (2014) Polymerization Parameters Influencing the QCM Response Characteristics of
BSA MIP Biosensors 4(2):161-171
5 Qiao F, Sun H, Yan H, Row KH (2006) Molecularly Imprinted
Polymers for Solid Phase Extraction Chromatographia
64(11-12):625-634
Ngày nhận bài báo: 18/10/2017 Ngày phản biện nhận xét bài báo: 01/11/2017 Ng|y b|i b{o được đăng: 15/03/2018